Лекция: Некоторые теоретические положения методов изолирования токсических веществ, подкисленных водой и подкисленным спиртом.

Изучение процессов изолирования, а также анализ практики применения методов выделения токсических соединений из биологического материала экстракцией подкисленной водой или подкисленным спиртом позволяет сделать следующие выводы:

1. На степень изолирования токсического вещества из биологического материала влияет различные факторы. Одним из факторов, влияющие на степень изолирования алкалоидов при вы­делении их из биологического материала является значение рН, при которой происходить связывание токсического вещества с белками и аминокислотами.

2. Рядом ученых – А. М. Петрунькина и М. Л. Петрунькин (1928), М. А. Лисицин (1931), X. Ш. Ка­заков (1957), В.Ф.Крамаренко (1982) и другими показаны, что связывание алкалоидов с белками в организме происходит в зависимости от рН среды.

3. Белковые вещества, как производные аминокислот, в зависимости от рН среды могут диссоцироваться как кислоты и как основания. Следовательно, в живом организме имеются необхо­димые условия для взаимодействия белковых веществ с токсическими веществами основного характера (алкалои­ды и их синтетические аналоги) и с другими токсикантами кислотного характера (барбитураты, салицилаты).

4. Установлены, что токсические вещества с основными свойствами (алкалои­ды и их синтетические аналоги) связываются с бел­ками при рН, находящееся выше их изоэлектрической точки, а вещества кислотного характера (например: салициловая кислота, препараты барбитуровой кислоты) могут связываться с белками ниже их изоэлектрической точки.

5. Для полноты выделения исследуемого токсического вещества необходимо разрушение продуктов, образованных определен­ными химическими взаимодействиями ядов с белковыми и другими веществами живой или трупной ткани. В результате исследований, про­веденных В Ф. Крамаренко и сотрудниками, это достигается подкислением среды извлечения биологического материала до рН≈2,0… 2,5.

6. К жидкостям, применяемым для извлечения ядовитых веществ из биологического материала, предъявляется ряд требований — они должны:

хорошо проникать в клетки и ткани биологического материала; раз­рушать связи между ядами и белковыми веществами;

хорошо растворять соли ядовитых веществ, которые образуются в биологическом материале под влиянием кислот или щелочей, входящих в состав из­влекающих жидкостей;

растворять наименьшие количества примесей, переходящих из био­логического материала в вытяжки.

7. Обоснования применения минеральных кислот в некоторых мето­диках подвергаются сомнению, так как они могут разлагать алкалои­ды и другие «лекарственные» яды, являющиеся сложными эфирами, а также гидролизовать белковые вещества, содержащиеся в биологичес­ком материале, загрязняя вытяжки. Однако этот вопрос, по мнению ис­следователей, требует экспериментального подтверждения т.к. за относительно короткое время настаивания с разбавленными кислотами, указанные выше процессы могут и не произойти.

8. Изолирование ядовитых веществ и их метаболитов производить из двух навесок биологического материала, т.к усло­вия выделения нативных соединений могут не подходить для выделе­ния метаболитов, так как они отличаются от исходных веществ некоторыми физическими свойствами (например, растворимость при выделении экгонина).

9. Начиная с конца XIX столетия, арсенал лекарственных средств пополнились новыми синтетическими фармацевтическими препаратами, отдельные представители которых становились причиной отравления. Для выделения этих синтетических препаратов из биологического материала специальные методы не разрабатывались, а применялись методы, предложенные ранее для исследования алкалоидов.

10. При специальных заданиях химико-токсикологический анализ производится частными методами. К ним относятся метод выделенияалкалоидов подкисленной серной кислотой, метод, основанный на применении подщелоченной воды для изолирования натриевых солей барбитуратов, примененный болгарским ученым П. Валовым, метод выделения меконовой кислоты, экгонина и др.

