Лекция: О.И. Бедердинова, Ю.А. Водовозова

Якщо у людини є два різні алелі, то має місце гетерозиготне успадкування цього гену. В популяції людей може існувати велика кількість варіантів одного алеля, але кожна людина успадковує тільки два. Білкові продукти, утворені при експресії варіантів одного і того ж гена, називають поліморфами. Поява білків із зниженою функціональною активністю або повністю неактивних призводить до розвитку спадкових захворювань.Так, дефект у структурі гена гістидази, що каталізує дезамінування гістидину, викликає нагромадження цієї амінокислоти в крові і розвиток спадкової патології – гістидинемії, яка проявляється порушенням у розумовому та фізичному розвитку дітей.

Чинники, що спричинюють мутації (мутагени).Мутагени навколишнього середовища досить чисельні, що призводять до накопичення у наступних поколіннях спадкових захворювань. До мутагенів належать хімічні, фізичні та біологічні фактори навколишнього середовища.

Найбільш поширеними мутагенами є:

— аналоги азотистих основ – сполуки, що заміщують нормальні азотисті основи в ланцюгу ДНК (наприклад, 5 – бромурацил, 2 — амінопурин);

— хімічні мутагени – сполуки, що змінюють структуру азотистих основ нуклеїнових кислот:

а) дезамінуючі агенти – азотиста кислота, нітрити, нітрозаміни. Так, нітрити, нітрати й органічні нітрозаміни утворюють в організмі азотисту кислоту (НNО2), яка інтенсивно окиснює аміногрупи в гідроксильні.

Азотисті основи в складі ДНК можуть перетворюватися в інші, що зумовлює зміни характеру спарювання основ. Так, цитозин при дезамінуванні переходить в урацил, який під час реплікації утворює комплементарну основу з аденіном. Дезамінування аденіну і гуаніну під дією азотистої кислоти призводить до утворення відповідно гіпоксантину та ксантину.

Заміна одного нуклеотиду в ДНК може призвести до зміни смислу кодону (місенс -мутація) і, відповідно, до синтезу зміненого білка. За рахунок таких мутацій виникли аномальні форми гемоглобінів зі зміненою первинною структурою в β – ланцюгах.

Якщо в результаті заміни утворюється один із термінуючих кодонів – UAA, UAG або UGA (нонсенс — мутація), то синтез поліпептидного ланцюга обривається на цьому кодоні, утворюється незавершений білок.

б) алкілюючі агенти – сполуки, що призводять до метилування (або алкілювання) азотистих основ. Ряд хімічних речовин (похідні іприту, диметилсульфат, епоксиди, алкілнітрозаміни тощо) зумовлюють приєднання до азотистих основ нуклеотидів алкільних груп (метилу, етилу та інших). Наприклад, при метилюванні гуаніну утворюється 6 – О – метилгуанін.

Крім азотистої кислоти і алкілюючих агентів, відомі інші хімічні мутагени – інгібітори синтезу ДНК, вільні радикали, радіотоксини, аналоги пуринових і піримідинових основ, деякі антибіотики. Багато з цих сполук мають протипухлинну (антибластомну) активність і застосовуються у клінічній онкології.

ультрафіолетове (УФ-) та іонізуюче випромінювання – фізичні фактори, мутагенна активність яких пояснюється вільно- радикальними змінами азотистих основ ДНК з утворенням їх аналогів із зміненою будовою. При дії УФ — випромінювання спостерігається утворення димерів із двох сусідніх піримідинових основ, які стоять в одному полінуклеотидному ланцюгу. Частіше утворюються димери тиміну, відбувається їх зшивання ковалентно за місцем подвійного зв’язку. Утворений димер перешкоджає реплікації (протидіє просуванню ДНК – полімераз) і тому повинен бути видалений із ДНК.

8.3.4. Генна інженерія або технологія рекомбінантних ДНК.Генна інженерія, за визначенням О. Баєва, є системою експериментальних методів, що дозволяють створювати в лабораторії (у пробірці) штучні біологічні структури. Як інструменти для генно-інженерних операцій застосовуються створені самою природою ферменти: одні з них розтинають молекулу ДНК в строго певних ділянках (рестриктази), інші, навпаки, зшивають різні ділянки в єдине ціле (лігази). Кінцевою метою генної інженерії є отримання організмів (тварин і рослин) із новими спадковими властивостями за допомогою лабораторних методів.

