Лекция: Количественное определение барбитуратов

Для количественного определения барбитуратов, выделенных из биологического материала, применяют разработанный В.И. Поповой фотоколориметрический метод, методика которого приводится ниже.

1. Фотоэлектроколориметрический метод. Сухие остатки барбитуратов, выделенных из биологического материала методом изолирования этих веществ водой, подкисленной серной кислотой (см. выше), в зависимости от исследуемого барбитурата растворяют в хлороформе или в метиловом спирте. Сухие остатки барбитала, гексенала, фенобарбитала и циклобарбитала растворяют в 6 мл хлороформа, а сухие остатки
барбамила и этаминала — в 2 мл метилового спирта. Объемы растворов барбамила и этаминала в метиловом спирте доводят хлороформом
до 6 мл. К полученным растворам барбитуратов прибавляют по 5 мл
0,125% раствора ацетата кобальта в метиловом спирте и по 1 мл 5 % раствора изопропиламина в метиловом спирте. Оптическую плотность окрашенных в фиолетовый цвет растворов измеряют при помощи фотоэлектроколориметра (кювета 20 мм) предварительно установив длину волны соответствующего максимальному светопоглошению. В качестве раствора сравнения применяют смесь перечисленный
выше реактивов.

2. Спектрофотометрический метод. Количественное определение барбитуратов изолированных из биологического материала, целесообразно проводимспектрофотометрическим методом при двух длинах волн. Этот метод
основан на способности барбитуратов неодинаково поглощать свет при
рН=10,0; 13.0 и при рН~2,0. Зная оптические плотности барбитуратов
при рН=10,0: 13.0 и рН=2,0, а также удельные коэффициенты свето поглощения при данных длинах волн, рассчитывают содержание барбитуратов а пробах в процентах, пользуясь формулой:

C=∆D ,

I · E 1cм1%

С — концентрация барбитуратов в %;

E 1cм1% — удельный коэффициент светопоглощения барбитурата, при длине волны, соответствующей максимуму светопоглощения;
I — толщина слоя в см.

∆D — оптическая плотность раствора, составляющая разность

DрН1,00-DрН2.0 или DрН13.о — DрН10.0.

Приготовление стандартного раствора барбитуратов. Точную навеску барбитурата (0,5 г) помещают в мерную колбу вместимость 1000 мл и растворяют в 100 мл фосфатного буферного раствора (рН « 7,4) осторожном нагревании и перемешивании, жидкость доводят до метки дистиллированной водой.В 1 мл полученного стандартного раствора содержится 50 мкг барбитурата.

Определение удельного коэффициента светопоглощения. В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят соответственно 1. 2, 3, 4, 10, 15 и 20 мл стандартного раствора барбитурата, объем жидкостей мерных колбах доводят до метки боратным буферным раствором (pH=10,0). Затем определяют удельного коэффициента светопоглощения барбитуратов в растворах, имеющих рН~ 10,0 и рН« 2,0 при длине волны 239 нм или на том максимуме, который установлен данным прибором. Раствором сравнения служит боратный буферный раствор (рН « 10,0).Затем в обе кюветы прибавляют по 1 капле концентрированной хлороводородной кислоты, получают раствор с рН« 2.0, тщательно перемешивают, снова измеряют оптическую плотность раствора при той же длине волны.

A) Определение по DpH10.0 — ОрН2.0

Измеряют оптическую плотность растворов в одно сантиметровых кюветах. Раствором сравнения служит боратный буфер (рН«10,0).Затем в обе кюветы добавляют концентрированной хлороводородной кислоты, тщательно перемешивают и снова измеряют оптическую плотность при той же длине волны (получают ОрН,0).

Подчинение закону Ламберта—Бера наблюдается в интервале концентраций 4-20 мкг/мл.

Значение Е1см1% при ∆D =DpH10.0 — DpH2.0 и λмах 239 нм по литературным данным: барбитал — 550,0; фенобарбитал — 380,0; барбамил — 415,0; этаминал-натрия — 450.0.

B) Определение по DpH13.0 — DрН10.0.

