Лекция: Эукариотическая клетка и ее генетический аппарат

Организация генома клетки эукариот. Вслед за М.Д.Голубовским [8] под генотипом будем подразумевать всю наследственную систему клетки или организма, включающую ядерные (нуклеотип) и цитоплазматические (цитотип) компоненты. Эти компоненты, в свою очередь, подразделяются на обязательные (облигатные) и необязательные (факультативные) составляющие (см. табл. 3.1).

Таблица 3.1. Облигатные и факультативные компоненты в структуре генома эукариот [8].

Поскольку в дальнейшем изложении мы остановимся на Международном проекте «Геном человека» и медицинских аспектах генетики человека, из органелл рассмотрим только митохондрии.

Структурно-функциональные компоненты митохондриального генома человека. Митохондрии – важнейшие клеточные органеллы, которые присутствуют во всех эукариотических организмах и являются энергетическими станциями клетки. В них осуществляются реакции клеточного дыхания, идущие с выделением энергии, которая запасается в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) – основной энергетической единицы всего живого [9]. Митохондрии или хондриосомы (от греч. mitos – нить, chondrion – зернышко, soma – тельце) представляют собой гранулярные или нитевидные органоиды (см. рис. 3.4). Обычно митохондрии представляют собой мелкие (длиной 0,5–3 мкм) внутриклеточные образования, располагающиеся в местах, где необходимо использование энергии для любых жизненных процессов.

Рис. 3.4. Строение и работа митохондрий (по [9]): а — митохондрии (указаны стрелкой), видимые в световом микроскопе; б — ультраструктура митохондрий: 1 — митохондриальный матрикс, 2 — внутренняя митохондриальная мембрана, 3 — межмембранное пространство, 4 — внешняя митохондриальная мембрана; в — общая схема функционирования митохондрий: при переносе электронов в цепи окисления в межмембранном пространстве накапливаются протоны и при достижении определенного потенциала возвращаются в матрикс; энергия этого потенциала тратится на синтез АТФ.

Митохондрии независимо от их величины и формы имеют универсальное строение, их ультраструктура однообразна. Митохондрии ограничены двумя мембранами. Наружная митохондриальная мембрана отделяет ее от остальной цитоплазмы. Ее толщина около 7 нм, она не бывает связана ни с какими другими мембранами цитоплазмы и замкнута сама на себя, так что представляет собой мембранный мешок. Наружную мембрану от внутренней отделяет межмембранное пространство шириной около 10–20 нм. Внутренняя мембрана (толщиной около 7 нм) ограничивает собственно внутреннее содержимое митохондрии, ее матрикс или митоплазму. Характерной чертой внутренних мембран митохондрий является их способность образовывать многочисленные выпячивания внутрь митохондрий. Такие выпячивания (кристы) чаще всего имеют вид плоских гребней.

Совокупность всех митохондрий клетки носит название хондриом. Во многих клетках хондриом представлен разрозненными многочисленными митохондриями, разбросанными довольно равномерно по всей цитоплазме. В других случаях отдельные митохондрии локализуются группами в местах интенсивной траты АТФ. Наблюдается и совершенно иной тип хондриома, когда вместо мелких одиночных разрозненных митохондрий в клетке образуется сложная митохондриальная сеть, или митохондриальный ретикулум (Reticulum mitochondriale).

Митохондрии, как и пластиды, – относительно автономные органеллы, которые имеют собственную генетическую систему [10]. В митохондриальной генетической системе зашифрованы некоторые (но не все) митохондриальные белки и большинство митохондриальных РНК (иногда за исключением нескольких маленьких РНК, в том числе части транспортных РНК, которые транспортируются в митохондрию из цитоплазмы).

Митохондриальный геном кодирует 13 субъединиц комплексов дыхательной цепи. Ядерный геном кодирует остальные белки – переносчики электронов, митохондриальные транслоказы, компоненты транспорта белков в митохондрии, факторы, необходимые для транскрипции, трансляции и репликации митохондриальной ДНК. Некоторые митохондриальные гены представлены копиями в ядерном (а у растений и в хлоропластном) геноме.

Особенность митохондриального генома многих организмов – это необычайно частое изменение структуры синтезированной РНК, так называемое РНК редактирование. Другими словами, митохондриальный геном содержит немало ошибок, исправляемых уже в процессе созревания матричных РНК. У высших растений исправляется от 3 до 15% нуклеотидов (в отдельных мРНК до 40%), у простейших – до 50%. Редактирование включает обычно замену Ц на У в строго определенных местах, но в некоторых случаях, наоборот, происходит замена У на Ц. РНК-редактирование приводит к формированию функциональных транспортных РНК митохондрий и возникло, по-видимому, как механизм, предотвращающий накопление мутаций в асексуальных генетических системах.

