Лекция: Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции.

Концентрация субстрата является важнейшим фактором, определяющим скорость ферментативной реакции. Еще в 1902 г. В. Анри при изучении реакции ферментативного гидролиза сахарозы предположил, что фермент β-фруктофуранозидаза взаимодействует со своим субстратом, затем это

соединение распадается, фермент остается в первоначальном виде, а суб­страт сахароза оказывается расщепленной на глюкозу и фруктозу.

Это предложение было в дальнейшем развито Л. Михаэлисом и М. Ментен. В 1913 г. они постулировали следующие уравнения фермен­тативной реакции:

Исходя из закона действующих масс, можно записать следующее урав­нение:

В ходе ферментативной реакции в любой момент времени фермент существует в двух формах: свободной и связанной, т. е. в форме комп­лекса ES.

Скорость ферментативной реакции будет максимальной при такой концентрации субстрата, когда весь фермент перейдет в комплекс ES, т.е. когда все активные центры насыщены субстратом и дальнейшее уве­личение концентрации субстрата не приведет к увеличению скорости

реакции.

Преобразуя представленное выше уравнение, получим выражение, которое будет иметь следующий вид:

Это уравнение названо уравнением Михаэлиса—Ментен. Оно имеет огромное значение для выражения зависимости действия ферментов от концентрации субстрата. Однако оно содержит и ряд недостатков, в част­ности, при его выводе было сделано несколько допущений, например, не учитывалась вторая стадия ферментативной реакции — образование Е и Р.

В связи с этим был предложен ряд усовершенствованных уравнений, с учетом влияния образовавшихся продуктов реакции. В настоящее вре­мя наиболее широко используют уравнение Ходдейна-Бриггса. Оно име­ет следующий вид:

В этом уравнении вместо Ks — константы диссоциации комплекса ES, который присутствует в уравнении Михаэлиса—Ментен, стоит Кm — константа Михаэлиса (в числителе которой находятся константы скоро­стей реакций, ведущих к распаду комплекса ES в двух направлениях):

Для того, чтобы графическая зависимость, выражающая влияние кон­центрации субстрата на начальную скорость ферментативной реакции, из гиперболической преобразовалась в прямолинейную, что, очевидно, представляет большее удобство в экспериментальной практике, уравне­ние Холдейна—Бриггса было преобразовано Лайнуивером и Берком по методу двойных обратных величин.

Величина Кт — это ключевой кинетический параметр; если [S] = Кт, то V=Vmах/2, следовательно, константа Михаэлиса численно равна кон­центрации субстрата (в молях на литр), при которой скорость реакции рав­на половине максимальной.

Приблизительное значение Ктможно получить простым графичес­ким способом, как это показано на рис. 8.4 а; однако в этом способе до­статочно велика погрешность в нахождении Vmax. Значительно удобнее пользоваться прямолинейной зависимостью при обработке данных по методу двойных обратных величин, рис. 8.4 б. В этом случае можно по­лучить более точное значение Кт.

Источником множества недоразумений как в прошлом, так и в на­стоящем, является некорректное использование термина «константа Ми­хаэлиса» и двух символов КSи Кm для обозначения величин отнюдь не-идентичных, несмотря на совершенно четкие рекомендации Комиссии по ферментам Международного Биохимического Союза. Первая вели-

Чина — КS — константа равновесия, выражаемая отношением Ks= k-1/k+1,

характеризует сродство фермента к субстрату (или, иначе, прочность ком­плекса ES), причем существует обратная пропорциональность между ве­личиной Ksи сродством фермента к субстрату. Вторая величина — Кт — соответствует концентрации субстрата, при которой V= Уmax/ 2. Часто свой­ство Ksошибочно приписывают Кт. На самом деле Кт будет являться мерой сродства фермента к субстрату только в том единственном случае, когда величина k+2будет настолько мала, что Кт практически совпадет с Ks.

Многие ферменты катализируют реакции с участием двух субстра­тов. К так называемым бимолекулярным реакциям относятся реакции переноса химических группировок с одного соединения на другое, реак­ции синтеза, окислительно-восстановительные реакции.

Такие реакции могут протекать по двум различным механизмам. В реакциях первого типа, называемых реакциями единичного за­мещения, два субстрата А и В образуют с ферментом комплекс ЕАВ, который затем распадается с образованием продуктов реакции С и Д. Вто­рой тип двухсубстратных реакций протекает по механизму двойного замещения (механизм типа «пинг-понг»). В этих реакциях с актив­ным центром фермента в каждый момент времени связан только один из двух субстратов.

