Реферат: Витамины В12 и В15

--PAGE_BREAK--  Фактор В   Исследователи из лаборатории Глаксо нашли, что молекулу витамина можно аккуратно разделить на две части кратковременным нагреванием с концентрированной соляной кислотой или, еще лучше, с хлорной кислотой. При тщательно контролируемых условиях (например, 5 мин при 65°) амидные группы почти не подвергались гидролизу и главными продуктами были, нуклеотид и неизмененная остальная часть молекулы. Последний продукт сохранял микробиологическую активность и оказался идентичным природному фактору, выделенному из содержимого рубца жвачных. В присутствии цианида растворы этого вещества имели пурпурную окраску даже при слабо кислой реакции среды. Спектр поглощения был очень сходен со спектром дицианкобаламина, так что в этом состоянии вещество почти наверное содержало два остатка цианида, соединенных координационной связью с кобальтом. Однако в то время как дицианкобаламин имел кислотные свойства, новое соединение было нейтральным. Причина такого различия состояла в отщеплении кислого нуклеотидного остатка. Это наблюдение по существу явилось главным основанием для представления о витамине B 12 как внутренней соли.Ряд кислот, образующихся при гидролизе амидных групп в факторе В, обладал той же относительной стабильностью в их дициано-конфигурации.Были получены указания на то, что существует 7-я карбоксильная группа, связанная не с аммиаком, а через амин с нуклеотидом. Это подтверждало более раннее предположение о том, что аминопропиловый спирт служит мостиком между двумя частями молекулы, будучи соединенным амидной связью с одной из цепей пропионовой кислоты в планарной группе и эфирной связью — с фосфорной кислотой. В кислых растворах (с рН примерно менее 3) фактор В теряет обе группы цианида и ведет себя как основание. Соответствующие кислоты ведут себя сходным образом, так как карбоксильные группы не подвергаются заметной ионизации. Поэтому все вещества, не содержащие нуклеотида, можно отделить от веществ, еще сохранивших его.
Щелочной гидролиз   Жесткий щелочной гидролиз приводит к отщеплению 5,6-диметилбензимидазола и образованию дилактампента- и монолактамгексакарбоновых кислот. При обработке витамина B 12 перекисью водорода и разведенной щелочью на холоду и получаются микробиологически активные кислые продукты красного цвета. Реакция состоит в гидролизе, катализируемом перекисью водорода. Однако полученные кристаллические продукты, по-видимому, представляли собой смеси моно- и дикарбоновых кислот, образовавшихся в результате мягкого гидролиза, с неизмененным витамином B 12, который обусловливал их биологическую активность. Под действием холодной разведенной щелочи, по-видимому, образуются те же продукты, что и при мягком кислотном гидролизе. Однако в присутствии горячей щелочи реакция идет по-иному. Если нагревать витамин B 12 в растворе NaOH в отсутствие кислорода, то окраска становится коричневой, а затем приобретает зеленоватый оттенок, это может указывать на уменьшение валентности атома кобальта, сопровождающееся окислением какой-то другой части молекулы. При доступе воздуха цвет снова становится красным. Кратковременное кипячение со щелочью при доступе воздуха дает в качестве главного продукта нейтральное кристаллизующееся красное вещество. Оно почти неотличимо от витамина B 12 по физическим свойствам, но не обладает микробиологической активностью. Структура этого соединения была выяснена главным образом путем рентгеноструктурного анализа кристаллов. Продукт, по-видимому, содержит лактамное кольцо, имеющее 2 общих атома с кольцом В и образующееся из ацетамидной цепи; остальная часть молекулы такая же, что и в самом витамине. Добавление тиогликолата натрия или цианида натрия к раствору витамина в основном защищает его от воздействия щелочи и кислорода. Полагают, что реакция протекает при участии свободных радикалов. Производное, содержащее лактам, было названо дегидровитамином B 12. Лактамное кольцо чрезвычайно устойчиво и при дальнейшем воздействии щелочи сохраняется.
При гидролизе последовательно отщепляются остающиеся амидные группы и нуклеотид. Таким образом, получаются два ряда кислот – с нуклеотидом и без нуклеотида, — но все они отличаются от соответствующих продуктов кислотного гидролиза.
Конечным продуктом щелочного гидролиза является гексакарбоновая кислота, а не гептакарбоновая, как при кислотном гидролизе. Это связано с участием одной из потенциальных кислотных групп в построении лактамного кольца.
Основное значение этого кристаллического продукта распада состоит в использовании его для рентгеноструктурного анализа.
Продукты окисления   Исследование гидролиза дало ценные сведения о том, что можно было бы назвать периферией молекулы. Гораздо труднее оказалось изучить химическими методами структуру части молекулы, непосредственно окружающей атом кобальта. Кембриджская группа показала, что среди продуктов окисления витамина B 12 нельзя обнаружить амида малеиновой кислоты, так что вряд ли можно было относить витамин к истинным порфиринам. Но эти исследователи выделили в довольно большом количестве оксамовую кислоту.
Единственные азотсодержащие продукты расщепления «ядра» молекулы выделили в 1955 г. Фолкерс и сотр. Контролируемое окисление хроматом натрия в уксусной кислоте привело к образованию двух продуктов, изображенных на рисунке 6 (1 и 2). Полагали, что они образуются из группировки, имеющей пирролидиновую, пирролиновую или пирролениновую структуру (рис. 6, 3). Это были первые химические данные, указывающие на присутствие пирролоподобной структуры в молекуле, если не считать более ранних данных по пиролизу, позволявших предполагать такую структуру. Несколько позже был выделен и соответствующий продукт, содержащий амидную группу (амид кислоты, представленной на рис. 6, 2). Это явилось прямым химическим подтверждением местоположения, по крайней мере, одной из амидных групп.
При окислении цианкобаламина Н 2 О 2 в среде с рН меньше семи наблюдается выход продуктов, обладающих антагонистическим биологическим действием для lactobacillus leichmannii, в отличие от ростового для Euglena gracilis.
