Реферат: Ферментативная кинетика

Ферментативный катализ существенно отличается от неферментатив­ного, в связи с чем в кинетике ферментативных реакций разработаны совершенно особые закономерности. Они позволяют выделить фермен­тативную кинетику в самостоятельный раздел химической кинетики, в котором изучается зависимость скорости реакций, катализируемых фер­ментами, от концентрации реагирующих веществ (ферментов и субстра­тов) и от условий их взаимодействия (температуры, рН, концентрации

коферментов и кофакторов, наличия различных эффекторов: активато­ров и ингибиторов).

Изучение кинетики ферментативного действия имеет важное теоре­тическое значение, поскольку только с позиций кинетики можно подойти к решению вопроса о механизме ферментативного действия. Но оно также необходимо с практических позиций, так как только имея определенные сведения о кинетике действия того или иного фермента, можно подо­брать оптимальные условия для его работы, а также влиять на его актив­ность в заданном направлении на различных стадиях технологического процесса.

Вопросы, связанные с кинетикой ферментативных реакций, деталь­но изложены в специальных разделах биохимии и энзимологии, поэто­му основное внимание уделим тем положениям, которые необходимы для грамотного подхода к работе с ферментами: подбору условий для определения активности фермента, определению начальной скорости ферментативной реакции, выбору субстрата, определению его насыща­ющей концентрации, оптимуму действия температуры и рН, влиянию кофакторов, активаторов и ингибиторов.

Наличие фермента в растворе или экстракте можно определить исхо­дя из скорости катализируемой им реакции, о которой можно судить либо по накоплению продуктов реакции, либо по убыли субстрата.

В большинстве своем ферментативные реакции являются реакциями смешанного порядка. Типичная кривая хода ферментативной реакции (рис. 8.1) имеет следующий вид:

Таким образом, ход ферментативной реакции во времени не может быть описан одним математическим уравнением, поскольку все фермен­тативные реакции в самом начале своего протекания (когда имеется из­быток субстрата и образовалось мало продуктов реакции) являются ре-

акциями нулевого порядка, и только потом они приобретают характер реакции первого или второго порядка. Скорость реакции нулевого по­рядка со временем не меняется, зависимость количества образовавшего­ся продукта от времени остается прямо пропорциональной (см. рис. 8.2). Для реакций первого порядка скорость реакции в каждый данный мо­мент времени пропорциональна имеющейся в наличии концентрации субстрата, а следовательно, наблюдается постоянное падение скорости реакции с течением времени (см. рис. 8.3).

Для того чтобы правильно определить потенциальные возможности данного фермента как катализатора, нужно учитывать скорость фермен­тативной реакции в тот момент времени, когда факторы, замедляющие скорость ферментативной реакции (нехватка субстрата, специфическое ингибирование продуктами реакции, частичная тепловая денатурация фермента и др.), не успевают проявить свое действие и наблюдается пря­мая пропорциональная зависимость между продуктами реакции и вре­менем.

Такая скорость называется начальной скоростью фермен­тативной реакции и обозначается Vo.

На практике Voопределяют графическим методом, для чего строят кривую хода ферментативной реакции во времени. Начальная скорость определяется как тангенс угла наклона касательной, проведенной из на­чала координат к кривой хода ферментативной реакции (см. рис. 8.1).

Vo=tg a

При работе с конкретным ферментом длительность реакции следует выбирать исходя из экспериментальных данных, по начальной скорости реакции.

В зависимости от задачи, которая стоит перед исследователями или технологами, теми, кто работает с ферментами, выбирается тот или иной подход в этой работе. Имеется в виду следующее.

1. Если необходимо выделить и охарактеризовать фермент из какого-либо биологического объекта, пищевого сырья, следует применить либо известные схемы выделения и очистки, или разработать оптимальную схему для данного фермента, варьируя и испытывая различные сочета­ния основных этапов очистки и выделения ферментов (белков): экстрак­цию, различные режимы осаждения, гель-хроматографию и другие ме­тоды, основанные на различиях в физико-химических характеристиках отдельных ферментов (см. также гл. 2). При этом на каждом этапе выде­ления и очистки следует характеризовать ферментный препарат по фер­ментативной активности и содержанию белка. В этом случае определе­ние ферментативной активности (определение Vo) проводят с использо­ванием стандартного субстрата; выявляют оптимальные значения рН и температуры. И все дальнейшие исследования проводят при насыщаю­щей концентрации субстрата, оптимуме температуры и рН. Изучение влияния специфических активаторов и ингибиторов позволяет в этом случае получить ценные сведения о строении активного центра и воз­можном механизме каталитического действия. Здесь необходимо под­черкнуть важность тщательного методического подхода при работе с фер­ментами. Не следует жалеть времени и усилий на выбор режима экстрак­ции (продолжительность, температура, экстрагент, тип экстракции — исчерпывающая или нет), выбор методики определения активности, ее отработку и возможную модификацию для данного конкретного объек­та исследования; кроме того, работа с ферментами различной степени очистки также имеет свои особенности, свою специфику: они обладают разной рН- и термостабильностью и, помимо этого, могут по-разному реагировать на воздействие различных факторов.

2. Если задача заключается в определении того, каким образом будет вести себя данный фермент (ферментный препарат) в конкретном режи­ме рассматриваемой пищевой технологии, необходимо проводить иссле­дование ферментативного действия при условиях данного технологичес­кого процесса (концентрация субстрата, длительность, рН, температура, влажность), изучить влияние различных компонентов пищевого сырья и используемых добавок на активность фермента с целью определить воз­можность и способы влияния на ферментативный процесс в желаемом направлении.

Перейдем к рассмотрению факторов, влияющих на скорость фермен­тативных реакций.