Лекция: Оксидоредуктазы

Полифенолоксидаза (Н.Ф.1.14.18.1). Этот фермент известен под раз­личными тривиальными названиями: о-дифенолокеидаза, тирозиназа, фенолаза, катехолаза и др. Фермент может катализировать окисление моно-, ди-, и полифенолов.

Типичная реакция, катализируемая полифенолоксидазой, имеет вид:

Молекула фермента обладает четвертичной структурой и имеет мо­лекулярную массу около 34 000 Да. Полифенолоксидаза — купропроте-ид. Содержание меди — 0,2%, или один атом Сu на 1 молекулу фермента. Зона оптимальной активности лежит между рН 5,0—7,0.

В зависимости от того, из какого источника выделен фермент, спо­собность его к окислению различных фенолов различна. Более того, даже в одном и том же объекте полифенолоксидаза может содержаться в виде различных молекулярных форм, отличающихся по способности к окис­лению различных фенолов.

С действием этого фермента связано образование темноокрашенных соединений — меланинов при окислении кислородом воздуха аминокис­лоты — тирозина. Потемнение срезов картофеля, яблок, грибов, перси­ков и других растительных тканей в большей степени или полностью за­висит от действия полифенолоксидазы. В пищевой промышленности основной интерес к этому ферменту сосредоточен на предотвращении рассмотренного нами ферментативного потемнения, которое имеет ме-

сто при сушке плодов и овощей, а также при производстве макаронных изделий из муки с повышенной активностью полифенолоксидазы. Эта цель может быть достигнута путем тепловой инактивации фермента (бланшировка), добавлением ингибиторов (NaHSO3, SO2, NaCl) или свя­зыванием субстрата посредством метилирования.

Положительная роль фермента проявляется при некоторых фермента­тивных процессах: например, при ферментации чая. Окисление дубиль­ных веществ чая под действием полифенолоксидазы приводит к образо­ванию темноокрашенных и ароматических соединений, которые опре­деляют цвет и аромат черного чая.

Каталаза (Н.Ф.1.11.1.6). Этот фермент катализирует разложение пе-роксида водорода в соответствии со следующей реакцией:

Таким образом, фермент окисляет одну молекулу перекиси водорода до кислорода с одновременным восстановлением другой молекулы пе­рекиси водорода до Н2О.

Каталаза относится к группе гемопротеиновых ферментов. Содержит 0,009% железа в виде геминовой группировки или 4 атома на одну моле­кулу фермента. Молекулярная масса ферментов, выделенных из различ­ных объектов (дрожжей, растительных и животных тканей, микроорга­низмов), лежит в пределах от 225 000 до 250 000 Да. Они имеют суще­ственные различия в оптимуме рН (от 2 до 9), в термо- и рН-стабильно-сти. Фермент ингибируется цианидом (обратимо), фенолами (обратимо лишь в слабой форме), щелочью и мочевиной (необратимо). Функцией каталазы в живом организме является защита клетки от губительного дей­ствия перекиси водорода.

Хорошим источником для получения промышленных препаратов ка­талазы являются культуры микроорганизмов и печень крупного рогато­го скота.

Каталаза находит свое применение в пищевой промышленности при удалении избытка Н2О2 при обработке молока в сыроделии, где после­дняя используется в качестве консерванта; а также совместно с глюкозо-оксидазой применяется для удаления кислорода и следов глюкозы.

Пероксидаза (Н.Ф. 1.11.1.7). Пероксидазы могут быть определены как ферменты, катализирующие следующую реакцию:

Пероксидаза — двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание гема и гликопротеида. Показано, что углеводная часть прида-

ет белку большую специфичность; предполагают, что углеводы стабили­зируют трехмерную структуру фермента

В настоящее время выделено и охарактеризовано большое число мно­жественных форм фермента и доказано существование изоферментов, то есть тех форм ферментов, которые обусловлены генетически. В связи с этим принято говорить о целой системе пероксидаз, работающих в лю­бом живом организме. Интересным представляется факт широкой суб­стратной специфичности пероксидаз по отношению к донорам водоро­да (1-й субстрат), ими могут служить фенолы, амины, другие органичес­кие соединения; и строгой специфичности по отношению к акцептору водорода (2-й субстрат) — перекиси водорода. Механизм реакции, пред­положительно, основан на образовании комплексов фермент—донор и двух одновалентных ступеней окисления, как это отражает следующая схема:

Пероксидаза + Н2О2 = Комплекс I

Комплекс I + АН2 = Комплекс II + АН Комплекс II + АН = Пероксидаза + А

Изучению пероксидазы были посвящены классические работы Г. Тео-реля, Б. Чанса, А. Н. Баха, Р. Шода. Наиболее активная пероксидаза вы­делена из корней хрена. Ее молекулярная масса равна примерно 40 000 Да, изоэлектрическая точка 7,2. Фермент содержит один атом железа на мо­лекулу. Он достаточно устойчив в растворах при величинах рН от 4 до 12; его термостабильность значительно выше термостабильности каталазы. Оптимум рН для пероксидазы хрена равен 7; при рН от 6 до 8 сохраняет­ся 70% его активности.

Липоксигеназа (Н.Ф.1.13.11.12). Этот фермент катализирует окисле­ние полиненасыщенных высокомолекулярных жирных кислот (линоле-вой и линоленовой) кислородом воздуха с образованием высокотоксич­ных гидроперекисей. Ниже приведена реакция, катализируемая этим фер­ментом:

Однако основное количество жирных кислот превращаются в гидро­перекиси, обладающие сильными окислительными свойствами, и имен-

но на этом основано использование липоксигеназы в пищевой промыш­ленности.