При окислении перманганатом калия отщепляется синильная кислота, а также образуются уксусная кислота, щавелевая кислота и ее амид, бутандиовая кислота, 2-метилбутандиовая и 2,2-диметилпропандиовая кислоты.
Восстановление витамина B 12   При каталитическом гидрировании на платиновом катализаторе цианкобаламин присоединяет пять атомов водорода и отщепляет метиламин, кобальт переходит в двухвалентное состояние с образованием т. н. В 12 r. При длительном восстановлении и при использовании более сильных восстановителей, таких как ацетат хрома при рН 9,5 или борогидрид натрия получают так называемый В 12 s, содержащий одновалентный кобальт. Восстановление внесло разочаровывающе малый вклад в наши знания о строении витамина, и даже теперь детальная структура продуктов восстановления еще достаточно не выяснена. Обработка водородом в качестве катализатора или некоторыми другими восстановительными агентами вызывает переход окраски в коричневую и, наконец, в серо-зеленую. Эти изменения, за исключением потери цианида, обратимы при контакте с кислородом воздуха, причем образуется витамин B 12а. Вопрос об изменениях валентности кобальта, происходящих при восстановлении. Работа Бивена и Джонсона, появившаяся после опубликования предположительной структуры витамина, пролила некоторый свет на не решенный еще вопрос о том, содержит он 5 или 6 сопряженных двойных связей.
Обратимое восстановление легко продемонстрировать, добавляя к щелочному раствору витамина B 12 тиогликолевую кислоту. Красная окраска медленно переходит в оранжево-бурую; после встряхивания раствора в присутствии воздуха она тотчас же вновь становится красной. По мере использования кислорода снова медленно появляется цвет восстановленного витамина B 12.
Эти изменения окраски можно повторно вызывать почти до бесконечности: окончательный результат состоит в том, что витамин катализирует окисление тиогликолевой кислоты (по-видимому, до дисульфида) кислородом воздуха
Реакция с галогенами   Хлор обесцвечивает раствор цианкобаламина, другие галогены – нет. Продуктом хлорирования является фиолетовое кристаллическое вещество. Энергичное хлорирование витамина B 12 давало продукт, содержащий 30% хлора, природа его не была охарактеризована точнее. Петров и сотр. описали ряд продуктов, образующихся при обработке витамина хлором или хлорамином Т, которые можно было разделить методом хроматографии. Эти вещества имели пурпурный цвет, переходящий при избытке цианида в голубой, и содержали 2 атома хлора в молекуле. Воздействие одной молекулы хлорамина Т или брома дает в качестве главного продукта нейтральное кристаллизующееся вещество красного цвета. По физическим свойствам оно было очень сходно с витамином B 12, но не обладало микробиологической активностью. Электрофорез и инфракрасная спектроскопия доказали, что это был лактон; полагают, что его строение идентично строению лактама показанного на рис. 5, только вместо NH следует поставить О. Образование лактона, по-видимому, связано с промежуточным образованием иона карбония в активированном β-положении кольца В. Йод действует на витамин B 12 только в щелочных растворах, и при этом образуются как лактам, так и лактон, относительные количества которых зависят от концентрации щелочи и йода. Дальнейшая обработка хлорамином Т или бромом вела к образованию пурпурных веществ, которые становились голубыми при избытке цианида и содержали в молекуле соответственно хлор или бром. Эти продукты не были полностью охарактеризованы, но сходное вещество, возникавшее при действии хлорамина Т на лактам (дегидровитамин B 12 ), было изучено в Кембридже, и оказалось, что оно содержит только один атом хлора. Полагают, что хлор замещал водород при мезоуглеродном атоме между кольцами В и С. Эта работа в сочетании с другими данными помогла установить, что в молекуле витамина имеется 6 сопряженных двойных связей, а не 5, как предполагалось вначале
Метилирование   При действии избытка СН 3 — HgJ на J Cbl в спиртовом растворе при температуре 65 о С в течение трех часов можно получить метилкобаламин с выходом около 50%. Вообще реакциями корриноидов с сильными нуклеофилами получают соответствующие органокорриноиды. Между диметилсульфатом и самим витамином B 12 никакой реакции не происходит, так как атом азота участвует в координационной связи с кобальтом. Эта связь должна быть сначала разорвана путем превращения витамина B 12 в дицианкобаламин; даже и после этого реакция зависит от значения рН. Образующийся при этом четвертичный азот обусловливает возникновение добавочной основной группы в молекуле дицианида, которая в результате этого, обладает нейтральной реакцией (а не кислой, как молекула дицианкобаламина); эта структура устойчива в кислых растворах, так как метилирование препятствует образованию координационной связи между N3 и Со. Эта реакция была использована для изучения более сложных свойств аналога витамина B 12 – фактора III, который может быть метилирован или в любом из двух положений или в обоих одновременно.