Для досягнення цієї мети необхідно проведення величезної роботи на рівні окремого гена або генів. Ген, представлений певною ділянкою ДНК і відповідний певному білку, можна виділити з іншого організму або синтезувати хімічним, або біологічним шляхом.

Уперше в 1969 р. з Е. соli була виділена ділянка ДНК з геном, відповідальним за синтез ферменту, що каталізує засвоєння молочного цукру (лактози), — так званий лактозний оперон. Вперше здійснив Хар Гобінд Корану в 1970 р. хімічний синтез гену аланінової тРНК, що складається з 72 нуклеотидів, проте, позбавлений функціональної активності, оскільки в клітинах тРНК синтезується не в готовому вигляді, а у формі попередника. Ці дані послужили основою для синтезу гена-попередника тирозинової тРНК (з 126 нуклеотидів), хоч сама тирозинова тРНК складається з 85 нуклеотидів.

Останніми роками все більше місце займають біологічні методи синтезу генів за допомогою зворотної транскриптази (ревертази). Для цього необхідна мРНК, за допомогою якої можна відтворити відповідний ген. Цим способом синтезовані ДНК-копії на мРНК, що кодує синтез білка глобіну (людини, кролика, миші, голуба, качки), імуноглобуліну, білка кришталика ока тощо.

Наступний етап генної інженерії — перенесення генів у клітину-здійснюється трьома способами: трансформацією (перенесення генів за допомогою виділеної з клітин і звільненої від домішок ДНК), трансдукцією (перенесення генів за допомогою вірусів) і гібридизацією клітин, одержаних з різних організмів (вищих тварин, мікроорганізмів тощо) (рис. 8.38, 8.39.).

Під дією ендонуклеази R1 Е. соlі кільцеві ДНК розриваються в одній точці і утворюються лінійні нитки. Під впливом іншого ферменту — ендонуклеази (із фага) укорочуються нитки ДНК з протилежних кінців. Далі за участі ферменту кінцевої трансферази нарощуються нитки ДНК, причому в одної ДНК нові кінці містять аденілові (А), у другої — тимідилові (Т) залишки. При змішуванні молекул кінцеві залишки А і Т утворюють комплементарні пари, замикаючи лінійні молекули в кільце. Спочатку ці кільця містять чотири розриви, які потім закриваються з участю ферменту — ДНК лігази.

Дослідження у галузі генної інженерії можуть служити основою для вирішення практичних завдань охорони здоров’я та сільського господарства. Одержані в лабораторії штучні гени, крім широкого використання в мікробіології та фармацевтичній промисловості для приготування кормового білка і лікарських препаратів (інсулін, інтерферон, гормон росту, гормони щитоподібної залози, інтерферони тощо), можливо, зможуть застосовуватися при лікуванні багатьох спадкових захворювань.

Перші спроби застосування лактозного гена при галактоземії (спадкове захворювання, пов’язане з непереносністю галактози внаслідок відсутності ферменту гексозо-1-фосфат-уридилилтрансферази) вселяють надію на реальні практичні можливості генної інженерії.

Відкриття екзонів та інтронів у геномі ДНК, явища сплайсингу (формування зрілої мРНК) вказує на необхідність дотримання високої точності процедури вирізування необхідного гена з ДНК геному відповідними рестриктазами. Інакше можуть бути отримані не структурні трансльовані гени, а інтрони або ділянки екзонів, що не кодують білок.

Після цього, як були розроблені методи штучного синтезу і зшивання окремих ділянок молекули ДНК, появилася можливість конструювання і створення нових, невідомих раніше в природі організмів із наперед заданими властивостями.

Сучасна біотехнологія виявилася логічним розвитком цього напряму науки. Вона склалася на основі фундаментальних досягнень біохімії, генетики і мікробіології, відкрила широкі можливості для створення нових сортів рослин, нових порід тварин тощо.

8.3.3.1. Технологія трансплантації генів та отримання гібридних молекул ДНК.На теперішній час інтенсивно розвиваються методи, що дозволяють виділяти гени або їх фрагменти з величезних молекул ДНК, отримувати велику кількість копій цього матеріалу і використовувати його для виявлення:

— мутації в генах;

— інфікування людини бактеріальними або вірусними захворюваннями;

— носіїв патологічних генів, що являються причиною спадкових хвороб, і для ідентифікацій особистості та встановлення родоводу.