11. Как видно из текстов приведенных выше методик изолирования алкалоидов, встречаются случаи неиспользования отдельных экстрактов в процессе выделения алкалоидов. Например, в методе В А. Крамаренко, эфирное извлечение из подкисленной вытяжки отбрасывается и не исследуется. Однако мы в нашей практической деятельности неоднократно убеждались в том, что нельзя выбрасывать ни одного полученного экстракта, так как в них могут быть обнаружены токсические вещества.

12. Кроме всего, эффективность перехода токсического вещества из тканей биологического материала в извлекающую жидкость регулируется законами диффузионного процесса. К ним относятся: площадь поверхности контакта извлекающей жидкости с биологическим материалом (достигается измельчением тканей до оптимальных размеров); температура, перемешивание, кратность извлечений и его продолжительность и др.

13. На качества извлечения оказывает влияние состояние биологического материала. Извлечения из гнилостных материалов больше загрязнен примесями различного происхождения, которое предполагает применения специальных методов очистки вытяжек из биологического материала.

7.2.21. Методы изолирования токсических соединений из биологического материала экстракцией органическими растворителями

Большую группу ядов составляют органические ядохимикаты, применяемые в сельском хозяйстве (пестициды). Наиболее часто в химико-токсикологической практике встреча­ются следующие пестициды:

• фосфорсодержащие пестициды — производные фосфорной, тиофосфорной, дитио-фосфорной и фосфоновой кислот: тиофос, трихлорметафос-3, карбофос, хлоро­фос;

• хлорорганические производные — гексахлорциклогексан, гептахлор;

• производные карбаминовой кислоты — севин;

• органические соединения ртути — алкилртутные соли;

• синтетические пиретроиды.

В настоящее время не существует единого, универсального метода изолирования ядо­химикатов из различных объектов, нет и общей схемы очистки полученных экстрактов. Даже среди определенной группы отдельные соединения могут изолироваться из объекта различными методами, хотя для большинства веществ этой группы общим свойством является растворимость в органических растворителях. Чаще всего рекомендуются ин­дивидуальные методы изолирования пестицида для каждого объекта (воздух, пищевые продукты растительного происхождения, почва, кровь, моча, внутренние органы, масла и др.). Методы очистки пестицидов, выделенных из биологических объектов, также раз­нообразны. Среди них перегонка с водяным паром, реэкстракция, кристаллизация, хро­матография в тонком слое сорбента, ионообменная хроматография и др.

7.2.22. Изолирование фосфорсодержащих пестицидов (тиофос, трихлорметафос-3, карбофос, хлорофос) из биологического материала

При изолировании первых трех пестицидов биологический объект смешивают с водой до кашицеобразной массы и настаивают с хлороформом или бензолом 3 раза по 4 и 2 ч. Экстракты объединяют, фильтруют, выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в не­большом объеме органического растворителя и исследуют.

При изолировании хлорофоса схема метода включает 2 этапа:

1-й этап. Биологический объект заливают водой, подкисленной серной кислотой, до рН=2-2,5 и настаивают 3 раза по 2 и 1 ч. Водные вытяжки центрифугируют, надо­садочную жидкость отделяют.

2-й этап. Центрифугат экстрагируют хлороформом 30 мл 4 раза, растворитель упари­вают и в остатке проводят обнаружение и количественное определение хлорофоса и его основного метаболита — дихлоруксусного альдегида.

7.2.23. Изолирование хлорорганических производных из биологических объектов

Изолирование хлорорганических производных пестицидов из биологических объектов основано на свойстве липофильности. В связи с этим навеска объекта исследования смешивают водой до кашицеобразной массы, подкисляет раствором щавелевой кислоты до рН = 2 и подвергают эстрагированию органическими растворителями несмешивающие с водой.

Изолирования летучих представителей данной группы, например, гексахлорциклогексана проводят методом перегонки с водным паром. Для этого навеску биологического объекта смеши­вают с водой до кашицеобразной массы, подкисляют раствором щавелевой кислоты до рН = 2 и подвергают перегонке с водяным паром. Холодильник промывают диэтиловым эфиром, дистиллят экстрагируют диэтиловым эфиром. Объединенные эфирные вытяжки промывают водой, испаряют и остаток анализируют.