В митохондриях иногда наблюдается перекрывание генов. Например, в митохондриальном геноме курицы ген тирозиновой транспортной РНК перекрывается одним нуклеотидом с геном цистеиновой транспортной РНК. Этот нуклеотид исходно гуаниновый, но он подвергается редактированию и превращается в адениновый.

Системы репликации ДНК, транскрипции и трансляции различается в митохондриях разных организмов. Особенности строения рибосомных РНК митохондрий животных и человека обусловливают то, что трансляция практически не ингибируется эритромицином и хлорамфениколом (левомицетином) – мощными ингибиторами трансляции прокариот. Этим объясняется относительно невысокая токсичность данных веществ для человека и возможность их применения в качестве антибиотиков.

Поскольку митохондрии находятся в центре энергетического обмена клетки, любое нарушение в них может негативно воздействовать на основные функции организма. В настоящее время выявлено множество генетических заболеваний, связанных с нарушениями митохондриальных процессов, многие из которых обусловлены дефектами митохондриального генома [11]. Митохондриальная генетика человека в настоящее время интенсивно развивается. Митохондриальные нарушения наследуются преимущественно по материнской линии, поскольку новорожденный получает митохондрии из яйцеклетки.

Митохондриальные гены и генетический код. Исследование генома митохондрий выявило совершенно уникальные его особенности. В 1979 г. было обнаружено, что в митохондриях нередки отклонения от универсального генетического кода. Эти отклонения были найдены позже во многих организмах, особенно в митохондриях животных и грибов. Так, в митохондриях человека кодон АУА кодирует аминокислоту метионин вместо изолейцина в стандартном коде. Кодоны АГА и АГГ, в стандартном коде кодирующие аргинин, являются стоп-кодонами, а кодон УГА, в стандартном коде являющийся стоп-кодоном, кодирует триптофан. Митохондрии растений, по-видимому, используют нормальный генетический код.

Другой особенностью митохондрий является узнавание кодонов транспортными РНК, характеризующееся тем, что одна молекула узнает сразу четыре кодона. Указанное изменение митохондриального генетического кода уменьшает значимость третьего нуклеотида в кодоне и приводит к тому, что требуется меньше транспортных РНК. Всего 22 транспортных РНК достаточно для узнавания всех 64 кодонов, тогда как для обычных рибосом их должно быть не менее 32 (хотя, справедливости ради надо отметить, что в некоторых организмах найдено до 61 транспортной РНК).

Структурно-функциональные компоненты ядерного генома человека и строение ядерных генов [12]. В отличие от прокариот, чьи геномы чаще всего представлены одной кольцевой молекулой ДНК, геномы эукариот организованы существенно сложнее. Одной из отличительных особенностей геномов эукариот является наличие кластеров изофункциональных генов. Изофункциональными называются гены, продукты экспрессии которых характеризуются структурно-функциональным сходством. Например подобным кластерным образом организованы тандемно повторяющиеся гены рРНК и гистонов, представленные в геномах большим числом идентичных копий.

В состав кластеров изофункциональных генов могут входить псевдогены – так называют последовательности геномной ДНК, структурно сходные с генами, однако лишенные функциональной активности. Принято считать, что они являются испорченными остатками когда-то функциональных генов. Например, псевдоген Ψβ кластера бета-глобиновых генов человека гомологичен гену Αγ из этого же кластера, однако мутации в кодирующей части последовательности псевдогена привели к появлению стоп-кодонов во втором и третьем экзонах, что привело к потере полноценной экспрессии. Ниже в разделе о внегенной ДНК мы рассмотрим другую точку зрения на возможную эволюционную роль псевдогенов.

Еще одним принципиальным отличием генов эукариот является то, что они отделены друг от друга районами нетранскрибируемой ДНК (межгенными спейсерами). У прокариот гены также отделены друг от друга спейсерами, однако длина спейсеров эукариот существенно больше. Низкая плотность кодирующих районов – общее свойство геномов эукариот, например, для человека она составляет около 2%.