З цією метою із тканин і клітин лейкоцитів, слини, сечі, біоптатів, гістологічних зрізів, виділяють ДНК і фрагментують за допомогою гідролітичних ферментів – рестриктаз. Рестриктази впізнають відповідні короткі послідовності нуклеотидів (4-6 нуклеотидних пар) і розщеплюють дві нитки ДНК з утворенням дволанцюгових (»сліпих") або одноланцюгових («липких») кінців. Кількість кожного ферменту дуже мала, тому потрібний для досліду фермент багаторазово подвоюють (ампліфікують) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), або в складі рекомбінатної ДНК.

Рекомбінатні ДНК — ДНК, побудовані з частин різного походження. Їх отримують наступним чином: ДНК з двох різних джерел, найчастіше ДНК людини і ДНК плазміди (невеликих кільцевих молекул ДНК, здатних автономно реплікуватися в бактеріальних клітинах), або вірусу, фрагментують однією і тією ж рестриктазою з утворенням «липких» кінців. Після денатурації молекул нагріванням і наступного повільного охолодження ДНК ренатурує, і поряд з вихідними молекулами за рахунок «липких» кінців утворюється рекомбінатні молекули, що складаються з ділянок ДНК людини і плазміди (вірусу). Ці ділянки зшивають ДНК — лігазою, і гібридну плазміду (вірус) вводять в бактеріальні клітини. При вирощуванні трансформованих бактерій в культурі експресуються «чужі» гени, а з бактеріальної маси можна отримати значну кількість ДНК, мРНК і білка.

Для отримання рекомбінативних ДНК, крім фрагментів ДНК, видалених із клітин тканин, використовують ДНК, синтезовані за допомогою зворотної транскриптази або РНК — залежної ДНК — полімерази. Фермент за принципом комплементарності каталізує синтез ДНК з чотирьох дНТФ на матриці мРНК. Продукт реакції – ДНК, без інтронів, в залежності від ДНК з ядерного матеріалу клітин еукаріотів.

8.3.3.2. Клонування генів з метою одержання біотехнологічних лікарських засобів.Термін “клон” з грецької означає пагін. У сучасному розумінні процес клонування розділяють на два види: 1) клонування клітин; 2) молекулярне клонування.

Коли ми говоримо про клонування клітин, потрібно чітко розрізняти два принципово відмінні напрямки в цьому процесі. Клонування нижчих, здебільшого прокаріотичних, організмів (вірусів, бактерій, грибів або, навіть, популяцій соматичних клітин вищих організмів). В основі цього виду клонування лежить таке явище як трансдукція, а основним методом, що застосовується є технологія рекомбінантної ДНК. Зовсім іншим є клонування високоорганізованих організмів, зокрема, так популярне сьогодні клонування амфібій, ссавців, навіть людини.

Якщо говорити про одержання клонів вищих організмів, то воно значно молодше. Шістдесят років тому німецький ембріолог Ганс Шпеман, який згодом став лауреатом Нобелівської премії, вперше поставив питання про цілісність та ідентичність геному на протязі всього життя організму і запропонував метод перенесення ядра будь-якої спеціалізованої клітини в яйцеклітину, з попередньо знищеним власним ядром. Цим самим вчений відкрив нову еру в розвитку сучасної генетики, біохімії та ембріології.

Показавши тотипотентність клітин ранніх ембріонів морських їжаків та тритонів, доктор Шпеман та його колега доктор Дріш підняли питання про те, на скільки ріст ембріона впливає на модифікацію геному та на скільки диференціація геному соматичних клітин є незворотньою.

У 1952 році з яйцеклітин амфібій вченим вдалося клонувати дорослий організм, а в 1983 році вперше здійснили пересадження ядер споріднених родів мишей. У результаті приблизно 90 % дослідних зразків досягали стадії бластоцисти. Найбільший резонанс отримали результати дослідів, проведених британськими вченими під керівництвом доктора Уілмута (Wilmut), які були присвячені отриманню живого потомства після перенесення ядра, взятого з соматичної клітини дорослої тварини. Легендарна Доллі залишилась однією з восьми живих овець, отриманих з 834 успішно реконструйованих овоцитів.

Широке застосування знайшло клонування і в біотехнології. Найбільше прикладне значення сьогодні має те, яке здійснюють за допомогою вірусів, мікроорганізмів або окремо отриманих культур тканин. Клон вірусу або клітини – це така популяція, кожний організм якої походить від одного репродуктивного віріону або, відповідно, репродуктивної клітини. Всі члени такого штаму-клону генетично ідентичні один одному та материнському організму.