Изолирование гептахлора из внутренних органов трупа. При отравлении гептахлором объектами исследования являются печень и почки. Навеску объекта смешивают с водой до кашицеобразной массы и настаивают с гексаном или эфиром 3 раза по 30 мин. Объединенные гексановые экстракты взбалтывают с на­сыщенным раствором сульфата натрия в 20% серной кислоте до получения бесцветной водной фазы (очистка) или обрабатывают безводным сульфатом натрия. Очищенные гек­сановые вытяжки анализируют.

Для выделения гептахлора из биологических жидкостей навеску крови или мочи экстрагируют диэтиловым эфиром или гексаном трижды. Экстракты объединяют и сме­шивают с безводным сульфатом натрия, органический растворитель испаряют и остаток исследуют на гептахлор.

7.2.24. Изолирование производных карбаминовой кислоты (севина) из внутренних органов

Навеску объекта смешивают с водой до кашицеобразной массы и настаивают с бензолом 3 раза по 4 и 2 ч. Бензольные вытяжки объединяют и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в спирте и анализируют на севин и его основной метаболит а-нафтол.

7.2.25. Изолирование синтетических пиретроидов из биологических объектов

При отравлении синтетическими пиретроидами объектами исследования могут быть кровь, моча, почки, селезенка, желудок, тонкий кишечник. При направленном анализе изолирование включает два этапа:

1-й этап. Пиретроиды экстрагируют из объекта гексаном, петролейным эфиром или смесью гексана и ацетона 9:1 или 7:3 путем взбалтывания в течение 10 мин. Экстракт очищают от примесей ледяной смесью ацетон-вода (2:1). Водный раствор фильтруют.

2-й этап. Экстракцию пиретроидов из полученного фильтрата проводят с помощью н-гексана.

При ненаправленном анализе изолирование включает также два этапа:

1-й этап. Настаивают объект с водой, подкисленной хлороводородной кислотой, до рН=2-3, центрифугируют и отделяют надосадочную жидкость.

2-й этап. Центрифугат экстрагируют органическим растворителем (диэтиловым эфи­ром, хлороформом).

7.2.26. Изолирование органических соединений ртути биологических объектов

Объектами исследования при отравлениях могут быть печень, почки, моча и кровь. Изолирование соединений ртути включает следующие этапы:

1-й этап. Навеску объекта настаивают с 3 М раствором хлороводородной кислоты 2 раза по 30-60 мин, затем смесь центрифугируют.

2-й этап. Надосадочную жидкость экстрагируют хлороформом.

Для изолирования соединений ртути из мочи вначале к объекту добавляют концен­трированную хлороводородную кислоту и настаивают 30 мин. Затем проводят трехкрат­но экстракцию хлороформом.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Какой принцип положен в основу классификации токсикологически важных веществ на группы в химико-токсикологическом анализе?

2. Как влияет рН среды на связывание алкалоидов и других азотистых оснований с белковыми веществами?

3. Как влияет рН среды на разложение соединений белковых веществ с алка­лоидами и другими азотистыми основаниями?

4. Как влияют рН среды и анионы кислот, входящих в состав извлекающих жидкостей, на изолирование алкалоидов и других азотистых оснований из биологического материала?

5. Как влияет природа растворителей (воды и этилового спирта) и рН среды на загрязнение вытяжек из биологического материала белковыми веществами и продуктами их разложения?

6. Какие способы очистки вытяжек из биологического материала от приме­сей применяются в современном химико-токсикологическом анализе?

7. Как влияет рН среды и природа органических растворителей на экстракцию алкалоидов из водных растворов и алкалоидных вытяжек?

8. Чем объясняются заниженные выходы алкалоидов и некоторых других ток­сических веществ из биологического материала?

9. Как проводится изолирование алкалоидов и других азотистых соединений из биологического материала водой, подкисленной щавелевой или серной кис­лотой, а также этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой?

10. Почему нельзя изолировать алкалоиды из биологического материала на­стаиванием с его органическими растворителями, не смешивающимися с водой?