  Рентгеноструктурный анализ   Изучение витамина B12 методом рентгеноструктурного анализа начала Дороти Ходжкин в Оксфорде в 1948 г ., как только были получены первые кристаллы. Независимо подобную же работу проводил Уайт в Принстоне; позже обе группы исследователей объединили свои силы. Трудоемкие вычисления на основе результатов измерения отражении рентгеновских лучей позволили составить карты электронной плотности в трех измерениях. Постепенно, в несколько последовательных этапов, по мере того как определялось положение все большего числа атомов в структуре, расчеты уточнялись. Вся программа работы с витамином B 12 и теми его аналогами, которые были получены, потребовала примерно около 10 млн. вычислений. Для этого на последних этапах пришлось использовать электронные счетные машины. Никогда еще рентгеноструктурный анализ не применялся для изучения структуры столь сложной молекулы, и полный успех этой программы изучения явился замечательным достижением, несколько смутившим химиков-органиков и, кажется, удивившим даже самих специалистов по рентгеноструктурному анализу. Как заметила Дороти Ходжкин, «возможность записать химическую структуру главным образом на основании чисто кристаллографических данных о размещении атомов в пространстве – и притом для такой устрашающе сложной молекулы — это для всякого кристаллографа нечто похожее на мечту». Огромное преимущество этого метода состояло в том, что в отличие от химических методов он «работает» от центра к периферии. Иными словами, относительно тяжелый атом кобальта с наибольшей точностью указывал положение ближайших к нему атомов, а именно атомов макрокольца. Когда работа приближалась к завершению, оказалось, что единственными атомами, положение которых оставалось несколько сомнительным, были те, для которых оно было выяснено Фолкерсом и его сотрудниками в результате изучения продуктов окисления витамина. Вычисления, относившиеся к самому витамину B 12, были на время отложены, когда исследователи смогли получить кристаллическую гексакарбоновую кислоту. Это более простое соединение неожиданно легко поддавалось рентгеноструктурному анализу, в связи с чем и были достигнуты большие успехи. К счастью, основные структурные особенности этого вещества и самого витамина оказались идентичными, так что исследования этих веществ взаимно дополняли друг друга. Однако они в обоих случаях независимо привели к весьма редкой структуре макрокольца. Макрокольцо содержит 4 восстановленных пиррольных кольца с прямой α-α-связьюю между кольцами А и D. Дальнейшие уточнения в расчётах сделались возможными в результате изучения двух кобаламинов, содержащих относительно тяжелые атомы, а именно производных тиоцианата и селеноцианата; позже для этой же цели был использован аналог витамина B 12, содержавший два атома хлора на месте метильных групп у бензиминазола. Наконец, выяснилась природа боковых цепей, и можно было почти с полной уверенностью написать всю структурную формулу. Все оставшиеся сомнения были, по-видимому, разрешены дальнейшими вычислениями, позволившими даже установить, что в макрокольце 6 двойных связей.
  Устойчивость   В литературе накопилось много данных об устойчивости витамина B 12 к действию как реактивов, так и лекарственных препаратов; многие из этих данных можно теперь истолковать, исходя из строения и реактивности различных частей молекулы витамина. Кристаллический цианкобаламин в твердом состоянии устойчив даже при действии температуры 100° в течение нескольких часов. По Березовскому, при нагревании кристаллического цианкобаламина при 100° происходит медленное разложение. В водных растворах он наиболее устойчив при рН от 4 до 6 (по Березовскому до 7); в этих пределах рН растворы можно стерилизовать автоклавированием при 120° с потерей лишь нескольких процентов активности. При pH 9 происходит быстрое разложение (примерно 90% в сутки). Аквокобаламин менее устойчив, особенно в щелочном растворе, но оба вещества инактивируются примерно на 90% в течение 1 часа при 100° при рН 8. Нагревание в сильно щелочном растворе использовали для количественного разрушения витамина B 12 с целью контроля при некоторых методах микробиологического определения активности. Однако в неочищенных препаратах некоторые восстанавливающие вещества могут оказывать защитное действие. Нейтральные или слегка кислые растворы витамина B 12 при комнатной температуре в темноте сохраняются годами, только в очень сильно разведенных растворах идет медленный гидролиз с образованием небольших количеств фактора В. В сильно кислых и, особенно в щелочных растворах при комнатной температуре происходит медленный гидролиз до карбоновых кислот. На свету цианид медленно отщепляется и образуется оксикобаламин, но при выдерживании раствора в темноте происходит обратный процесс. Длительное воздействие солнечного света ведет к необратимому разрушению. Характер действия восстановителей не всегда можно предсказать с уверенностью. Утверждают, что тиоловые соединения в низких концентрациях защищают витамин от разрушения, и их даже используют иногда с этой целью при микробиологических определениях, однако в больших количествах они сами могут вызвать разрушение витамина. Сульфит также рекомендовали применять для защиты Кобаламинов, особенно оксикобаламина. Аскорбиновая кислота действует не так, как другие, восстановители. Она довольно быстро разрушает витамин B 12b, но почти не действует на витамин B 12. Данное наблюдение использовали при анализе смесей этих двух веществ, но такой метод пригоден лишь для сравнительно чистых растворов. В печеночных экстрактах содержится защитный фактор, которым оказалось железо; другие металлы, например медь, катализируют реакцию. В сухих лекарственных препаратах витамин B 12 устойчив при растирании в порошок с хлористым натрием или с маннитом. Растворы можно стабилизировать фенолом, подвергнутым двойной перегонке, хотя примеси, содержащиеся иногда в феноле, могут вызывать разрушение витамина. Совместное присутствие тиамина (витамина B 1 ) и никотинамида (или никотиновой кислоты) ведет к медленному разрушению витамина B 12 в растворе. Железо защищает витамин В 12 от взаимодействия с никотиновой кислотой
    продолжение
--PAGE_BREAK--  Механизм действия   Недостаток в пище витамина B 12 приводит к макроцитарной мегалобластической анемии. Нарушается работа нервной системы, наблюдается резкое снижение кислотности желудочного сока. Впрочем, авитаминоз В 12 может развиться даже при полноценном питании, т. к. для процесса всасывания витамина в тонкой кишке обязательно наличие в желудочном соке особого белка – гастромукопротеина (фактор Касла). В полном соответствии с буквальным переводом своего латинского названия, этот белок выделяется стенками желудка, теми же клетками, которые выделяют кислоту. Фактор Касла специфически связывает витамин В12. Точная роль этого фактора не выяснена. Полагают, что в составе комплекса с гастромукопротеином витамин всасывается в тонком кишечнике и поступает в кровь портальной системы в комплексе с транскобаламинами I и II, при этом фактор Касла гидролизуется. Когда биохимики привыкли к мысли, что витамин В 12 не просто специфический антипернициозный фактор, а один из витаминов группы В, они стали предполагать, что он подобно другим водорастворимым витаминам окажется кофактором по крайней мере в одной ферментной системе. Но вопреки ожиданию функции, приписываемые витамину B 12 различными исследователями, оказались столь многочисленными и разнообразными, что трудно было представить себе, как все они могли быть связаны с такой ролью кофактора. Поэтому стали искать его основную функцию. Например, казалось вероятным, что он каким-то образом ответствен за поддержание сульфгидрильных соединений в восстановленном реактивном состоянии; он мог бы, скажем, «активировать» различные SH-ферменты, препятствуя их окислению в неактивные S-S-формы. Или если он связан с синтезом белка, он был бы необходим для синтеза белковой части (апофермента) ряда ферментов. Позднейшие исследования, особенно с применением изотопов, поставили под сомнение некоторые из приписываемых витамину В 12 функций и выдвинули на первый план другие. Однако ряд новейших результатов еще не подтвержден.