Вірусний клон – це популяція вірусних частинок, які утворилися в результаті реплікації однієї частинки ДНК (у випадку ретровірусів реплікує РНК). За допомогою клонування можна отримати чистий препарат одного геному, оскільки всі члени клону містять ідентичну ДНК. Ця концепція молекулярного клонування використовується при отриманні чистих препаратів конкретних молекул рекомбінантної ДНК. Щоб отримати потрібний організм з відповідним геномом, спочатку потрібно трансплантувати необхідний ген в цю клітину, з якої буде розвиватися новий штам мікроорганізмів.

Ген, необхідно ввести в клітину-реципієнт таким чином, щоб він інтегрувався з її геномом. Це дозволяє здійснити технологія рекомбінантної ДНК – набір різноманітних методів, які дозволяють встановити невідому послідовність певної ділянки ДНК або отримати задану.

Важлива роль у вирішенні проблеми штучної рекомбінації генів належить відкриттю рестрикційних ендонуклеаз. Рестриктази синтезуються деякими видами бактерій. Вони здатні впізнавати специфічні послідовності ДНК та розрізають подвійний ланцюг, де трапляються відповідні послідовності (в цьому випадку розріз зроблений між тиміном (Т) та гуаніном (G) у послідовності ТGАТСА). (рис.8.40.).

Так, якщо необхідно з'єднати дві дволанцюгові ДНК, які виділені із різних організмів, то кожну з них обробляють рестрикційною ендонуклеазою. Внаслідок цього настає розрив обох ланцюгів ДНК з утворенням у місці розрізу відкритих кінців, які будуть комплементарні між собою в обох розщеплених ДНК.

Якщо тепер змішати ці ДНК, нагріти і повільно охолодити, то їх «липкі» кінці утворять комплементарні пари основ, у результаті чого виникає нова рекомбінантна ДНК, ланцюги якої мають поодинокі розриви (рис.8.41.).

Піддаючи такі ДНК впливові ДНК-лігаз при наявності джерел енергії, одержують нову ковалентно зшиту рекомбінантну ДНК. Для з'єднання фрагментів ДНК широко застосовується ще один фермент — термінальну трансферазу. Вона здатна приєднувати до З'-кінця ланцюгів ДНК значну кількість дезоксирибонуклеотидних залишків. Термінальна трансфераза проявляє свою дію без матриці і здатна нарощувати З'-кінцеві послідовності із нуклеотидів одного типу. Отже, до 3'-кінців однієї із дволанцюгової ДНК можна додавати полі (Г)-хвости, а до З'-кінців другої — полі (Ц)-хвости. Такі хвости комплементарні між собою і за їх допомогою можна з'єднати дві ДНК за рахунок утворення комплементарних пар між основами їх липких кінців (рис.8.42.). Зшивання, з'єднаних таким способом ДНК, здійснюється ДНК-лігазою.

За допомогою цих та інших ферментів уже з'єднано багато ДНК, одержаних від різних організмів. Наприклад, ДНК мавп'ячого вірусу SV40 була вбудована в ДНК фага λ, тобто були об'єднані хромосоми тваринних і бактеріальних вірусів. Важлива роль у справі розвитку техніки одержання рекомбінантних ДНК належить опрацюванню способів введення чужих генів у клітину-господаря, де вони повинні інтегруватися у геном клітини. Для цього in vitro ген з’єднується з певною ДНК, що виконує роль провідника (вектора).

Найпоширенішими переносниками, які використовуються для внесеннячужих генів у геном кишкової палички, тобто векторами (ДНК, що проникає та реплікує всередині клітини), є плазміди і ДНК фага λ.Плазміда – додаткова кільцева молекула ДНК, яку можна знайти практично в кожного виду бактерій. У кожній плазміді знаходиться від 2000 до 100000 основ. Маленькі плазміди можуть бути наявні у клітині в кількості 20 і більше копій. Плазміди на декілька порядків менші від основної молекули ДНК. Вони мають здатність переноситися від однієї клітини до іншої і навіть від бактерій одного виду до бактерій іншого. У плазміди можна дуже легко вносити чужі гени, які потім можуть переноситися у кишкову паличку і ставати там частиною геному клітини-господаря.