Липоксигеназа впервые была выделена из семян сои в 1928 г. После­дующие исследования показали, что липоксигеназа широко распрост­ранена и в других растительных объектах: пшенице и других злаках, в семенах масличных и бобовых культур, в картофеле, баклажанах и т. д.

Тем не менее самым богатым источником фермента является мука соевых бобов. Липоксигеназа, полученная в кристаллическом состоянии из семян сои, имеет молекулярную массу 102 000 Да, изоэлектрическую точку 5,4. Оптимумы рН для ферментов, выделенных из различных объек­тов, сильно различаются. Оптимум температуры липоксигеназы находит­ся между 20 и 30°С.

В зерне пшеницы активность липоксигеназы колеблется в значитель­ных пределах и является сортовым признаком. Кроме того, активность липоксигеназы связана с показателем жизнеспособности зерна. Она за­кономерно снижается со снижением всхожести зерна и может быть био­химическим тестом жизнеспособности семян. Значительная часть липок­сигеназы пшеницы прочно связана с клейковинными белками и осво­бождается при обработке клейковинного комплекса раствором восста­новленного глутатиона.

Липоксигеназе принадлежит важная роль в процессах созревания пшеничной муки, связанных с улучшением ее хлебопекарных досто­инств. Образующиеся под действием фермента продукты окисления жирных кислот способны вызывать сопряженное окисление ряда дру­гих компонентов муки (пигментов, SH-групп клейковинных белков, ферментов и др.). При этом происходит осветление муки, укрепление клейковины, снижение активности протеолитических ферментов и дру­гие положительные изменения.

В разных странах разработаны и запатентованы способы улучшения качества хлеба, основанные на использовании препаратов липоксигена­зы (главным образом, липоксигеназы соевой муки). Все они требуют очень точного дозирования фермента, так как даже небольшая передо­зировка приводит к резко отрицательному эффекту и вместо улучшения качества хлеба происходит его ухудшение.

Более мягкий способ воздействия на компоненты муки и теста свя­зан с активацией собственной липоксигеназы муки путем некоторого варьирования технологического процесса. При этом исключается эф­фект передозировки фермента со всем комплексом нежелательных по­следствий.

Использование липоксигеназы как улучшителя окислительного дей­ствия требует определенной осторожности, так как хорошо известна ток­сичность переокисленных жиров. Интенсивное окисление липоксиге-

назой свободных жирных кислот может сопровождаться вторичными процессами образования веществ различной химической природы с не­приятным вкусом и запахом, характерным для прогорклого продукта. Тех­нологически приемлема ограниченная степень окисления полиненасы­щенных жирных кислот как промежуточного звена преобразования дру­гих компонентов биологического материала, не приводящая к накопле­нию фракции окисленных липидов.

Глюкозооксидаза (Н.Ф. 1.1.3.4). Этот фермент был впервые выделен еще в 1904 г. Н. А. Максимовым из плесневых грибов. Фермент представляет собой флавопротеид, в котором белок соединен с двумя молекулами ФАД. Он окисляет глюкозу с образованием в конечном счете глюконовой кис­лоты и обладает практически абсолютной специфичностью по отноше­нию к глюкозе. Суммарное уравнение имеет следующий вид:

Представленный выше процесс на самом деле протекает в несколько стадий:

На первом этапе этой реакции происходит отнятие двух атомов водо­рода у первого углеродного атома глюкозы. При этом образуется восста­новленный флавиновый фермент и лактон глюконовой кислоты. Далее восстановленный фермент реагирует с кислородом воздуха, и образуется перекись водорода. Токсичная перекись водорода расщепляется катала-зой на кислород и воду, а β-D-глюконо-δ-лактон подвергается спонтан­ному расщеплению с присоединением воды, в результате чего образует­ся глюконовая кислота.

Высокоочищенные препараты глюкозооксидазы получают из плес­невых грибов рода Aspergillus и Penicillium. Они имеют примерно одина­ковую молекулярную массу — около 150 000 Да, изоэлектрическую точ­ку 4,2-4,3 и оптимум рН 5,6.

В последние годы глюкозооксидаза получила широкое применение. Благодаря исключительной специфичности препараты глюкозооксида-зы применяются как аналитическое средство для количественного опре­деления глюкозы.

Кроме этого, препараты глюкозооксидазы нашли применение в пи­щевой промышленности как для удаления следов глюкозы, так и для уда­ления следов кислорода. Первое — необходимо при обработке пищевых продуктов, качество и аромат которых ухудшаются из-за того, что в них содержатся восстанавливающие сахара; например, при получении из яиц сухого яичного порошка. Здесь имеется в виду реакция Майяра, т. к. глю­коза при сушке и хранении яичного порошка, особенно при повышен­ной температуре, легко вступает в реакцию с аминными группами ами­нокислот и белков. Порошок темнеет, и образуется ряд веществ с непри­ятным вкусом и запахом. Второе — необходимо при обработке продук­тов, в которых длительное присутствие небольших количеств кислорода приводит к изменению аромата и цвета (пиво, вино, фруктовые соки, майонез). Внесение пакетиков, содержащих смесь воды, глюкозы, фер­мента и буфера, способствует удалению кислорода из воздушного про­странства. Во всех подобных случаях в ферментную систему включают каталазу, разлагающую Н2О2, которая образуется при реакции глюкозы с кислородом. Этот метод нашел широкое применение в США для удале­ния кислорода из банок с сухим молочным порошком.