Лекция: Гидролитические ферменты

Роль ферментов класса гидролаз в пищевых технологиях очень вели­ка. Это находит отражение в специальной литературе, монографиях, тех­нических инструкциях, стандартах. Поэтому в этом разделе остановим­ся на краткой характеристике наиболее важных представителей гидро­литических ферментов. Для технологов наибольший интерес представ-

ляют три подкласса ферментов класса гидролаз. Это ферменты, действу­ющие на сложноэфирные связи — эстеразы (Н.Ф.3.1); действующие на гликозидные соединения — гликозидазы (Н.Ф.3.2) и действующие на пеп­тидные связи — протеазы (Н.Ф.3.4).

Эстеразы (Н.Ф.3.1). Этот подкласс включает большое число фермен­тов (около 150), которые разделены на семь подподклассов: ферменты, действующие на эфиры карбоновых кислот (3.1.1); эстеразы тиоловых эфиров (3.1.2); гидролазы фосфорных моноэфиров или фосфатазы (3.1.3); гидролазы фосфорных диэфиров (3.1.4); гидролазы моноэфиров олиго-фосфорных кислот (3.1.5); сульфатазы (3.1.6); эстеразы моноэфиров ди-фосфорных кислот (3.1.7).

Наиболее важными с точки зрения участия в различных биохимичес­ких процессах, имеющих место при хранении и переработке пищевого сырья, являются ферменты подподкласса 3.1.1.

Липаза (Н.Ф.3.1.1.3). Липаза или триацилглицерол-липаза широко распространена в природе и играет важную роль в процессах, протекаю­щих при переработке и хранении пищевых продуктов. В настоящее вре­мя выделены и охарактеризованы липазы растительного происхождения (липаза клещевины, пшеницы и других злаков), животного (панкреати­ческая липаза, липаза молока) и микробного (бактериальные и грибные липазы).

Обычно липазы катализируют реакцию расщепления триглицеридов согласно приведенному ниже суммарному уравнению:

Причем предпочтительнее гидролизуются связи в положении 3 и 1 и лишь затем в положении 2. Многочисленные экспериментальные дан­ные дают основание предположить следующий путь липолиза:

триглицерид→1,2-диглицерид→2-моноглицерид→глицерин

Установлено, что липазы быстрее отщепляют остатки высокомолеку­лярных жирных кислот, чем низшие карбоновые кислоты. Ферментатив­ный гидролиз липидов имеет существенное отличие от других гидроли­тических реакций. Парадокс заключается в том, что липаза — водорас­творимый фермент, а ее субстрат гидрофобен; однако активность липа­зы возрастает на границе «вода—липид». Этот феномен известен под на­званием «межфазная активация».

Липазы различного происхождения сильно отличаются друг от друга по специфичности действия, сродству к различным субстратам, раствори­мости, оптимуму рН и другим свойствам. Так, например, липаза семян кле­щевины нерастворима в воде, имеет оптимум рН 4,7—5,0; панкреатическая липаза растворима, и оптимум рН ее действия лежит в слабощелочной сре­де. Липазы микробного происхождения и липаза пшеничных зародышей также отличаются от липазы клещевины. Они растворимы в воде и имеют рН оптимум при 8,0. Липаза молока, молекулярная масса которой пример­но 7000 Да, имеет оптимум рН 9,0—9,2 при гидролизе молочного жира.

Зерновая липаза участвует в процессе порчи зерновых продуктов при хранении. Особенно это касается продуктов, содержащих повышенное количество жира, например, овсяной муки или крупы, пшена. Накопле­ние свободных жирных кислот под действием липазы (рост кислотного числа жира) — признак ухудшения качества продукта. Свободные жир­ные кислоты, особенно ненасыщенные, легко подвергаются окислению под воздействием разных факторов: липоксигеназы, тепловой обработ­ки, кислорода воздуха, солнечного света и др. Таким образом, липазы могут инициировать процесс прогоркания и ограничивать сроки хране­ния пищевых продуктов.

Одна из особенностей липаз связана с тем, что эти ферменты способ­ны катализировать и обратную реакцию, осуществлять синтез сложных эфиров, а также производить переэтерефикацию триглицеридов, т. е. из­менять их жирнокислотный состав. На этом основании разрабатывают­ся способы получения новых форм жировых продуктов с использовани­ем специфических липаз. Так, например, путем реакции переэтерифи-кации делаются попытки получения жира — аналога масла какао из де­шевого исходного сырья.

Пектинэстераза (Н.Ф.3.1.1.11). Пектинэстеразы синтезируются выс­шими растениями, микроскопическими грибами, дрожжами и бактери­ями. Пектинэстераза катализирует гидролиз сложноэфирных связей в мо­лекуле растворимого пектина, в результате чего образуется метиловый спирт и полигалактуроновая кислота. Процесс протекает согласно сле­дующей схеме (стрелками показано действие фермента):

Таким образом, пектинэстераза отщепляет метоксильные группы от метоксилированной полигалактуроновой кислоты (см. также гл. Угле­воды).

Желирующая способность пектина зависит от степени метоксилиро-вания или степени этерификации, поэтому действие пектинэстеразы по отщеплению метоксильных групп приводит к снижению желирующей способности и сопровождается падением вязкости. На этом, очевидно, и основывается применение этого фермента для осветления плодовых соков и вина. Обычно комплексные препараты пектолитических фер­ментов, применяемые для этих целей, получают из различных плесне­вых грибов, и прежде всего из A. niger.

