Реферат: Свечение сопровождающее биологические реакции

--PAGE_BREAK--Почему оно "сверхслабое", это свечение клеток и тканей?
Чем же объясняется низкая интенсивность хемилюминесценции, сопровождающей реакции свободных радикалов?

Причин целых три. Во-первых, сама концентрация радикалов в биологических системах очень мала из-за их высокой химической активности, поэтому малы и скорости реакций, сопровождающихся свечением.  Во-вторых, не всякое химическое взаимодействие радикалов непременно приводит к образованию электронно-возбужденных молекул продуктов реакции, как это изображено на рис. 3 (4). Напротив, в подавляющем большинстве окислительно-восстановительных взаимодействий между молекулами или радикалами электрон переносится не на уровень возбужденного состояния, я на самый нижний свободный уровень, и последующего высвечивания кванта не происходит.  В третьих, даже если и образовалась возбужденная молекула продукта, вероятность того, что высветится квант, а не произойдет растраты энергии в тепло, тоже обычно очень мала.

Две последние причины приводят к тому, что квантовый выход хемилюминесценции в случае, скажем, реакции двух перекисных радикалов составляет всего 10-8-10-10. Это происходит потому, что квантовый выход образования возбужденных молекул продукта
равен всего 10-4-10-5, а квантовый выход люминесценции продукта
составляет для кетонов, образующихся при взаимодействии перекисных радикалов, в свою очередь, тоже около 10-4 — 10 — 5.

Вот и выходит, что общий квантовый выход хемилюминесценции составляет всего-навсего 10-8-10-10.

Применение собственной (неактивированной) хемилюминесценции.
Почти сразу после того, как появились первые работы по собственной хемилюминесценции клеток и тканей, были сделаны попытки использовать

этот показатель в целях клинической диагностики. По понятным причинам первыми объектами были цельная кровь и плазма крови больных людей. Поскольку собственное свечение было очень слабым и измерять его было трудно, было сделано много попыток усилить это свечение: к плазме крови добавляли красители, перекись водорода, ионы двухвалентного железа и т.д. [4]. Природа химических реакций, обусловливающих свечение, была понятна далеко не всегда, но авторов предложений это не слишком беспокоило: лишь бы была разница между больными и здоровыми, а еще лучше между разными группами больных. Скорее удивительно, что при ряде патологий разница была довольно существенной. Пожалуй, наибольшее число публикаций в литературе посвящено свечению плазмы крови, к которой для инициирования цепного окисления липидов добавляли соли двухвалентного железа. Амплитуда сигнала хемилюминесценции хорошо коррелировала с количеством продуктов перекисного окисления липидов, определяемых химическим методом, и зависела от липидного состава плазмы крови и концентрации в ней антиоксидантов, то есть веществ, тормозящих процессы, идущие с участием

свободных радикалов. Во многих случаях данные таких анализов были признаны ценными в качестве дополнительных при постановке врачом диагноза заболевания, контроля за эффективностью лечения и прогноза течения болезни.  Все же измерение неактивированной хемилюминесценции в широкую клиническую практику пока не вошло в отличие от хемилюминесценции в присутствии активаторов.
В присутствии определенных соединений, обычно называемых в отечественной литературе «активаторами», свечение клеток и тканей может быть усилено на несколько порядков величины. Наибольшее распространение получило измерение хемилюминесценции, связанной с выделением клетками активных форм кислорода (к которым относятся супероксид, гидроксильный радикал, перекись водорода и гипохлорит): хемилюминесценция наблюдается в присутствии активаторов люминола и люцигенина. Активированная хемилюминесценция довольно широко применяется в клиническом биохимическом анализе.


    продолжение
--PAGE_BREAK--Активированная хемилюминесценция


   Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и не случайно получила название "сверхслабого свечения". Это оказалось главным и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию собственной хемилюминесценции в аналитических целях.

   Значительное распространение получило однако измерение хемилюминесценции в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной литературе общее название «активаторов», а за рубежом — «усилителей» (enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать химическими и физическими активаторами .

   Химические активаторы ХЛ — это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.

Наблюдаемое при этом hemilum связано с переходом молекул в основное состояние., что приводит к высвечиванию фотонов:

Активатор
+ радикалы
®
продукт*
®
продукт + фотон

   Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид, см. Рис. 4) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)]   Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся hemilumм, но тем не менее многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулыпродукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

Радикалы
®
продукт*
®
продукт+ фотон 1 (неактивированная ХЛ)

Продукт* + активатор® продукт + активатор*® фотон 2 (активированная ХЛ)

Хемилюминесцентный иммунный анализ
   По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченных субстратов или антител используются субстраты и антитела,«меченные» соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза).

   Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, т. е. низкомолекулярному соединению либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), во втором — ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По русски это соответствовало бы ХИА (Хемилюминесцентный Иммунный Анализ) и ИХМА (Иммуно-ХемилюминоМетрический Анализ).

   Оба метода направлены на определение биологически-важных низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.

   При использовании метода CIA к раствору, содержащему интересующее нас анализируемое соединение (обозначим его как A) добавляют определенное количество того-же, но ХЛ-меченного соединения (обозначим его как A*) и антитела (анти-A). Образуется смесь меченных и немеченных иммунных комплексов (A-анти-Aи A*-анти-A, соответственно):

A + A* + анти-A
®
A-анти-A + A*-анти-A.


   Очень важно, что пропорция между меченным и немеченым иммунными комплексами зависит от того, сколько меченного антигена мы добавили (A*) и сколько немеченого было в исследуемой пробе (A), а именно: чем больше было немеченого антигена, тем меньше доля меченных антител.

   Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить количество A*-анти-A по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем меньше, чем больше было немеченых антигена A (т. е. анализируемого вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным, предварительно строят калибровочную кривую, т. е. измеряют зависимость интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора изучаемого вещества A. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с неизвестной концентрацией антигена (A), повторяя те же процедуры, и по калибровочной кривой находят концентрацию A.

   При использовании метода ICMA берут избыток ХЛ-меченного антитела (анти-A*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (A). Образуется ХЛ-меченный иммунный комплекс:

A + анти-A*
®
A-анти-A*

   Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем больше было анализируемого вещества A в пробе. Для количественного анализа и здесь предварительно строят калибровочную кривую.

   В обоих методах одна из практических трудностей — это очистка иммунных комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы здесь рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в использовании порошка сорбента (см. Рис. 6 В), к поверхности которого «пришиты» (т. е. присоединены ковалентной химической связью) антитела канти-А (назовем иханти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс(«сандвич»):(анти-анти-А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество меченного антигена.
Биолюминесценция

   Биолюминесценция — (БЛ) — это hemilum живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся hemilumм, весьма различен у разных видов; однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом, называемым люциферазой.

С развитием техники измерения очень слабых световых потоков стало ясно, что свечение при химических реакциях (хемилюминесценция) — не такая уж экзотика. Слабое свечение сопровождает по существу все химические реакции, идущие с участием свободных радикалов. Собственное свечение животных клеток и тканей обусловлено преимущественно реакциями цепного окисления липидов и реакциями, сопровождающими взаимодействие окиси азота и супероксидного радикала.

Известное с древних времен видимое простым глазом свечение некоторых организмов, например светляка, которое называют биолюминесценцией, также нашло широкое применение в клинических анализах и медико-биологических научных исследованиях.
    продолжение
--PAGE_BREAK--