При исследовании кинетики бимолекулярных реакций концентрацию одного из субстратов оставляют постоянной (В), а второго — изменяют (А). В этом случае в координатах 1/V от 1/[А] можно получить «кажуще­еся» значение Кт. Истинное значение VтaxиКтBполучают при исследова­нии нескольких концентраций субстрата В. Точно так же поступают при определении КтА(когда концентрация А постоянна, а концентрация В варьируется). Ктпо отношению к различным субстратам в одной и той же реакции могут быть различными — это хорошо видно из следующего примера.

Реакция катализируемая алкогольдегидрогеназой:

Влияние концентрации фермента на скорость ферментативнойреакции.

Концентрация фермента оказывает существенное влияние на скорость ферментативной реакции. При насыщающей концентрации субстрата, обеспечивающей Vmaхначальная скорость ферментативной реакции бу-

дет, в первую очередь, зависеть от концентрации фермента. Эта зависимость прямопропорцио-нальная, что свидетельствует о том, что начальная скорость является мерой количества фермента. Гра­фически это представлено на рис. 8.5.

Рис.8.5. Влияние концентрации фермента [Е] на ско­рость ферментативной реакции (Vo)

Влияние температуры на активность ферментов.Общий вид кривой, ха­рактеризующей влияние температуры на активность фермента, можно представить в виде графика, изображенного на рис. 8.6.

Оптимальная температура, при ко­торой наблюдается максимальная ак­тивность, для большинства ферментов находится в пределах 37-50°С, но не­которые ферменты имеют температур­ный оптимум за пределами этой зоны.

Влияние температуры на актив­ность фермента, которое может быть легко изучено экспериментально, имеет очень сложный характер, так как обусловлено целым рядом факторов, а именно:

— влиянием температуры на скорость расщепления комплекса ES на свобод-

ный фермент и продукт реакции, т. е. на константу скорости реакции к+2;

—влиянием температуры на сродство фермента к субстрату, то есть на
константы k-1 иk+1;

—влиянием на теплоту ионизации, а, следовательно, на процессы иони­-
зации всех компонентов реакции: самого фермента, субстрата, про­-
межуточных и конечных продуктов реакции;

—влиянием на образование таких соединений, как «фермент—актива­-
тор» или «фермент—ингибитор»;

—влиянием на процесс денатурации ферментного белка.

Известное уравнение Аррениуса, характеризующее влияние темпера­туры на скорость химической реакции, может быть приложено к левой части температурной кривой (см. рис. 8.6):

Изменение скорости ферментативной реакции при повышении тем­пературы измеряется температурным коэффициентом Q10, который по­казывает, во сколько раз ускоряется данная реакция при повышении тем­пературы на десять градусов. Можно преобразовать уравнение Аррениу­са, подставив в него коэффициент Q10:

Это уравнение дает возможность определить энергию активации пу­тем определения значений Q|0 для данной ферментативной реакции.

Для обычных химических реакций Q10 = 2—3, для ферментативных реакций (левая часть температурной кривой) Q10 = 1—2, причем значение Q|0= 1 характерно для температур, близких к оптимальным.

Правая часть температурной кривой показывает резкое снижение ско­рости ферментативной реакции при температурах, превышающих опти­мальную. И это зависит, в первую очередь, от денатурации ферментного белка. Поэтому очень важным показателем, характеризующим отноше­ние фермента к температуре, является его термостабильность.

Термостабильность фермента складывается как бы из двух критери­ев: величины температуры и времени ее воздействия на фермент. Кроме того, на термостабильность различных ферментов могут оказывать вли­яние и такие факторы, как рН среды, ее солевой состав, защитное дей­ствие субстрата.

Влияние рН на активность ферментов.Для каждого фермента харак­терна определенная узкая область значений рН, при которой он прояв­ляет максимальную активность.

Форма кривых, описывающих зависимость активности фермента от рН, отражает способность важных для данного фермента протон-донор-ных или протон-акцепторных групп в активном центре фермента пере­ходить в состояние с требуемой степенью ионизации при определенных значениях рН (см. рис. 8.7).

Кроме влияния рН на состояние ионизации активного центра фер­мента, ход представленных кривых будет зависеть и от других факторов. В частности, изменение рН среды изменяет состояние ионизации суб­страта (если это заряженное вещество), комплексов ES и ЕР, в некото­рых, например, окислительно-восстановительных реакциях, ионы Н+

сами могут принимать участие в реакции; помимо этого, скорость дена­турации ферментативного белка зависит от рН.

При экспериментальном изучении активности фермента от рН сле­дует помнить, что рН-оптимум зависит от состава среды (от природы ис­пользуемого буфера); оптимумы рН прямой и обратной реакции могут быть совершенно различными; при действии одного и того же фермента на различные субстраты рН-оптимумы также могут быть различными. Кроме понятия оптимума рН, очень важным является понятие рН-ста-бильности. Это тот диапазон рН, при котором фермент или фермента­тивный препарат сохраняет свою активность в течение определенного периода времени. рН-Стабильность также зависит от ряда факторов, сре­ди которых, кроме уже названных, форма ферментного препарата, сте­пень его очистки и др.