Гидролазы гликозидов или гликозидазы (Н.Ф.3.2).Этот подкласс вклю­чает около ста ферментов с разной специфичностью действия, осуществяющих гидролиз олиго- и полисахаридов; некоторые ферменты этого типа способны осуществлять трансферазные реакции — переносить гликозидные остатки на олиго- и полисахариды, наращивать полисахаридные цепочки. Представители гликозидаз были одними из первых фер­ментов, обратимость действия которых in vitro была экспериментально доказана.

Основной формой запасных углеводов в семенах и клубнях растений является крахмал. Ферментативные превращения крахмала лежат в ос­нове многих пищевых технологий. Поэтому ферменты амилолитическо-го комплекса растительного, животного и микробного происхождения интенсивно изучаются со времени их открытия Кирхгофом в 1814 г. и до настоящего времени.

а-Амилаза (Н.Ф.3.2.1.1). α-Амилазы обнаружены у животных (в слю­не и поджелудочной железе), в растениях (проросшее зерно пшеницы, ржи, ячменя), они вырабатываются плесневыми грибами и бактериями. Все эти ферменты гидролизуют крахмал, гликоген и родственные α -1,4-глкжаны с образованием, главным образом, декстринов и небольшого количества дисахарида — мальтозы.

α-Амилазы гидролизуют α-1,4-связи внутри молекулы крахмала, раз­рывая связь между первым углеродным атомом и кислородом, связыва­ющим этот углерод с соседней молекулой глюкозы. Это наглядно демон­стрирует следующая схема (стрелками показано действие фермента):

Скорость, с которой α-амилазы гидролизуют глюканы различной сте­пени полимеризации, быстро уменьшается по мере ее снижения. Ами­лоза — линейная фракция крахмала, гидролизуется быстрее, чем амило-пектин, имеющий разветвленную структуру.

Скорость гидролиза α-амилазой зависит от вида и состояния крахма­ла (нативный или клейстеризованный крахмал), а также от эффективно­сти самих амилаз. На основании параллельно проводившихся опытов (в одних — действовали препаратами амилаз на клейстеризованный крах­мал, а в других — эквивалентными концентрациями на нативные крах­мальные зерна) было показано, что эффективность амилаз различного происхождения уменьшается в следующем порядке: панкреатическая, со­лодовая, бактериальная, грибная.

Характерной особенностью всех α-амилаз является наличие одного ато­ма Са на молекулу фермента. Роль кальция состоит в том, что он стабилизи­рует вторичную и третичную структуру молекулы α-амилазы, обеспечивая таким образом ее каталитическую активность и вместе с тем предохраняя фермент от действия протеолитических ферментов и тепловой денатурации. Различные α-амилазы отличаются по молекулярной массе, устойчи­вости к нагреванию и некоторым другим показателям. Молекулярная мас­са α-амилаз близка к 50 000 Да, за исключением бактериальной α -ами­лазы, которая имеет молекулярную массу 96 900 Да (кристаллический препарат). Так, например, широко применяемая в промышленности α -амилаза из плесневого гриба A. oryzae, полученная в кристаллическом виде, имеет молекулярную массу 51 860 Да.

Большое практическое значение имеет влияние температуры и рН на стабильность амилаз. Быстрое разрушение зерновой α-амилазы при рН 3,3—4,0, например, дает возможность выпекать ржаной хлеб из муки, которая содержит избыток α-амилазы, при низких значениях рН, чтобы предотвратить излишнее декстринирование крахмала и образование клей­ких веществ в мякише хлеба.

Говоря о термостабильности α-амилаз различного происхождения, мож­но расположить их в следующем ряду по мере снижения устойчивости к на­греванию: бактериальные амилазы — зерновые амилазы — грибные амилазы. Последними работами в области изучения амилаз показано, что в се­менах растений присутствуют два типа α-амилазы: α-амилаза созревания и α -амилаза прорастания.

В созревающем зерне синтезируется α-амилаза созревания, которая затем переходит в латентную форму, локализуясь на мембранах алейро­нового слоя. Первый этап гидролиза крахмала при прорастании осуще­ствляется этой α-амилазой. И только на следующем этапе в работу вклю­чается вновь синтезируемый фермент — α-амилаза прорастания. Ее син­тез в клетках зародыша и алейронового слоя начинается при влажности зерна выше 28%. Две формы α-амилазы семян злаков различаются по термостабильности: α-амилаза созревания при 70°С теряет 50% своей ак­тивности, тогда как α-амилаза прорастания при этой температуре толь­ко незначительно снижает свою активность.

Интенсивность гидролиза крахмала в перерабатываемом сырье, как уже отмечалось ранее, определяется взаимодействием многих факторов. Это прежде всего состояние амилаз созревшего зерна и возможность пе­рехода части латентной формы в свободное состояние. Это и состояние субстрата, его доступность действию фермента (атакуемость субстрата). Большое значение имеет и фракционный состав крахмальных гранул, со­отношение мелких и крупных зерен, а также содержание поврежденных зерен крахмала, которые легче поддаются действию ферментов.