Сьогодні широко застосовують клонування у тваринництві та рослинництві — створення більш продуктивних та менш вимогливих до умов існування трансгенних видів тварин та рослин. Ще одна можливість – клонування рідкісних та практично вимерлих представників флори та фауни. Проте найбільшу увагу, напевно, заслуговують трансгенні тварини-донори органів та окреме клонування органів людини.

Переваги застосування таких органів у клінічній практиці очевидні, адже при пересадці клонованого органу не потрібно думати про гальмування реакції відторгнення та можливих наслідках таких як, наприклад, рак, що часто розвивається на фоні імунодефіциту, або ниркова недостатність, яка виникає при пересадках серця, та багато інших. Клоновані органи стануть рятівними для людей, що потрапили в автокатастрофи, або для тих, кому потрібна радикальна допомога через захворювання старшого віку (“зношене” серце, хвора печінка тощо). Вже сьогодні клонування — центральний метод генної терапії.

8.3.3.3. Ланцюгова полімеразна реакція.У методі ланцюгової полімеразної реакції(ЛПР), запропонованої американським вченим К. Мюллісом (1983 р), лежить явище ампліфікації генів. Цей метод дозволяє отримати певні фрагменти (послідовності) ДНК геному людини та індентифікувати їх за нуклеотидним складом.

Для проведення ЛПР необхідні РНК – праймери, специфічні до певних ділянок ДНК, яка аналізується та ДНК –полімерази, які здатні реплікувати нуклеотидні послідовності в обох комплементарних ланцюгах, утворюючи значну кількість копій досліджуваного поліунклеотидного фрагмента. Ампліфіковані фрагменти ДНК досліджують за допомогою біохімічних методів.

Фрагменти ДНК довжиною в декілька сотень нуклеотидних пар можна ампліфікувати за допомогою ПЛР в умовах in vitro (в пробірці). Для проведення ПЛР потрібно знати нуклеотидну послідовність кінцевих ділянок фрагменту. У зв’язку з цим хімічним шляхом синтезують два праймери – одноланцюгові олігодезоксинуклеотиди, що складаються з 15 — 30 нуклеотидів, і комплементарних 3 – кінцям двох ниток копіюючої ДНК – матриці.

Реакційна суміш для отримання копій вміщує:

— матрицю – ДНК, виділену із дослідного екземпляру;

— субстрати 4-и дНТФ;

— фермент – термостабільну ДНК – полімеразу (Taq- полімеразу);

— два праймери;

— буфер для створення оптимального рН та іони Mg2+, що являються кофактором Taq- полімерази.

Праймери обмежують ділянку ДНК, яка повинна бути ампліфікована.

Кожен цикл отримання копій ДНК включає три стадії: плавлення: реакційну суміж нагрівають до 90 — 95оС, ДНК денатурує, утворюючи одноланцюгові нитки; гібридизація ДНК з праймерами: температуру знижують до 50 — 60оС і праймери комплементарно зв’язуються з нитками ДНК; елонгація: приєднання Taq- полімерази до 3' — кінців праймерів і синтез ДНК в напрямку від 5'- до 3'- кінця комплементарно ДНК — матриці.

Процес автоматизований проводиться в приладі – циклізаторі або ампліфікаторі ДНК, який дозволяє задавати потрібну кількість циклів і оптимальні часові та температурні параметри. За 25 — 30 циклів синтезується декілька мільйонів копій (рис. 8.43).

Використовуючи вказані технології і ДНК – конструкції, можна вирішувати наступні завдання:

— вирощувати модифіковані мікроорганізми як продуценти гормонів (інсуліну, гормону росту, соматостатину тощо), біологічно активні пептиди, фактори згортання крові;

— створювати нові види рослин і тварин;

— лікувати спадкові захворювння шляхом введення у клітини генів, які у пацієнтів втрачені або дефектні. Для цих цілей часто використовують полімерні носії – наночастинки, що здійснюють постачання необхідних компонентів у пошкоджені органи і тканини.

За допомогою ЛПР здійснюється так звана «ДНК-діагностика», тобто аналіз певних послідовностей ДНК у клітинах людини, що має першочергове значення в діагностиці спадкових хвороб, виявлення присутності в організмі певних вірусів (у тому числі ВІЛ) ідентифікації особистості.