Оптическую плотность раствора (рН=10.0) измеряют при 260 им или на другой установленной длине волны, затем в кюветы добавляют по 2капли насыщенного водного раствора едкого натра и тщательно перемешивают (рН«13,0). Измерение оптической плотности производят при той же длине волны (1.))НП0)

Значение Е1см1% при 260 нм ∆D =DpH13.0-DpH10.0 (по литературным данным) следующее: барбитал — 260.1): фенобарбитал – 210,0): барбамил — 195.0; этаминал натрий — 195,0; бутобарбитал — 206.0.

3. Количественное определение барбитуратов в трупном материале. Его проводят спектрофотометрически в УФ — области спектра по разности оптических плотностей ∆D = DpH10.0 — DpH2.0 (λ max 239 нм, органы трупов) или D =DpH13.0-DpH10.0 (λмах 260 нм, биологические жидкости).

Для количественного определения барбитуратов 1/20 -1/5 часть хлороформной вытяжки (V,) упаривают и количественно переносят на стартовую линию хроматографической пластинки, в виде полосы 1 длиной 2-2.5 см. Параллельно в качестве свидетеля наносят в виде полосы той же длины от 1/100 до 1/25 хлороформной вытяжки (в зависимости от результата предварительного хроматографического исследования) стандартного раствора барбитурата. После хроматографирования в системехлороформ н-бутанол- 25% раствор аммиака 70:40:5 по описанной выше методике, часть пластинки, соответствующую области хроматографирования метчика, проявлявют растворами дифенилкарбазона и сульфата ртути. Зону, параллельную проявленному пятну, снимают с помощью прибора вакуум-экстракции или другим способом. Элюирование проводят 10 мл боратного буфера (рН 10,0) в два приема (настаивание с каждой порцией 5 мин). Элюат доводят боратным буфером (рН 10,0) до 250 мл (V3) и снимают спектр поглощение в области 220-300 нм. Если DpH10.0 > 0,9, то производят разведение боратным буфером с рН 10,0 | и объем (V2) учитывают при расчете. Характер спектральной кривой с максимумом в области 238-240 нм является одним из признаков наличия производного барбитуровой кислоты. Для бензонала максимум поглощение лежит в области 250 нм. Затем при перемешивании в кюветы вносят по 1-2 капли концентрированной хлороводородной кислоты, чем достигается значение рH-2,0 и вновь снимают спектр в области 220-300 нм. Для количественного определения используют разность оптических плотностей ∆D = DpH10.0 — DpH2.0 для барбитуратов при 238-240 нм, а для бензонала при 250 нм.

Расчет концентраций барбитуратов производят по формуле:

где: X — количество изолированного вещества в мг в 100 г исследуемогооргана,

∆D = DpH10.0 — DpH2.0, п = навеска органа, V, — объем хлороформной вытяжки, полученный по общему ходу анализа. Другие буквенные обозначения указаны в тексте.

4. Определение барбитуратов в крови и моче. В делительную воронку помещают 1-2 мл крови и мочи, подкисляют 2 н. раствором хлороводородной кислоты до рН~2,0...2,5. Вносят 3- 5 г безводного сульфата натрия (в зависимости от объема водной фазы) и трижды экстрагируют хлороформом по 10 мл, встряхивая каждый раз, в течение 1 мин. Объединенные хлороформные извлечения промывают 10 мл фосфатного буфера (рН 7,4) Хлороформный слой отделяют, переносят в длительную воронку и барбитураты реэкстрагируют 10 мл 0,1 н. раствора едкого натра (рН 13,0). Щелочную водную фазу для лучшего отделения от следов хлороформа центрифугируют в течение 5 мин. В сухую про-бирку или колбочку помещают 5 мл центрифугата, добавляют равный обьем боратного буфера для создания рН 10,0 и снимают спектр поглощения в интервале длин волн 220-280 нм. Раствором сравнения служит боратный буфер рН 10,0. Затем в обе кюветы добавляют по 2 капли насыщенного раствора едкого натра (рН~ 13,0) и после тщательно перемешивают вновь снимают спектр в том же интервале длин волн. Для количественного определения используют разницу оптических плотностей при 260 нм.

∆D = DpH13.0-DpH10.0.

Расчет количества барбитурата производят по приведенной выше формуле, где: ∆D =DpH13.0-DpH10.0