Как было установлено в последнее время, важная роль в этом процес­се принадлежит протеолитическим ферментам. Протеазы, осуществляя ограниченное расщепление белков, способствуют освобождению ами­лаз из связанного состояния, а также гидролизуют ту часть запасных бел­ков, которая прочно связана с поверхностью крахмальных гранул, об­легчая тем самым доступ фермента к субстрату.

Мощным механизмом регуляции скорости расщепления крахмальных гранул является система белковых ингибиторов амилаз, широко представ­ленных в растениях. Ингибиторы белковой природы избирательно взаимо­действуют с амилазами и образуют неактивные комплексы «амилаза—инги­битор». Высокой активностью обладают ингибиторы амилаз картофельно­го сока. Из зерна пшеницы выделен ингибитор с двумя активными центра­ми (двухцентровой). Один активный центр имеет сродство к протеазам и способен блокировать их действие. Другой активный центр имеет сродство к амилазам. Таким образом, один ингибитор белковой природы способен блокировать работу как протеаз, так и амилаз. В образующемся надмолеку­лярном комплексе ингибитор выполняет своеобразную роль связывающего звена, подавляя активность ферментов разного механизма действия.

β-Амилаза (Н.Ф.3.2.1.2). β-Амилаза отщепляет мальтозу от нередуци-рующего конца цепи, разрывая гликозидные связи через одну. Название «β-амилаза» было выбрано для того, чтобы показать, что мальтоза обра­зуется в β-аномерной форме. Это не означает, что в молекуле крахмала присутствуют β-связи, а указывает скорее на то, что происходит инвер­сия конфигурации, которая может иметь место в процессе ферментатив-

ного превращения вещества, содержащего асимметрический атом угле­рода. Такая инверсия была открыта П. Вальденом в 1893 г. и поэтому на­звана вальденовской инверсией. На представленной ниже схеме дей­ствие β-амилазы на амилозу и амилопектин показано стрелками.

Таким образом, действуя упорядоченно, β-амилаза последовательно отщепляет остатки мальтозы с нередуцирующего конца до тех пор, пока не встретится точка ветвления со связью α-1,6. При этом амилоза под действием β-амилазы расщепляется до мальтозы на 100%, а при действии β-амилазы на амилопектин помимо образующейся мальтозы остается не­тронутой крупная, сильно разветвленная сердцевина, так называемый «конечный декстрин», т. к. фермент прекращает свое действие за 2—3 ос­татка глюкозы от точек ветвления.

β -Амилазы — это ферменты в основном растительного происхожде­ния. Хорошо известными источниками являются зерно пшеницы, а так­же пшеничный и ячменный солод, соевые бобы, клубни картофеля.

В отличие от α-амилазы, β-амилаза менее термостабильна, но прояв­ляет большую устойчивость к кислым значениям рН, сохраняя свою ак­тивность при рН 3,3. Это нашло свое отражение в способе разделения а-и р-амилаз солода, где оба фермента присутствуют одновременно.

Глюкоамилаза (Н.Ф.3.2.1.3). Глюкоамилаза (γ-амилаза) продуцируется различными видами плесневых грибов рода Aspergillus: A. oryzae, A. niger, A. awamory и некоторыми другими, например, Rhizopusdelamarn Rhizopus niveus. Эти ферменты расщепляют как амилозу, так и амилопектин до глю­козы, последовательно действуя с нередуцирующего конца цепи крахма­ла. Они способны гидролизовать α -1,4 и α -1,6 гликозидные связи.

Различные глюкоамилазы отличаются друг от друга скоростью гид­ролиза крахмала, отношением к температуре и рН, и некоторыми други­ми показателями. На использовании препаратов грибной глюкоамилазы разработан ферментативный метод получения глюкозы, который полу­чил широкое распространение в Японии.

Пуллуланаза (Н.Ф. 3.2.1.41). Ранее этот фермент был известен под дру­гими названиями — R-фермент, предельная декстриназа, дебранчинг-фермент.

Пуллуланаза является эндогенным ферментом, она способна хаотич­но гидролизовать α-1,6-гликозидные связи в пуллулане, амилопектине, гликогене и предельных декстринах, которые получаются при совмест­ном воздействии на крахмал и гликоген α- и β-амилаз. Наиболее частым отцепляемым фрагментом является мальтотриоза. На представленной ниже схеме действие пуллулоназы на пуллулан показано стрелками.

(от 48 000 до 143 000 Да) и по разному относятся к температуре и рН, действию ингибиторов и активаторов.

Инулаза (Н.Ф. 3.2.1.7). Фермент осуществляет гидродиз инулина и других полифруктозанов по |3-1,2-фруктозидной связи, начиная с β-фрук-тозидного конца полимера. В результате образуется фруктоза и единствен­ная молекула глюкозы на одну молекулу инулина. При полном гидроли­зе инулина получается 95% фруктозы и 5% глюкозы.

Фермент гидролизует главным образом инулин; сахароза, рафиноза также гидролизуются, но с незначительной скоростью. Инулаза содер­жится в тех же растениях (топинамбур, цикорий), в которых присутству­ет инулин. Активная инулаза продуцируется Aspergillus awamori BKM-808 при глубинном культивировании. Препарат обладает высокой ста­бильностью к Н+-ионам и температуре. Оптимум рН действия 4,5; опти­мум температуры — 65°С.

Полученные из инулина фруктозные сиропы могут быть широко ис­пользованы в кондитерской промышленности и диетическом питании.