8.3.4. Біологічне значення та механізми репарації ДНК.Високу мутагенну активність проявляє радіоактивне випромінювання. Фонова радіація середовища постійно зростає, що збільшує частоту мутацій у людей. За оцінками фахівців, вплив УФ – та іонізуючого випромінювання є причиною більше 10 % усіх пошкоджень ДНК. Іонізуюче випромінювання викликає розриви нуклеотидних ланцюгів і різноманітні зміни азотистих основ. Цим пояснюється летальна дія іонізуючої радіації

Забруднення навколишнього середовища різними хімічними речовинами, чужорідного походження (ксенобіотиками), які постійно впливають на ядерну генетичну ДНК. При дії хімічних речовин відбувається утворення ковалентних зв’язків між ланцюгами ДНК, дезамінування основ, відщеплення основ тощо.

Такі зміни можуть проходити в живій клітині спонтанно, тобто в результаті локальних флуктуацій теплової енергії, а також під дією фонового випромінювання (в тому числі космічного) і деяких речовин, що попадають в організм. Найчастіше проходить гідролітичне відщеплення пуринових основ (депуринізація ДНК), в результаті чого із ДНК диплоїдних клітин людини за добу втрачається біля 5·104 нуклеотидів. З меншою швидкістю (на 2 – 3 порядки) проходить дезамінування цитозину і депіримідинізація.

Вплив на геном живих організмів фізичних та хімічних чинників супроводжується нестабільністю ДНК, що зазнає постійних точкових мутацій. У зв’язку з цим в еволюції живих організмів виникли спеціальні молекулярні механізми, що протидіють постійним ушкодженням ДНК та репарують зміни в молекулярній будові ДНК.\

1. Репарація УФ-індукованих генних мутацій: пігментна ксеродерма. Відновлення нормальної структури ДНК, порушеної утворенням димерів тиміну, реалізується послідовною дією декількох ферментів.

І. Специфічна УФ — ендонуклеаза зв’язується з місцем порушення правильної двохспіральної структури ДНК і розрізає пошкоджений ланцюг біля тимінового димеру.

ІІ. Формування полідезоксирибонуклеотидної ділянки на фрагмент ДНК, що містить димер; реакція каталізується ДНК – полімеразою (у прокаріотів — ДНК –полімераза І) і полягає в приєднанні мононуклеотидів до вільного 3’ – кінця „ розрізаного” ланцюга ДНК в напрямку 5’ – 3’.

ІІІ.Олігонуклеотид з тиміновим димером відщеплюється 5’ – 3’- екзонуклеазою, а ДНК – полімераза І виконує репаративну реплікацію, тобто включає комплементарні дезоксирибонуклеотиди.

ІV. Приєднання 3’ – кінця новосинтезованого фрагменту фосфодіефірним зв’язком до основного ланцюга під дією ДНК — лігази. Таким чином, відновлюється (репарується ) первинна структура ДНК.

Процес репарації ультрафіолетових пошкоджень ДНК порушений у хворих на пігментну ксеродерму, рідкісну спадкову хворобу. Ця патологія успадковується як автосомальна рецесивна хвороба, при якій шкіра пацієнтів є дуже чутливою до пошкоджуючої дії сонячного проміння, що може призвести до раку шкіри. Виявлено декілька варіантів пігментної ксеродерми, зумовлених дефектами різних ферментів системи репарації. При більш поширеній формі дефектна УФ- ендоунклеаза.

2. Репарації дезамінування цитозину. Дезамінування цитозину призводить до утворення урацилу. У результаті цього процесу (заміни цитозину на урацил ) в комплементарному ланцюгу ДНК при реплікації також відбувається заміна відповідно замість гуаніну включається аденін. Дочірня молекула ДНК буде містити пару нуклеотидів А –Т замість пари Г-Ц, тобто відбудеться мутація типу заміни.

Репарація такої мутації включає в себе:

а) видалення з ланцюга ДНК „неправильної” основи за рахунок відщеплення урацилу ДНК – глікозидазою. Є декілька ДНК – глікозидаз, які видаляють специфічно урацил, гіпоксантин, чи іншу змінену основу;

б) гідроліз фосфодіефірного зв’язкуендонуклеазою біля місця, де відщеплена основа;

в) ДНК –полімераза І добудовує ланцюг ДНК за рахунок „правильної” азотистої основи на місці видаленої основи;

г) зшивання розриву в ланцюгу ДНК – лігазою.

О.И. Бедердинова, Ю.А. Водовозова