  Отношение к сульфгидрильным ферментам   Влияние концентрата витамина B 12 на восстановление некоторых S-S-соединений в SH-форму изучал в o1950 г. Дубнов на ферментных системах in vitro. Он высказал предположение, что восстановлением гомоцистина в гомоцистеин, легко присоединяющий метильную группу, можно, было бы объяснить действие витамина B 12 на синтез метионина. Поддержание глутатиона в восстановленномм состоянии могло бы играть роль в активации SH-ферментов. Эти гипотезы были подкреплены последующими наблюдениями. При рецидивах пернициозной анемии, а также у крыс, получающих рацион с недостатком витамина В 12 концентрация сульфгидрильных соединений (главным образ6м глутатиона) в крови ниже нормальной, и в обоих случаях она поднимается до нормы или после введения витамина. Быстрота этой реакции позволяет думать, что это непосредственный результат действия витамина. Однако Жаффе вовсе не обнаружил подобного действия у мышей. Согласно Лингу и Чоу и другим авторам, при авитаминозе В 12 нарушено использование углеводов. Это могло бы быть связано с низкой концентрацией глутатиона двояким образом. Сульфгидрильные группы некоторых гликолитических ферментов могли бы окисляться до неактивной S-S-формы: в частности, глутатион является простетической группой одного ключевого фермента – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Позднее Дубнов подверг дальнейшей проверке свою гипотезу реактивации SH-ферментов, использовав покоящиеся клетки мутанта Е. co l i, нуждающегося в витамине B 12. Он нашел, что активность ряда таких ферментов вначале была так же высока, как и в клетках «дикого» штамма, но снижалась по мере старения культур и могла быть вновь повышена добавлением витамина B 12 или глутатиона, причем гораздо эффективнее было добавление их обоих
  Обмен жиров и каротина    Благотворное действие витамина В 12 на обмен жиров у животных аналогичным образом приписывали поддержанию кофермента А в активном восстановленном состоянии. У крысят, получающих рацион с недостатком витамина B 12, организм не способен синтезировать жиры, а у взрослых крыс нарушается использование жиров пищи так что животные становятся тучными в результате избыточного накопления жира. Полагают, что этот эффект лишь частично объясняется, действием витамина B 12 на синтез метионина, в результате которого, в свою очередь, увеличивается количество липотропных веществ – холина и бетаина. Установлено, что витамин B 12 повышает всасывание каротина или превращение его в витамин А у крыс (на что указывает повышенное накопление последнего в печени); хотя и не влияет на накопление готового витамина А. Механизм этого действия еще неясен.
  Участие витамина B 12 в биохимических восстановительных процессах   Утверждали, что витамин В 12 помимо действия на сульфгидрильные соединения поддерживает в восстановленном состоянии другие важные вещества. Так, Уилл и сотр. установили, что в плазме больных пернициозной анемией содержание аскорбиновой кислоты понижено; кроме того, при инъекции таким больным аскорбиновой кислоты она быстро окисляется в дегидроаскорбиновую. После лечения витамином B 12 эти явления исчезают, а инъекции аскорбиновой кислоты ведут к повышению ее концентрации в плазме. Чоу и сотр. нашли, что в печени крыс с недостаточностью витамина В 12 общее содержание дифосфопиридиннуклеотида повышено, но количество его восстановленной формы (ДПН-Н) понижено.
 Ненормально высокое отношение ДПН/ДПН-Н снижалось вдвое после введения витамина B 12. Было высказано предположение, что витамин B 12 способен играть роль восстановителя, когда его трехвалентный кобальт восстановлен до двухвалентного состояния.
Однако нужны сильные восстановители, чтобы вызвать эту реакцию, которая в присутствии атмосферного кислорода идет в обратном направлении.
Предположение о том, что соединение с белком могло бы сдвинуть окислительно-восстановительный потенциал в область физиологических величин, не вполне убедительно, так как способность связывать белок после восстановления, возможно, утрачивается.
Биосинтез метионина и серина
Метилкобаламин участвует в реакциях синтеза метионина в качестве кофактора. Заключительным этапом синтеза метионина у бактерий, грибов, высших растений и животных состоит в переносе метильной группы от СН 3 -ТГФК к сульфгидрильной группе гомоцистеина. Существует два типа ферментов, осуществляющих синтез метионина – первый, независимый от кобаламинов, может использовать в качестве донора метильной группы только триглутаматную форму СН 3 -ТГФК. Второй тип ферментов, зависимый от кобаламиновых кофакторов, может использовать как моно-, так и триглутаматную форму СН 3 -ТГФК. Для активации ферментов второго типа, кроме того, требуется S -аденозилметионин ( S — AdoMet ). Последний необходим для первоначального метилирования кобаламина. Мутант Е. coli, используемый для определения витамина В 12, способен так же хорошо расти и при добавлении к минимальной питательной среде метионина, только для оптимального роста требуется примерно в 10000 раз больше метионина, чем витамина. Очевидный вывод, что в клетках этого организма витамин действует как катализатор синтеза метионина, был подтвержден экспериментально. Однако для любого другого микроорганизма, нуждающегося в витамине B 12, этот витамин не может быть заменен метионином, так что он, очевидно, осуществляет у этих организмов какую-то дополнительную функцию.