β-Фруктофуранозидаза (Н.Ф.3.2.1.26). Другие названия этого фермен­та — инвертаза или сахараза.

Для промышленного производства имеют значения только фермен­ты из S. cerevisiae и S. carlsbergensis. β-Фруктофуранозидазу выделяют из дрожжей путем автолиза. Этот фермент гидролизует сахарозу по β-фрук-тозидной связи согласно уравнению:

В результате действия фермента на сахарозу получается смесь экви-молярных количеств α -глюкозы и β-фруктозы, получившая название «ин-вертного сахара». Термин «инверсия» обозначает изменения, происхо­дящие в способности сахара вращать плоскость поляризованного света. Это можно выразить следующей схемой:

Продуцетами пуллуланазы являются Aerobacter aerogenes, Bacillus cereus, Bacillus polimyxa, Bacillus sp. и Streptomyces. Ферменты, получен­ные из различных источников, обладают разной молекулярной массой

Оптимум рН дрожжевой инвертазы находится в достаточно широ­кой зоне от 4,0 до 5,5. Фермент ингибируется ионами металлов. Полное ингибирование происходит под действием ртути и свинца; частичное ингибирование вызывают ионы серебра, цинка, меди. β-Фруктофура-нозидаза гидролизует также рафинозу и метил-β-D-фруктофуранозид, причем, если относительную скорость гидролиза сахарозы принять за 100, то соответствующие скорости расщепления этих субстратов будут равны 47 и 77.

Инвертаза находит широкое применение в пищевой промышлен­ности. Гидролиз концентрированных растворов сахарозы приводит к образованию более сладких сиропов. Точка кипения инвертированных сиропов выше, а точка замерзания ниже, т. к. при инверсии повыша­ется осмотическое давление. Образовавшиеся при действии инверта­зы моносахариды более растворимы, не так легко выкристаллизовы­ваются из высококонцентрированных сиропов. Практическое исполь­зование инвертазы в кондитерской промышленности будет рассмот­рено в разделе 8.3.

β-Галактозидаза (Н.Ф.3.2.1.23). Фермент, который часто называют лактазой, катализирует реакцию гидролитического отщепления нереду-цирующих остатков β-D-галактозы в β-галактозидах, в частности, в мо­лочном сахаре — дисахариде лактозы:

Ферментные препараты лактазы, применяемые в пищевой промыш­ленности, получают с помощью различных продуцентов: микроскопи­ческих грибов (A. oryzae, A. niger), бактерий (Е. coli, Lactobacillus), дрож­жей (S. fragilis, S. psedotropicalis). Все они имеют различные температур­ные оптимумы, которые, однако, лежат в пределах 37-50°С. Оптимумы рН этих ферментов также заметно отличаются: для бактериальных — око­ло 7,0; для грибных — около 5,0; для дрожжевой лактазы — около 6,0.

При гидролизе лактозы в цельном молоке, обезжиренном молоке или в концентратах молока оптимальную активность (при нейтральном рН этих субстратов) проявляет дрожжевой фермент; для сыворотки и ее концентратов — грибной. Причем в обезжиренном молоке или сыворот­ке лактоза гидролизуется легче, чем в цельном, а пастеризованные суб­страты гидролизуются легче, чем непастеризованные.

β-Галактозидаза из E.coli была получена в кристаллическом состоя­нии, ее молекулярная масса 850 000 Да. Она ингибируется некоторыми металлами (Си, Zn). Восстанавливающие агенты (цистеин, сульфид Na, сульфит Na и др.) активируют фермент и способны преодолевать влия­ние ингибиторов-металлов.

У некоторых групп населения (исключение составляют жители Се­верной Европы и некоторых районов Африки) ярко выражена непе­реносимость (интолерантность) лактозы, связанная с полным или частичным исчезновением у взрослых людей лактазной активности в клетках кишечного эпителия. У грудных младенцев активность этого фермента очень высока.

Эндополигалактуроназа (Н.Ф.3.2.1.15) и экзополигалактуроназа (Н.Ф.3.2.1.67). Эти два фермента участвуют в превращениях пектиновых веществ наряду с другими пектолитическими ферментами растительно­го и микробного происхождения (см. также гл. 3).

Эндополигалактуроназа — фермент, который гидролизует а-1,4-свя-зи в молекуле растворимого пектина (метоксилированной полигалакту-роновой кислоты), неупорядоченным, произвольным образом. С возрас­танием степени этерификации полигалактуроновой кислоты степень и скорость гидролиза падают, т. к. для проявления каталитической актив­ности фермента требуются свободные карбоксильные группы. Большин­ство изученных эндополигалактуроназ микроскопических грибов име­ют молекулярную массу от 30 000 до 40 000 Да. Оптимальные значения рН колеблются в диапозоне 3,8—5,5.

В гидролизе этого типа связи принимает участие и другой фермент — экзополигалактуроназа, который последовательно отщепляет молекулу галактуроновой кислоты, начиная с нередуцирующего конца. Эндопо­лигалактуроназа синтезируется как грибами, так и некоторыми видами бактерий. Они отличаются по своей специфичности к пектинам из раз­личных источников, конечными продуктами реакции, оптимуму рН и другим свойствам.

Для промышленного производства ферментных препаратов пек-толитических ферментов, которые являются комплексными, в каче­стве продуцентов используют в основном микроскопические (плес­невые) грибы, в частности, грибы рода Aspergillus: A. niger, A. wentii, A. oryzae. Бактериальные ферменты в промышленных масштабах не производятся.