Все выше сказанное позволяет утверждать, что варьируя температур­ный режим и изменяя рН, можно в какой-то мере регулировать катали­тическую активность фермента.

Влияние активаторов и ингибиторов.Активаторами называют вещества, которые повышают активность ферментов. Хорошим приме­ром таких соединений являются аминокислота цистеин и восстановлен­ный глутатион, содержащие свободную SH-группу. Их активирующее действие заключается в том, что они восстанавливают дисульфидные свя­зи с образованием SH-групп, необходимых для проявления каталитичес­кой активности тиоловых ферментов. Кроме того, некоторые ферменты активируются металлами, которые либо участвуют в построении актив­ного центра, либо стабилизируют пространственную конформацию фер­ментного белка и тем самым обеспечивают проявление каталитических функций.

Ингибиторами называют вещества, специфически снижающие активность ферментов. Снижение или полная потеря активности фер­ментов могут быть вызваны разного рода денатурирующими воздействи­ями, в этом случае правильнее употреблять термин «инактивация» фер­мента.

Механизм действия ингибиторов может быть самым разнообразным:

—ингибитор взаимодействует с апоферментом, при этом возможны
такие варианты, как связывание функциональных групп белка, измене­-
ние третичной и четвертичной структуры апофермента, специфическое
связывание с определенным участком апофермента, неспецифическая
адсорбция на белке;

—ингибитор образует комплекс с субстратом;

—ингибитор связывает кофермент;

—ингибитор связывает активатор;

—ингибитор связывает кофактор.

Чаще всего ингибитор взаимодействует с ферментом, образуя ком­плекс. Это можно выразить следующим уравнением:

Константа диссоциации комплекса фермент—ингибитор (или кон­станта ингибирования) Кiопределяется выражением:

Кiпрямо пропорциональна концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации комплекса фермент—ингибитор.

Существует ингибирование двух основных типов: необратимое и обратимое. Теоретически, в случае необратимого ингибирования k-1 = 0, то есть комплекс EI настолько прочен, что совершенно не диссо­циирует. Но для большинства необратимых ингибиторов величина
k-1 хотя и очень мала, но не равна нулю.

Обратимое ингибирование, в свою очередь, бывает конкурент­ным и неконкурентным.

Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом на основе струк­турного сходства, связываясь с активным центром фермента с образова­нием неактивного комплекса фермент—ингибитор. Отличительная осо­бенность конкурентного ингибирования состоит в том, что его можно устранить или ослабить, повысив концентрацию субстрата. Конкурент­ный ингибитор снижает сродство фермента к субстрату, следовательно, величина Кm в присутствии конкурентного ингибитора увеличивается.

Графически это выглядит так, как изображено на рис. 8.8.

При неконкурентном торможении ингибитор связывается не с актив­ным центром фермента (то есть не там, где присоединяется субстрат), а с другим участком молекулы фермента. Очевидно, что в этом случае инги­битор не оказывает влияние на величину константы Михаэлиса Кт, но будет снижать максимальную скорость реакции — Vmax..

Графически это можно изобразить следующим образом (см. рис. 8.9):

Одними из самых распространенных неконкурентных ингибиторов являются аллостерические ингибиторы. Присоединяясь не к активному, а к другому, так называемому аллостерическому центру молекулы фер­мента, ингибитор вызывает конформационные изменения в структуре активного центра, вследствие чего становится невозможным образова­ние комплекса фермент—субстрат.

Изучение взаимодействия ферментов с ингибиторами и активатора­ми ферментов позволяет получать ценные сведения о субстратной спе­цифичности ферментов, природе функциональных групп активного цен­тра, механизмах каталитической активности.

Так как в качестве ингибиторов могут выступать конечные продукты реакции, различные промежуточные продукты метаболизма, нет сомне­ния в той огромной роли, которую выполняют ингибиторы в регуляции ферментативной активности.

Это подтверждает и факт широкого распространения ингибиторов белковой природы (см. гл. 2). Кроме того, по принципу специфического ингибирования действуют многие лекарственные препараты, антибио­тики, токсичные вещества, антиалиментарные факторы питания.

Специфические ингибиторы, встречающиеся в пищевом сырье и пи­щевых продуктах, присутствуют в качестве составляющих как в тради­ционных рецептурах, так и в сложных композиционных составах но-

вых, модифицированных продуктов питания. Поэтому нельзя не учи­тывать их влияние на активность отдельных ферментов и на биохими­ческие процессы в целом, протекающие при хранении и переработке пищевого сырья.

Все это лишний раз говорит о множестве сложных проблем, которые встречаются в экспериментальной работе с ферментами и использова­нии ферментных препаратов на практике.