Скармливаемый предшественник
Радиоактивность метильного углерода метионина, μ с/г-атом
Повышение биосинтеза метионина, %
В присутствии вит. В 12
В отсутствие вит. В 12
При неограниченном потреблении пищи
α-14С-Глицин (2%)
β-14С-Серин (0,7%)
14С-Формиат натрия (0,1%)
156
81,5
 
33,8
95,5
47,4
 
20,0
63
72
 
69
При ограниченном потреблении пищи
14С-Формиат натрия (0,1%)
 
32,0
 
28,6
 
12
Ранние эксперименты с изучением роста цыплят и крыс также показали, что витамин B 12 снижает потребность в метионине, особенно при введении гомоцистеина. Сначала это было истолковано как действие витамина на трансметилирование, т. е. на передачу лабильной метильной группы от холина или бетаина к гомоцистеину с образованием метионина. Точно так же витамин B 12 может, по крайней мере частично, заменять холин для цыплят, крыс и поросят-сосунков. Ряд исследований (некоторые из них с использованием 14 С) показал, что витамин B 12 не оказывает никакого влияния на трансметилирование, но участвует в прямом синтезе лабильной метильной группы из более окисленных предшественников – таких, как формиат, α-углерод глицина или β-углерод серина. Трудности истолкования результатов, получаемых на интактных животных, хорошо иллюстрирует таблица 1. При авитаминозе В 12 сильно ухудшается аппетит и наблюдаемые результаты часто могут быть обусловлены просто пониженным потреблением пищи по сравнению с контрольными животными. Эту неясность можно устранить, ограничив потребление пищи контрольными животными до уровня, характерного для авитаминозных животных (метод «парного кормления»). Подтверждение данных для поросят и цыплят в опытах с 14 С-формиатом и 14 С-серином получили Джонсон и сотр. Однако при использовании меченого формальдегида результат оказался неожиданным: интенсивность включения метки в метильные группы метионина и холина у цыплят с недостаточностью витамина B 12 оказалась значительно повышенной. Есть основательные данные в пользу того, что новообразованные метильные группы появляются в метионине, но потом в результате трансметилирования они могут оказаться в холине или креатине. Эти выводы никто не оспаривал, но некоторые исследования позволяли предположить, что, кроме того, при недостаточности витамина B 12 у крыс активность трансметилазы в печени понижена. Значение витамина B 12 в переносе групп с одним атомом углерода почти неразделимо переплетается с функциями фолиевой кислоты (точнее, производных тетрагидрофолевой кислоты). Эти процессы переноса, которые могут происходить на трех различных уровнях окисления, схематически представлены на схеме 2, показаны также связанные с ними реакции окисления и восстановления. Некоторые из этих процессов переноса происходят в несколько этапов (не показанных на схеме 2) это, безусловно, относится к превращению гомоцистина в метионин, и почти нет сомнений, что для реакции в целом необходимы оба витамина. Возможная последовательность этапов показана на схеме 3. Как уже говорилось, витамину B 12 приписывали участие в восстановлении гомоцистина до гомоцистеина – акцептора метильной группы. Однако последующие опыты с мечеными аминокислотами показали, что витамин, возможно, не нужен для этого восстановления. Какое-то производное фолиевой кислоты, несомненно, участвует в самом переносе радикала с одним углеродным атомом. Тогда единственная функция, остающаяся для витамина B 12, состоит в восстановлении этой группы в метильную группу метионина – если только витамин не действует лишь косвенным образом, способствуя, например, синтезу ферментов.
Во всяком случае, синтез метионина не может быть единственной биохимической функцией витамина В 12 у высших животных, так они гибнут от его недостаточности даже при большом количестве метионина и холина в пище. Сопоставление данных, приводимых в пользу и против участия витамина B 12 во взаимопревращениях глицина и серина, приводило скорее к выводу об отсутствии влияния витамина, но работа Вора и сотр. вскрыла новую сторону проблемы.
Эти авторы не обнаружили снижения общего синтеза серина из α- 14 С-гли-цина в срезах печени индейки, но наблюдали значительное уменьшение включения 14 С в положении 3. Они объясняют это тем, что витамин B 12 действует на этапе отщепления от глицина радикала с одним углеродным атомом, перенос которого осуществляет тетрагидрофолевая кислота. Если это подтвердится, то, по-видимому, такой же механизм мог бы действовать в синтезе метильной группы метионина de novo.