Растительные полигалактуроназы, по-видимому, похожи на гриб­ные полигалактуроназы. Они обнаружены в широком спектре плодов и овощей: помидорах, авокадо, редисе, огурцах, яблоках, грушах, цит­русовых и др. Все они проявляют активность при естественных рН плодов.

Применение препаратов пектолитических ферментов в промышлен­ности достаточно обширно. Они используются при производстве фрук­товых соковых концентратов и экстрактов, при осветлении соков и вин, при производстве фруктовых и овощных пюре и нектаров.

Целлюлолитические ферменты. Ферментативное разруше­ние целлюлозы и родственных ей полисахаридов (гемицеллюлозы, лиг­нина) — сложный процесс, требующий участия комплекса ферментов. Продуцентами такого комплекса целлюлолитических ферментов явля­ются грибы рода Trichoderma, Phanerochaete (Sporotrichum) и Fusarium, a также бактерии рода Clostridium, Cellulomonas и некоторые другие.

Три основных типа целлюлолитических ферментов, продуцируемых микроскопическими грибами, образуют комплекс ферментов, способ­ных осуществить полный гидролиз целлюлозы:

—Эндо-1,4-β-глюконаза или целлюлоза (Н.Ф.3.2.1.4) беспорядочно гидролизует β-1,4-гликозидные связи. Она не расщепляет целлобиозу, но
гидролизует целлодекстрины и производные целлюлозы с высокой сте­-
пенью замещения, т. к. специфичность этого фермента не высока.

—Экзо-1,4-β-глюконаза или целлобиогидролаза (Н.Ф.3.2.1.91) действует на целлюлозу, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего кон­ца цепи. Этот фермент не действует на замещенные производные цел-­
люлозы, что указывает на более высокую субстратную специфичность,
чем у эндоглюконазы. Целлобиогидролаза гидролизует целлодекстри­-
ны, но не действует на целлобиозу.

—β-Глюкозидаза (Н.Ф.3.2.1.21) расщепляет целлобиозу и целлоолигосахариды до глюкозы. Фермент не действует на целлюлозу и высшие олигосахариды.

Целлюлазная система бактерий существенно проще, чем у грибов, т. к. бактерии образуют только эндоглюконазу и β-глюкозидазу.

Все ферменты целлюлолитического комплекса достаточно хорошо изучены: практически все они являются гликопротеидами, определены их молекулярные массы, изоэлектрические точки, для многих показано наличие множественных форм.

Доказано, что различные ферменты, гидролизующие высокоупоря-доченную целлюлозу, действуют в синергизме (рис. 8.10).

Эндоглюконаза атакует аморфные участки целлюлозных фибрилл. В результате образуются новые целлюлозные цепочки, на которые дей­ствует целлобиогидролаза, отщепляя целлобиозные звенья с нередуци­рующего конца. Синергизм между двумя этими ферментами проявляет­ся в том, что в результате действия эндоглюконазы появляется новый субстрат (более короткие цепочки), на который действует уже целлобио­гидролаза. β-Глюкозидаза усиливает гидролиз, расщепляя целлобиозу — конечный продукт и ингибитор этих ферментов.

Применение целлюлолитических ферментов представляет большой интерес, т. к. ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих матери­алов (древесина, торф, сельскохозяйственные и городские отходы) мо­жет обеспечить получение различных биотехнологических продуктов (глюкозы, этанола, ацетона, микробной биомассы). В настоящее время исследования ферментативного расщепления целлюлозы достигли такого уровня, когда имеются все необходимые условия для разработки промыш­ленного процесса и лишь по экономическим причинам он не реализует­ся на практике.

Протеолитические ферменты (Н.Ф.3.4).Основной реакцией, катали­зируемой протеолитическими ферментами, является гидролиз пептид­ной связи в молекулах белков и пептидов.

Согласно первоначальной классификации протеолитических фер­ментов их делили на две группы: протеиназы и пептидазы. При этом считали, что протеиназы действуют на белки, расщепляя их до поли­пептидов; полипептиды же гидролизуются пептидазами до аминокис­лот. Более поздняя классификация, до сих пор сохранившая свое зна­чение, основана на схеме, предложенной М. Бергманом и Д. Фрутоном (1937). Согласно этой схеме протеазы разделяются на эндо- и экзопеп-тидазы. Ферменты первой группы (эндопептидазы) могут гидролизо-вать глубинные пептидные связи и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты; ферменты второй группы (экзопептидазы) не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи, и дей­ствуют либо с карбоксильного, либо с аминного конца цепи, отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты. В связи с этим экзопептидазыподразделяют на аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы.

Аминопептидазы (Н.Ф.3.4.11) катализируют отщепление N-концевых аминокислот.

Дипептидазы (Н.Ф.3.4.13) проявляют специфичность к дипептидным субстратам.

Вместе с тем эндопептидазы (протеиназы) разделены на подгруппы, начиная с подподкласса 3.4.21, в первую очередь на основании катали-

тического механизма (строения активного центра); особенности специ­фичности используются при этом только для идентификации индивиду­альных ферментов в пределах подподкласса:

—сериновые протеиназы (Н.Ф.3.4.21), в активном центре которых функ­-
ционирует остаток серина и гистидина;

— тиоловые (цистеиновые) протеиназы (Н.Ф.3.4.22), содержат в актив­-
ном центре SH-группу остатка цистеина;

— кислые (карбоксильные) протеиназы (Н.Ф.3.4.23), в активном центре
содержат СООН-группу остатка аспарагиновой кислоты;

—металлопротеиназы (Н.Ф.3.4.24), содержат в активном центре металл,
необходимый для проявления их каталитической активности.