В межгенных спейсерах, а также интронах могут располагаться различные типы повторяющихся последовательностей. Например, общая длина ДНК кластера бета-глобиновых генов человека составляет 73308 пар оснований (п.о.) (EMBL AC U01317). Из них 2,8% приходится на экзоны, 6,1% – на интроны, 8,6% – на различные типы повторяющихся последовательностей. Повторяющиеся последовательности могут иметь различную длину: от нескольких десятков п.о., до нескольких сот п.о. для диспергированных повторов и тысяч п.о. – для мобильных элементов. Все повторы в геноме можно разделить на два класса:

· тандемные повторы, к которым относятся разные виды сателлитной ДНК, гены рРНК;

· диспергированные повторы, распределенные в геноме по принципу чередования с уникальными последовательностями. К этому классу относятся, в частности, различные типы перемещающихся (мобильных) элементов.

Основной причиной того, что геномы эукариот имеют низкую кодирующую плотность, является наличие огромной фракции некодирующей ДНК, представленной повторяющимися последовательностями, межгенными спейсерами и интронами, – так называемого джанка (от англ. junk – хлам, отходы). Термин «джанк» был предложен много лет назад японским ученым С.Оно, одним из создателей теории нейтральных мутаций, и прижился в генетике, потому что долгие годы считалось, что внегенная часть генома состоит исключительно из бездействующих, нефункциональных участков. Ниже, в разделе о внегенной ДНК мы рассмотрим другие представления об эволюционной роли этой части генома эукариот.

Строение генов эукариот, в отличие от прокариот, характеризуется наличием экзон-интронной структуры (см. рис. 3.5). Предшествующая гену последовательность нуклеотидов, которую узнает фермент РНК-полимераза, – это промотор; его основным элементом является сайт связывания РНК-полимеразы, занимаемый ею перед началом транскрипционного синтеза РНК. В состав первичного транскрипта – пре-мРНК входят как экзоны, так и интроны. В процессе сплайсинга интроны вырезаются из пре-мРНК. Оставшиеся же части, экзоны, объединяются в зрелую матричную РНК (мРНК), которая может транслироваться в белок. Район, узнаваемый РНК-полимеразой как финиш транскрипции, называется районом терминации транскрипции. В 3' нетранслируемом районе гена — 3'UTR может находиться также контекстный сигнал полиаденилирования.

Рис. 3.5. Общая структура гена эукариот.

Регуляторные районы генов эукариот имеют блочно-иерархическую организацию. Экспрессия гена может контролироваться следующими регуляторными районами гена: коровым промотором, энхансерами(усилителями транскрипции), или сайленсерами (подавляющими транскрипцию районами), которые могут быть расположены за многие тысячи п.о. от старта транскрипции. Каждый из перечисленных выше регуляторных районов содержит в своем составе сайты связывания транскрипционных факторов (ССТФ). Два соседних ССТФ могут представлять композиционный элемент. В этом случае их совместное действие согласовано, то есть его эффект значительно отличается от действия каждого ССТФ в отдельности.

Сайты, по которым происходит вырезание интронов, называют сайтами сплайсинга. Сплайсинг одного гена может происходить несколькими способами – это так называемый альтернативный сплайсинг. Поэтому в состав зрелых мРНК могут входить разные комбинации экзонов. Это приводит к тому, что относительно небольшое число сложных генов способно кодировать неограниченное количество белков. Для большинства зрелых мРНК размер составляет от 100–200 до 10000 п.о.

Упаковка ДНК в ядре. Известно, что ДНК может существовать в нескольких формах. Наиболее распространена in vivo B-форма ДНК, представляющая собой правозакрученную двойную спираль, состоящую из двух цепей, положение которых фиксируется водородными связями, образующимися между обращенными друг к другу азотистыми основаниями входящих в нее цепей. Направления от 3' конца к 5' концу в двух цепях, из которых состоит молекула ДНК, противоположны (т.е. цепи «антипараллельны» друг другу). Одному шагу спирали соответствует одна комплементарная пара оснований. Для B-формы ДНК на один виток спирали приходится в среднем 10.5 п.о.; поперечный размер спирали составляет 19Å. А-форма, так же как и B-форма представляет собой правозакрученную двойную спираль ДНК. В ней на виток приходится 11-12 п.о., а ее поперечный размер составляет 23 Å. Гибрид ДНК-РНК может существовать только в форме A-ДНК. Левозакрученной двойной спиралью является Z-форма ДНК. Такую форму могут образовывать полимеры вида (RY)n, в которых пурины (R=A,G) чередуются с пиримидинами (Y=C,T). Двойная спираль Z-формы имеет выраженную зигзагообразную конформацию.

Рис. 3.6. Классификация форм ДНК: B, A и Z формы.

В средней эукариотической клетке общая протяженность геномной ДНК составляет около 2 м, диаметр ее ядра всего ~10–-20 мкм. При этом совокупность генов, работающих в данной клетке, должна быть доступна для РНК-полимераз и транскрипционных факторов, а вся ДНК в делящихся клетках должна реплицироваться [13].