Синтез нуклеиновых кислот
С самого начала работ в данной области считали почти несомненным, что витамин B 12 стимулирует синтез дезоксирибонуклеиновой и, вероятно, рибонуклеиновой кислот. Молочнокислые бактерии, используемые для определения витамина B 12, почти так же хорошо растут при замене его большими количествами тимидина или других дезоксирибонуклеозидов; проще всего это можно объяснить тем, что витамин B 12 участвует в каком-то этапе синтеза ДНК. Выяснилось, что действие витамина связано с синтезом дезоксирибозного компонента ДНК. Некоторые ученые полагают, что у некоторых бактерий витамин B 12 стимулирует синтез не только ДНК, но и РНК. Однако другие микроорганизмы, нуждающиеся в витамине B 12, не способны расти на дезоксирибозидах, и нет данных о том, что у этих видов витамин контролирует синтез ДНК. У мутанта Е. coli равномерно меченный уридин превращался в тимин не только в присутствии витамина B 12, но и в присутствии метионина; кроме того, у него не наблюдалось превращения меченой рибозы в дезоксирибозид. Тем не менее была тенденция переносить выводы из опытов с молочнокислыми бактериями также и на высших животных, включая человека. Этому способствовал факт энергичной регенерации эритроцитов и роста эпителия языка после лечения рецидивов пернициозной анемии цианкобаламином. Здесь действительно должен происходить быстрый синтез нуклеиновых кислот, но возможно, что этот процесс подавляется при недостаточности витамина, так как для пролиферации клеток необходимы и другие компоненты. Кроме того, активность костного мозга при пернициозной анемии отнюдь не подавлена; в самом деле, кругооборот компонентов гема примерно втрое превышает нормальный уровень, но большая часть этой активности бесполезна для образования новых эритроцитов. Ряд исследователей отмечает пониженное содержание ДНК, РНК или обеих нуклеиновых кислот в организме животных при авитаминозе В 12; истолкование таких результатов усложняется тем, что авитаминозные животные потребляют меньше пищи. О`Делл и Бруммер использовали радиоактивный фосфат и нашли, что лишение как витамина B 12, так и пищи вообще действительно оказывает сходное влияние на синтез нуклеиновых кислот. Глейзер и сотр. установили, что в мегалобластическом костном мозге человека отношение урацил/тимин и соответственно отношение РНК/ДНК значительно выше нормального. После лечения витамином B 12 или фолиевой кислотой обе величины быстро уменьшались до нормы. Предложенное объяснение состояло в том, что витамин B 12 катализирует синтез компонента ДНК – тимина; метилирование урацила с образованием тимина формально аналогично метилированию гомоцистеина с образованием метионина – реакции, которую, как известно, стимулирует витамин B 12. Однако в этом исследовании, к сожалению, определяли относительные, а не абсолютные количества, между тем более ранняя работа Дэвидсона и указывает на возможность иного объяснения результатов. Эти авторы нашли, что в мегалобластическом костном мозге содержание ДНК и особенно РНК ненормально повышено в расчете как на 1 г, так и на 1 клетку; после лечения количество обеих кислот уменьшалось (правда, количество РНК — быстрее), что и должно было вести к изменению отношений, найденному Глейзером и его сотрудниками

Таблица 2. Влияние витамина В12 на синтез нуклеиновых кислот
Позже в опытах с изотопами стали искать более прямых данных. Исследовали, например, влияние витамина B 12 на включение радиоактивного фосфора в нуклеиновые кислоты. Витамин B 12 стимулировал включение его во фракцию ДНК кишечника и селезенки, но не печени и в то же время не влиял на радиоактивность РНК. Джонсон и сотр. использовали еще более прямой подход к проблеме: они изучали включение 14 С из различных предшественников (формиата, формальдегида, глицина, серина и глюкозы) в нуклеиновые кислоты печени свиней, кур и крыс; у крыс они определяли также превращение некоторых из этих предшественников в аллантоин. Ни в одном случае нельзя было обнаружить сколько-нибудь значительного влияния витамина B 12 на радиоактивность ДНК, РНК или аллантоина. Если эти данные будут подтверждены, то трудно будет признавать связь между витамином В 12 и синтезом нуклеиновых кислот у высших животных. Мистри и Джонсон в опытах на курах действительно установили, что витамин B 12 повышает синтез мочевой кислоты из формиата, метильной группы метионина или β-углеродного атома серина, но не из формальдегида или глицина; однако они трактуют это не как результат прямого действия на биосинтез пуринов, а как возможное влияние на какую-то окислительную реакцию в обмене соединений с одним углеродным атомом.
    продолжение
--PAGE_BREAK--Белковый обмен
Очевидно, что благодаря своему влиянию на синтез метионина витамин B 12 оказывает какое-то действие на белковый обмен. Например, можно ожидать, что цианкобаламин будет улучшать использование белка из рационов, в которых этой аминокислоты недостаточно. Таким образом объясняли некоторые из отмеченных выше благотворных эффектов витамина. Значительную прибавку в весе тела, даже если она связана с увеличением количества не только жира (как часто бывает), но и белка, обычно можно объяснить просто повышенным потреблением пищи животными, получающими витамин B 12. Не было обнаружено никакого влияния витамина B 12 на баланс азота и эффективность использования белков у крыс. Различные исследования, однако, указывали на более прямую роль этого витамина в синтезе белка. Так, было установлено, что у крыс с гипертиреозом (гиперфункцией щитовидной железы) витамин B 12 способствует удержанию азота. У кур при недостаточности витамина B 12 концентрация аминокислот в крови повышена, а белков в плазме – понижена; у человека также показано обратное отношение между концентрациями аминокислот и витамина B 12 в крови, что объясняется стимулирующим действием витамина на синтез белков. Сообщается об избыточном выведении с мочой аминокислот, особенно лизина (но также и таурина) при обострении пернициозной анемии и дегенерации спинного мозга. Нарушение нормального обмена тирозина и триптофана могло бы вести к избыточному выделению фенольных веществ, тоже отмеченному при пернициозной анемии, и, возможно, к образованию токсичных веществ, вызывающих гемолиз, которым иногда сопровождается это заболевание; все эти обменные нарушения быстро исчезают после введения витамина B 12. Было отмечено, что при дегенерации спинного мозга, часто сопровождающей пернициозную