Группа протеиназ, о механизме действия которых ничего неизвестно, отнесена к подподклассу 3.4.99.

Субстратная специфичность протеиназ будет определяться следую­щими факторами: природой аминокислоты, образующей гидролизуемую пептидную связь; радикалами аминокислот, удаленными от гидролизуе-мой пептидной связи; общей пространственной конформацией молеку­лы белка, делающей определенные пептидные связи доступными для дей­ствия фермента.

Исследование протеолитических ферментов ведется весьма интенсив­но. Это происходит вследствие того, что они являются чрезвычайно удоб­ным объектом для изучения структуры белков, активных центров фер­ментов, механизмов регуляции ферментативной активности и других важ­ных вопросов энзимологии; кроме того, протеазы широко применяются в различных отраслях промышленности: пищевой, сельском хозяйстве, медицине.

Промышленное применение препаратов протеаз будет описано в раз­деле 8.3. Здесь же мы остановимся на рассмотрении отдельных свойств протеаз, имеющих технологическое значение, предварительно разделив их по типу происхождения на растительные, животные и микробные.

Растительные протеазы. Споры о приоритетности тех или иных ферментных препаратов, полученных из названных источников, ведутся уже достаточно долго. Однако, в связи с ограниченностью жи­вотного сырья (внутренние органы крупного рогатого скота и свиней), а также возможной токсичностью микробных препаратов (все они требу­ют высокой степени очистки, хотя и это не может служить абсолютной гарантией их безопасности), большой интерес представляют раститель­ные протеазы, лишенные указанных недостатков.

Папаин (Н.Ф.3.4.22.2) и химопапаин (Н.Ф.3.4.22.6). Папаин является наиболее применяемым в производстве протеолитическим ферментом. Ферменты папаин и химопапаин — истинные ферменты латекса плодов дынного дерева (Carica papaya).

Эти ферменты относятся к группе тиоловых протеиназ, характерной особенностью которых является то, что они активируются сульфгидриль-ными соединениями — восстановленным глутатионом, цистеином.

Папаин и химопапаин получены в кристаллическом состоянии; их молекулярная масса 20 700 и 36 000 Да, соответственно, а изоэлектричес-кие точки равны 8,75 для папаина и 10,1 для химопапаина.

Оптимальная зона рН для действия папаина зависит от природы гид-ролизуемого белка и может быть слабокислой, нейтральной или слабо­щелочной.

Химопапаин имеет большое сходство с папаином, однако можно вы­делить и некоторые интересные отличия. Например, активность химо­папаина при гидролизе гемоглобина и казеина в два раза ниже, чем у па­паина; он более термоустойчив, чем папаин, и проявляет хорошую ста­бильность в кислой среде (рН 2,0).

Папаин обладает довольно широкой специфичностью. Он преиму­щественно гидролизует вторую пептидную связь, лежащую за карбоксиль­ной группой фенилаланина.

Различные фирмы, как зарубежные, так и отечественные, выпускают ферментные препараты на основе папаина с различной степенью очист­ки. Возможности их использования обширны: кожевенная промышлен­ность (при обезволашивании и мягчении шкур); кинопроизводство (для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации); пар­фюмерия (при создании добавок в кремы, лосьоны, зубные пасты); про­изводство синтетических моющих средств (для удаления загрязнений бел­ковой природы); медицина (при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов и др.); пищевая промышленность (виноделие, пиво­варение, производство спирта, хлебопечение, сыроделие и др.).

Фицин (Н. Ф. 3.4.22.3) и бромелаин (Н. Ф. 3.4.22.5). Фицин выделяют из млечного сока фикусовых растений, например, инжира (Ficus carica). Так же, как и папаин, он относится к тиоловым протеиназам. Еще один тиоловый фермент — бромелаин — получают из свежего сока ананаса (Bromeliacea).

Оба эти фермента имеют сходство с папаином, проявляют наиболь­шую активность в нейтральной зоне рН, обладают широкой специфич­ностью, предпочтительно расщепляют пептидные связи, образованные положительно заряженными аминокислотами.

Использование бромелаина и фицина аналогично использованию папаина; в последние годы их производство возросло, и в настоящее вре­мя эти ферменты применяют для удаления белковой мути в пиве и для мягчения мяса.

Протеолитические ферменты семян растений. В се­менах злаковых и бобовых культур содержится целый комплекс протео-

литических ферментов, участвующих в расщеплении запасных белков до аминокислот в процессе прорастания семян. В покоящихся семенах со­стояние белкового комплекса характеризуется высокой стабильностью и автолиз в водных суспензиях выражен слабо. Поэтому комплекс про-теолитических ферментов семян оставался долгое время слабо изучен­ным. Это было связано с методическими трудностями их выделения и очистки. В настоящее время известно, что протеолиз белков в семенах растений осуществляется комплексом ферментов, различающихся по своим функциям, механизму действия и другим показателям. Некото­рые из этих ферментов были выделены в виде высокоочищенных препа­ратов и подробно охарактеризованы. Так, например, из семян пшеницы были выделены несколько типов протеолитических ферментов, разли­чающихся по оптимуму рН: кислые протеиназы с оптимумом рН 3,7 — 4,0; нейтральные протеиназы с оптимумом рН 6,5 —7,0; щелочные про­теиназы с оптимумом рН > 8,0.