Сегодня известно, что упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки, ее превращение в специфический ДНК-белковый комплекс – хроматин, осуществляется в несколько этапов (рис. 3.7). Сначала нить ДНК укладывается в нуклеосомы– структуры, на которые намотаны нити молекул ДНК. При этом длина ДНК уменьшается в 6-7 раз. Нуклеосомы располагаются довольно регулярно, так что образующаяся структура напоминает бусы. Нуклеосома состоит из белков четырех типов: H2A, H2B, H3 и H4. В одну нуклеосому входят по два белка каждого типа – всего восемь белков. Гистон H1, более крупный чем другие гистоны, связывается с ДНК в месте ее входа на нуклеосому. Нуклеосома вместе с H1 называется хроматосомой. Дальнейшая компактизация хроматина ДНК достигается с помощью доменно-петлевой укладки фибрилл хроматина. Сначала нуклеосомная нить складывается в так называемую 30 нм фибриллу (соленоид или зигзагообразную нить), что обеспечивает дополнительную компактизацию в 40 раз. Затем фибрилла организуется в большие (50 и более тысяч пар нуклеотидов) петли, концы которых закрепляются на белковом скелете ядра (его часто называют ядерным матриксом). На этом этапе линейные размеры ДНК сокращаются в 700 раз. Существуют и следующие уровни компактизации ДНК, информация о которых в настоящее время весьма скудна и противоречива.

Рис. 3.7. Уровни упаковки ДНК в ядре эукариотической клетки (по [13]).

Клетки тела многоклеточных эукариот имеют диплоидный (двойной) набор хромосом, складывающийся из гаплоидных наборов хромосом отца и матери. В тканях зародышевого пути при образовании гамет гомологичные хромосомы в процессе мейоза конъюгируют друг с другом, что обеспечивает последующий процесс обмена участков хромосом – кроссинговер. Однако и в соматических клетках, в особенности у насекомых, наблюдали спаривание гомологичных хромосом. Активация экспрессии генов в результате подобных транс-взаимодействий выявлена и в клетках млекопитающих, правда, только в экспериментах с культурами клеток. Возможно, эти эффекты связаны с существованием упорядоченной пространственной организации –внутриядерных территорий активных и неактивных генов [14].

Геномная организация ядерных генов человека. Согласно современным представлениям, основой геномной организации ядерных генов эукариот являются генные сети – ансамбли скоординированно функционирующих генов, контролирующих биохимические, молекулярно-биологические, физиологические, морфологические процессы в организмах разного уровня сложности (от бактерий до человека). Концепция генных сетей активно развивается в Институте цитологии и генетики СО РАН под руководством члена-корреспондента РАН Н.А.Колчанова [15]. В генной сети можно выделить несколько обязательных типов компонентов, таких как [16]:

1) группы координированно экспрессирующихся генов (ядро сети);

2) белки, кодируемые этими генами (выполняющие как определенные структурные, транспортные, биохимические, так и регуляторные функции);

3) отрицательные и положительные обратные связи, стабилизирующие параметры генной сети на определенном уровне или, напротив, отклоняющие их от исходного значения;

4) низкомолекулярные соединения (метаболиты и др.) и различные внешние сигналы, обеспечивающие переключение состояний генной сети.

Характерной особенностью организации генных сетей является их способность к саморегуляции за счет замкнутых регуляторных контуров с отрицательными и положительными обратными связями. Молекулярной основой существования таких регуляторных контуров является наличие сайтов-мишеней в ДНК, РНК и белках, с которыми могут взаимодействовать различные молекулярные компоненты генной сети и внешние регуляторные факторы. Благодаря этим двум типам регуляторных контуров возможно поддержание определенного функционального состояния генной сети или ее переход в другой режим функционирования, в том числе под влиянием факторов внешней среды.

Для накопления информации о генных сетях, их описания и моделирования в лаборатории теоретической генетики, возглавляемой Н.А.Колчановым, разрабатывается база данных GeneNetWorks, о которой мы рассказывали в предыдущей главе. Эта система позволяет учитывать, что компоненты генной сети могут быть разнесены по различным органам, тканям, клеткам и клеточным компартментам. Кроме того, GeneNetWorks позволяет описывать различные уровни организации генной сети: молекулярный, клеточный и организменный. Анализ информации из базы данных GeneNetWorks, а также из имеющихся литературных данных позволил Н.А.Колчанову и его сотрудникам выделить несколько основных типов генных сетей:

1. Генные сети, обеспечивающие осуществление циклических процессов, например, клеточного цикла, цикла сокращения сердечной мышцы и т.д.