анемию, поражаются некоторые крупные аксоны, нормальное состояние которых поддерживается быстрым обновлением белка. Поэтому исследователи предположили, что витамин B 12, специфически излечивающий это состояние, косвенным образом контролирует синтез белка; полагая, что прямое действие витамина направлено на синтез нуклеиновых кислот, они связали свое предположение с гипотезой о том, что РНК служит «шаблоном» для синтеза белка; их данные было бы логичнее истолковать в пользу прямого действия витамина B 12 на синтез белков. Изучалось влияние витамина B 12 на включение меченого серина или меченой глюкозы в белки печени и в некоторые отдельные аминокислоты у свиней и крыс. Во всех опытах полученные величины были заметно ниже у животных с авитаминозом. Исследователи приводят соображения в пользу того, что это не было следствием одного лишь пониженного потребления пищи. Данные наблюдения были дополнены исследованиями, проведенными in vitro на препаратах микросом из печени и селезенки нормальных крыс и крыс с авитаминозом. Как показано, между этими группами животных обнаружились большие различия во включении меченых аминокислот; кроме того, при добавлении витамина B 12 к препаратам микросом, полученных от животных с авитаминозом, включение аминокислот заметно возрастало. Ученые пошли дальше и показали, что в надосадочной жидкости после центрифугирования микросом печени находится содержащий витамин B 12 «рН5-фермент», катализирующий включение меченых аминокислот в белок. Интересно было бы выяснить, не обладает ли ферментативной активностью комплекс витамина B12 с пептидом, выделенный ранее из печени. Позднее было показано, что «рН5-фермент» содержит большую часть витамина В 12, первоначально находившегося в микросомах печени. Этот фермент подвергли дальнейшему фракционированию; он, по-видимому, катализировал как активацию аминокислот аденозинтрифосфатом, так и их последующее включение в белковую фракцию микросом. Кроме того, оба процесса подавлялись антагонистами витамина В 12 содержащими остаток анилида вместо одной из амидных групп. Исследователи высказали гипотезу, что витамин В 12 -фермент действует как активатор-переносчик: он переносит аминокислоты (после активации их карбоксильных групп аденозинтрифосфатом) на «шаблон», возможно, путем транспептидирования, в котором участвуют 6 карбоксамидных групп молекулы витамина. Некоторые ученые приводят соображения, позволяющие предполагать, что некоторые из карбоксамидных групп являются биохимически активными частями молекулы. Другим исследователям пока не удалось подтвердить эти данные; они указывают также, что включение аминокислот в белок микросом не обязательно представляет собой нормальный синтез белка. Таким образом, эти результаты нельзя считать окончательным доказательством прямого действия цианкобаламина на белковый синтез. Однако это привлекательная гипотеза; контролем синтеза апоферментов можно было бы объяснить влияние витамина В 12 на ряд, казалось бы, не связанных между собой ферментных систем. В пользу этого можно привести и другие данные; различные исследователи утверждали, что недостаточность витамина B 12 у крыс ведет к уменьшению содержания в их печени некоторых ферментов, а именно трансметилазы, рибонуклеазы, цитохромоксидазы и различных дегидрогеназ. Другие авторы установили, что при отсутствии витамина B 12 не происходит регенерации ткани печени после частичной гепатэктомии. Все эти данные говорят в пользу прямого или косвенного влияния витамина на синтез белка.
Другие возможные функции
Недостаток цианкобаламина в пище ведет к повышенному выделению тиоцианата; в связи с чем была выдвинута гипотеза, основанная на предполагаемой лабильности групп цианида и конкуренции за цианид между оксикобаламином и ферментом роданезой. Тесная взаимосвязь между функциями фолиевой кислоты и цианкобаламина привела к предположению о том, что последний катализирует превращение фолиевой кислоты в «цитроворум-фактор» или какую-то другую активную форму; убедительных экспериментальных данных в пользу этого, по-видимому, нет. Интересные взаимоотношения, видимо, существуют также между витамином B 12 и пантотеновой кислотой. Некоторые исследователи утверждали, что в опытах с кормлением кур каждый из этих факторов снижал потребность в другом. Эванс и сотр. обнаружили уменьшение содержания пантотеновой кислоты в печени после введения витамина В 12 курам с авитаминозом и предположили, что витамин мобилизует печеночные резервы пантотеновой кислоты. Другие исследователи подтвердили эту взаимосвязь и отметили повышенное содержание витамина B 12 в организме крыс с недостаточностью пантотеновой кислоты. Гершоф и сотр. доказали наличие взаимосвязи между тироксином, магнием и витамином B 12. Как магний, так и витамин B12 частично снимают ряд эффектов введения тироксина, потерю витамина B 12 тканями, подавление роста, разобщение окисления и фосфорилирования, изменение белковых фракций сыворотки. Эти результаты еще ждут своего объяснения. «Конца пути еще не видно, но есть основания надеяться, что скоро мы будем знать о механизме действия витамина B12 больше, чем мы знаем о действии некоторых других витаминов, открытых гораздо раньше».
Некоторые В 12 -зависимые ферменты
В12-коферменты многочисленны и различны. Они отличаются тем, что содержат два типа лигандов: метильную группу и 5`-дезоксиаденозин. Превращение свободного витамина В12 в кофермент происходит в присутствии специфических ферментов и при участии в качестве кофакторов ФАД, восстановленного НАД, АТФ и глутатиона. При образовании 5-дезоксикобаламинового кофермента АТФ подвергается необычному распаду с отщеплением трифосфатного остатка по аналогии с реакцией синтеза 5-аденозилметионина из метионина и АТФ. Впервые В12-коферменты были выделены Г. Баркером с сотрудниками в 1958 г. из микробов. Химические реакции с участием В12-коферментов подразделяют на две группы: реакции трансметилирования и изомеризации. В реакциях первой группы коферменты играют роль промежуточных переносчиков метильной группы. К таким реакциям относятся, например, синтезы метионина и ацетата. Гомоцистеин под воздействием метилкобаламина и тетрагидроилглутаматметилтрансферазы в присутствии восстановленного ФАД и N 5 -СН 3 -ТГФК превращается в метионин. Метильная группа N 5 -СН 3 -ТГФК переносится вначале на активный центр фермента, затем на гомоцистеин. Ко второй группе реакций относится изомеризация L -метилмалонил-КоА в сукцинил-КоА.