Из трех групп протеиназ наибольшего внимания технологов заслу­живают нейтральные протеиназы. По активности они в несколько раз превосходят кислые и в условиях теста способны эффективно расщеп­лять белки клейковины. Одна из особенностей нейтральных протеиназ состоит в том, что они не растворяются в водных, солевых и буферных растворах. Они прочно связаны с белками клейковинного комплекса и извлекаются при частичном растворении клейковины в щелочном ра­створе. Максимальное извлечение нейтральных протеиназ происходит при обработке измельченного зерна, муки или лиофилизированной клей­ковины 0,35%-м раствором карбоната натрия. При подкислении щелоч­ного раствора нейтральные протеиназы выпадают в осадок, а в надоса-дочной жидкости остаются их белковые ингибиторы. Таким образом, в созревших семенах пшеницы нейтральные протеиназы и их белковые ингибиторы образуют единый неактивный комплекс, связанный с клей­ковиной. Соотношение активности протеиназ и их ингибиторов в созрев­шем зерне определяет стабильность белкового комплекса, его устойчи­вость в процессе тестоведения.

Нейтральные протеиназы не активируются восстановленным глута­тионом или цистеином и поэтому не могут быть отнесены к тиоловым ферментам, в отличие от кислых протеиназ. Нейтральные протеиназы ингибируются хлоридом натрия, фенольными соединениями, аромати­ческими аминокислотами, продуктами сахаро-аминной реакции (мела-ноидинами). Хлорид натрия является обязательным компонентом рецеп­туры и, внесенный в таком количестве, снижает активность нейтраль­ных протеиназ и соответственно интенсивность автолиза на 60—70%. В зависимости от качества муки и состояния ее клейковинного комп­лекса технолог может варьировать время внесения соли и тем самым ре-

гулировать интенсивность протеолиза. При переработке слабой муки не­обходимо как можно раньше вводить соль, тогда как для муки с чрезмер­но крепкой клейковиной желательно активизировать протеолиз, и соль следует вносить на более поздних стадиях.

В связи с этим необходимо еще раз подчеркнуть важность изучения собственных эндогенных ферментных систем биологического сырья, факторов, влияющих на их активность с точки зрения их огромной роли в процессах, происходящих при созревании, хранении и переработке пи­щевого сырья.

Протеазы животного происхождения. Протеазам жи­вотного происхождения принадлежит огромная роль в процессах пище­варения. Они были одними из первых ферментов, которые получены в высокоочищенном кристаллическом состоянии и детально изучены. Именно они стали объектами для расшифровки структуры активного центра и механизма каталитической активности. Кроме того, эти фер­менты, благодаря своей высокой специфичности, сами явились инстру­ментами для расшифровки первичной структуры белков, изучения регу-ляторных функций протеаз в метаболизме клетки.

Трипсин (Н.Ф.3.4.21.4). Трипсин — сериновая протеиназа, получен­ная в кристаллической форме. Молекулярная масса около 23 800 Да. Изо-электрическая точка 10,6; оптимум рН действия находится между 7,0-9,0 для белков и синтетических субстратов.

Трипсин проявляет высокую специфичность к определенным пептид­ным связям. Он осуществляет гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами аргинина и лизина. Трипсин секретируется поджелудочной железой в виде зимогена — трипсиногена, неактивного предшественника, и активируется либо энтерокиназой, либо аутоката-литически активным трипсином по механизму ограниченного протео­лиза. Превращение трипсиногена (229 аминокислотных остатка и моле­кулярная масса около 24 000 Да) в трипсин (223 аминокислотных остатка) можно представить следующим образом: разрыв одной-единственной пептидной связи между Лиз—Иле, отщепление N-концевого гексапеп-тида Вал—Асп—Асп—Асп—Асп—Лиз приводит к образованию активной формы фермента.

Высокоочищенный трипсин применяется для медицинских целей. Это одна из главных протеаз поджелудочной железы, которая в виде не­очищенного панкреатина находит некоторое применение в пищевой про­мышленности для производства гидролизатов.

Химотрипсин (Н.Ф.3.4.21.1). Химотрипсин — протеолитический фер­мент, секретируемый поджелудочной железой в тонкий кишечник в виде неактивного предшественника, называемого химотрипсиногеном. Химо-трипсиноген (молекулярная масса около 25 000 Да) представляет собой по-

липептидную цепь, состоящую из 245 аминокислотных остатков и содер­жащую пять дисульфидных связей. Он активируется в тонком кишечнике под действием трипсина. При этом происходит гидролиз четырех пептид­ных связей и отщепление двух дипептидов (14—15 и 147—148). В результа­те образуется активный химотрипсин, состоящий из трех полипептидных цепей, ковалентно связанных двумя дисульфидными мостиками.

В активном центре химотрипсина содержится остаток гистидина (57), аспарагиновой кислоты (102) и остаток серина (195). Молекулярная масса около 22 500 Да. Изоэлектрическая точка 8,3; оптимум рН в пределах 7,0— 9,0, что согласуется с естественными условиями его действия.