2. Генные сети, обеспечивающие процессы роста и дифференцировки клеток, морфогенеза тканей и органов, роста и развития организмов.

3. Генные сети, обеспечивающие гомеостаз биохимических и физиологических параметров организма.

4. Генные сети, обеспечивающие реакции организмов на изменение состояния внешней среды, например, стрессовый ответ.

Некодирующая и внегенная ДНК человека. Мы будем говорить о ДНК, являющейся составной частью большинства геномов эукариот, но не кодирующей полипептиды и хорошо известные виды РНК, – к ней относятся, как мы видели выше, интроны, спейсеры, псевдогены и бóльшая часть повторяющейся ДНК. Еще во время расшифровки генома человека исследователи столкнулись с загадкой: общее число генов в этом геноме оказалось намного меньше, чем думалось до расшифровки. До начала проекта «Геном человека» общепринятым считалось, что генов в организме должно быть тем больше, чем «сложнее» сам организм. Человеческий организм, бесспорно, сложнее организма червя. Тем не менее, по мере развертывания работ становилось все очевидней, что генов у человека не намного больше, чем у червя. На основании теоретических расчетов биоинформатиков сегодня считается, что у человека всего 25–27 тысяч генов, т.е. гораздо меньше, чем те 100 или 70 тысяч, о которых говорили до начала расшифровки генома или в ее ходе.

Сравнение распределений длин экзонов и интронов для разных видов эукариот позволяет заключить, что в направлении от низших эукариот (грибов и беспозвоночных) к высшим (позвоночным) наблюдаются следующие закономерности (см. табл. 3.2):

· средний размер экзона уменьшается;

· средний размер интрона увеличивается;

· увеличивается общее число экзонов и интронов.

Таким образом, если число генов в организме не имеет прямой связи со степенью сложности этого организма, то длина джанка, напротив, с этой сложностью связана напрямую. Поэтому можно говорить, что длина генома (то есть общая длина всех молекул ДНК) определяется именно длиной его джанка, которая действительно грубо соответствует степени сложности организма. К примеру, общая длина молекул ДНК у человека и человекообразных обезьян (она составляет около 3 млрд. п.о.) – самая большая в животном мире.

Недавно группа исследователей из американского Института генома провела сравнение геномов человека, коровы, собаки, свиньи и нескольких других видов на предмет выявления сходных участков. Таких участков, отличающихся лишь небольшими изменениями в порядке следования нуклеотидов, они обнаружили около 1200. Поскольку эволюция сохраняет их почти неизменными, можно думать, что эти участки имеют важное значение для всех перечисленных видов. И лишь около 250 из сходных (т.е. «общих» для разных видов) участков пришлись на собственно генную часть ДНК. Около 800, то есть две трети, оказались сосредоточенными в интронах. Одновременно выяснилось, что оставшиеся полтораста сегментов, «общих» для разных видов, вообще располагаются в джанке.

Таблица 3.2. Размеры геномов в зависимости от таксономической принадлежности организмов.

* – для эукариот приведен гаплоидный размер генома;

**– один из самых малых геномов у растений: примерно в 200 раз меньше, чем у большинства других геномов растений

До недавнего времени интроны считались абсолютно бесполезными для организма. Такое убеждение подкреплялось тем, что при передаче генетической информации от гена к белку информация, соответствующая интронам, просто вырезается. Однако открытие альтернативного сплайсинга показало, что интроны могут использоваться в качестве «линий разреза и склеивания». Поэтому не удивительно, что эволюция, переходя от вида к виду и все более усложняя их, сохраняет целые участки интронов почти без изменений[17].

Многие факты, полученные в последние годы, заставляют думать, что кроме хорошо изученных генов, которые у человека составляют 2% длины ДНК, есть еще множество каких-то иных генов (или действующих как гены участков), скрытых во внегенной части молекул ДНК. Эти гены тоже производят молекулы РНК, однако, молекулы РНК других типов – вспомогательные клеточные РНК, например, малые ядерные РНК [18]. Все они – гораздо меньше по размеру, чем ранее открытые информационная, рибосомная и транспортная РНК. Они не переносят информацию от генов к белкам и в этом смысле не являются «белок-кодирующими» молекулами: их функция – регулировка экспрессии самих генов. Некоторые из них вмешиваются в процесс транскрипции обычных генов, в процесс развертывания двух цепей ДНК, необходимый для такой транскрипции, и даже в строение и химический характер хромосом. Все это будет более подробно освещено в главе 4, где говорится о РНК-интерференции.