Специфичность химотрипсина заключается в том, что он предпочти­тельнее гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами: тирозином, триптофаном, фенилаланином.

Этот фермент не применяется в пищевой промышленности как та­ковой, но является составной частью комплексных препаратов панк­реатина.

Пепсин (Н.Ф.3.4.23.1). Пепсин вырабатывается слизистой желудка в виде пепсиногена (молекулярная масса около 42 000 Да). Пепсиноген превраща­ется в активный пепсин под действием НС1 или аутокаталитически путем расщепления одной пептидной связи. Фермент получен в кристалличес­ком виде, его молекулярная масса 35 000 Да, оптимум рН действия 1,8.

Пепсин является кислой (карбоксильной) протеиназой. Его специ­фичность выражается в преимущественном гидролизе пептидных свя­зей, образованных аминными группами фенилаланина и тирозина.

Пепсин имеет огромное значение как пищеварительный фермент, он входит в состав лекарственных ферментных препаратов, тонизирующих средств, жевательной резинки. В пищевой промышленности пепсин ис­пользуют для свертывания казеина молока и для растворения белковой мути в пиве.

Реннин (Н.Ф.3.4.23.4). Этот фермент, имеющий много сходства с пеп­сином, содержится в соке четвертого отдела желудка телят. Реннин обра­зуется из предшественника — прореннина. Его молекулярная масса око­ло 40 000 Да, изоэлектрическая точка около 4,5. Оптимум рН действия фермента 3,7.

Реннин представляет собой мощную протеазу, осуществляющую сверты­вание молока; он является основным компонентом неочищенных экстрак­тов и комплексных промышленных препаратов, используемых для этой цели.

Казеин молока (78% всех азотистых веществ молока) является фос-фопротеидом, содержащим около 6—10% углеводов. Он не осаждается ионами Са+2; действие реннина приводит к образованию макроглико-пептида и пара-χ-казеина. Последний осаждается в присутствии ионов Са+2 и способствует осаждению других фракций казеина.

Микробные протеазы. Число микроорганизмов, продуциру­ющих протеазы, чрезвычайно велико. Специфичность этих ферментов во многих случаях более широкая, чем специфичность хорошо изучен­ных ферментов животного происхождения, что затрудняет их классифи­кацию.

Микробные протеазы (грибные и бактериальные) находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Среди них есть фер­менты, имеющие оптимумы в нейтральной, кислой и щелочной зонах рН; некоторые из них проявляют трипсиноподобное действие, другие яв­ляются пепсиноподобными ферментами, третьи — тиоловыми, четвер­тые имеют пептидазную активность и т. д. Многие из них были выделе­ны в виде высокоочищенных препаратов и подробно охарактеризованы.

Наибольшее применение нашли щелочная сериновая протеаза из Bacillus licheniformis, которая используется в моющих средствах; протеа­за из Мусог, которая заменила телячьи сычуги в производстве сыра, а так­же грибная протеаза из A. oryzae (в комплексе с амилазой), используемая в хлебопечении.

Протеазы — наиболее важные промышленные ферменты. Уровень по­требления препаратов микробных протеаз около 40% от всех используе­мых ферментов (табл. 8.3).

Субтилизин Карлсберга (Н.Ф.3.4.21.14). Кристаллическая форма это­го фермента впервые была получена в 1952 г., и с тех пор субтилизин яв­ляется наиболее важной промышленно используемой микробной проте-азой. Он продуцируется В. subtilis и В. licheniformis.

Этот фермент состоит из одной полипептидной цепочки (214 амино­кислотных остатка), среди аминокислот отсутствует цистеин. Молеку­лярная масса фермента — 27 277 Да, изоэлектрическая точка 9,4; опти­мум рН 8,0—9,0. Фермент отличается высокой рН-стабильностью в диа­пазоне от 5,0 до 11,0.

Субтилизин Карлсберга является сериновой протеиназой, обладает широкой специфичностью, предпочтительнее гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами.

Ренниноподобные кислые протеазы. Наиболее важные с практической точки зрения кислые протеазы, используемые при произ­водстве сыров, образуют культуры Mucor pusillus и Mucor mieher.

Протеазы из Mucor pusillus имеют молекулярную массу 30 000 Да, со­стоят из одной полипептидной цепочки, оптимум рН действия по казеи­ну 4,5, по гемоглобину 4,0.

Протеазы из Mucor mieher имеют большую молекулярную массу 38 000 Да, содержат около 6% углеводов и проявляют максимальную ак­тивность по гемоглобину при рН 4,5.

Нейтральные протеазы аспергилловых грибов. Из куль-туры A. oryzae были выделены две нейтральные металлопротеиназы. Одна из них имеет оптимум рН 7,0, однако быстро инактивируется при 50°С. Другая обладает более низким оптимумом рН 5,5—6,0, но проявляет высо­кую термостабильность (10 минут, 90°С — остаточная активность 10%).

Протеазы из различных штаммов A. oryzae или из одних штаммов, но растущих при разных условиях, неодинаково влияют на процесс хлебопе­чения даже в том случае, если доза фермента стандартизирована. Это объяс­няется тем, что промышленные препараты содержат различные количе­ства протеолитических компонентов из A. oryzae, а также влиянием мно­гообразных внешних и внутренних факторов на протеолиз белков муки.