Диолдегидратаза
Приведем вначале важнейшие данные, полученные за последние годы при исследовании диолдегидратазы, т. е. фермента, катализирующего превращение этандиола-1,2, и пропандиола-1,2, соответственно, в ацетальдегид и пропионовый альдегиды. Оказалось, что один и тот же фермент способен катализировать превращение и этандиола-1,2 и пропандиола-1,2 в соответствующие альдегиды. Примечательной особенностью этого фермента, как и всех остальных аденозилкобаламин-зависимых ферментов, явилось то, что окончание реакции сопровождается деструкцией и высвобождением кофермента из фермент-коферментного комплекса. Диолдегидратаза представляет собой белок с мол. массой 250000 с единственным активным центром содержащим аденозилкобаламин. Хроматография позволяет разделить фермент на две субъединицы с разными молекулярными массами. Каждая из субъединиц неактивна, рекомбинация их приводит к восстановлению активности. Весьма важным и, по-видимому, общим свойством всех аденозилкобаламин-ферментов, является чувствительность диолдегидратазы к сульфгидрильным ингибиторам. Образование тройного ферментного комплекса (апофермент-АденозилКобаламин-пропандиол-1,2) полностью защищает фермент от действия ртутьсодержащих ингибиторов. Это позволяет утверждать, что HS -группа (или группы) фермента может иметь большое значение для проявления биокаталитической активности. Важно подчеркнуть, что защищающим действием, помимо аденозилкобаламина, обладают и другие Кобаламины ( CN -Кобаламин, метилкобаламин), введение которых в ферментный комплекс вместо кофермента приводит к его инактивации. Тем не менее расщепление такого комплекса после обработки SH -соединением и последующая реконструкция с аденозилкобаламином вновь восстанавливает активность. Изучение химической модификации этого фермента выявило большое значение различных аминокислотных остатков в активном центре фермента. Так оказалось, что один остаток аргинина на моль фермента является необходимым для проявления каталитической активности диолдегидратазы. Наконец, недавно было продемонстрировано значение другой основной аминокислоты – лизина для проявления ферментативной активности. Остаток лизина, важный для обеспечения активной олигомерной структуры фермента и связывания аденозилкобаламина, локализован в низкомолекулярной субъединице. Остатки основных аминокислот обеспечивают ионное взаимодействие между субъединицами.
Глицеролдегидратаза
Другой фермент, катализирующий превращения вицинальных гликолей в альдегиды – глицеролдегидратаза или глицеролгидролиаза ответственен за изомеризацию глицерина в β-оксипропионовый альдегид и продуцируется как некоторыми штаммами Klebsiella р., так и Propionibactereciae. Кофакторами, необходимыми для проявления активности глицеролдегидратазы, являются аденозилкобаламин и К +. Очистка фермента из К l. р. привела к выделению ферментного комплекса с мол. массой 188000, содержащего две субъединицы разного размера и 1 моль аденозилкобаламина на 1 моль фермента. Меньшая субъединица с мол. массой 22 000 в свою очередь распадается на два белка с мол. массой около 12 000. Самосборка субъединиц в ферментном комплексе промотируется субстратом – глицерином, аденозилкобаламином и ионом К +. Интересно, что ион Na + ингибирует активность фермента и ни одна из субъединиц по отдельности не способна связывать аденозилкобаламин. Аналогично диолдегидратазе, глицеролдегидратаза ингибируется сульфгидрильными ингибиторами, причем в опытах с обработкой субъединиц и последующей сборкой было показано, что меньшая субъединица после обработки еще сохраняет 25% от первоначальной активности, в то время как большая полностью ее теряет.
Этаноламин-аммиаклиаза
Фермент, осуществляющий превращение этаноламина в ацетальдегид и аммиак – этаноламин-аммиак-лиаза – был описан в 1965 г, очищен и выделен в гомогенном состоянии в 1968 г. Этот аденозилкобаламин-фермент интенсивно исследовался в работах Бэбиора и Ейбилиса. Итоги изучения фермента можно суммировать следующим образом: оказалось, что, в отличие от диолдегидратазы, единственным субстратом этаноламин-аммиак-лиазы является этаноламин. Позднее было выяснено, что L -2-аминопропанол также может превращаться в пропионовый альдегид и аммиак. Однако это превращение сопровождается необратимым расщеплением кофермента. При реакции NH 2 -г py пп a всегда перемещается от С2 к С1 (т. е. к атому, с которым связана ОН-группа). В опытах с меченым 18 О Н 2 О было показано, что гидроксил при С1 всегда остается в продукте. Тем самым был исключен механизм образования ацетальдегида через промежуточный имин, гидролиз которого обязательно привел бы к включению метки в продукт. Наблюдаемый во всех аденозилкобаламин-зависимых реакциях перенос водорода С1→С2 был обнаружен и в этой реакции. Опыты с энантиомерами многократно меченого субстрата — 2-амино-[2 2 H, 2 3 Н]-этанола свидетельствовали о рацемизации продукта (ацетальдегида). Несмотря на то, что прямых доказательств перемещения NH 2 -группы от С2 к С1 не было получено, процесс превращения этаноламина в ацетальдегид и аммиак описывается по аналогии с другими реакциями. Фермент представляет собой довольно большой белок с мол. массой 520000. В пятимолярном растворе гуанидин-НС l он диссоциирует – на субъединицы с мол. массой 50000. Показано, что фермент содержит два независимых активных центра. Подобно диолдегидратазе фермент активируется одновалентными катионами К + и NH 4 + и ингибируется сульфгидрильными ингибиторами.
Аденозилкобаламин-зависимые мутазы
Следующую группу Аденозилкобаламин-ферментов, составляют мутазы, катализирующие перегруппировки углеродного скелета и приводящие к обратимым превращениям субстратов с разветвленной цепью в соединения с прямой цепью.
Среди этих ферментов хорошо изучены два – глутаматмутаза и метилмалонил-СоА-мутаза.
Глутаматмутаза
Фермент, катализирующий превращение L -глутамата в L -трео-β-метиласпартат, был выделен, из Clostridium tetanomorphum. Показано, что многочисленные фотосинтезирующие микроорганизмы также содержат глутаматмутазу. Фермент, кроме аденозилкобаламина, нуждается в SH -соединении, однако, в отличие от диолдегидратаз и других аналогичных ферментов, для проявления каталитической активности не требуются одновалентные катионы. Фермент высокоспецифичен в отношении структуры субстратов. Ни аналоги глутаминовой кислоты, ни аналоги β-метиласпарагиновой кислоты (как, например, β-этиласпартат) не являются субстратами мутазы. Опыты по очистке фермента позволили установить субъединичную структуру и этого аденозилкобаламин-зависимого фермента. Были получены в гомогенном состоянии две субъединицы, которые были названы S — и Е-белками. Каждый из белков не обладал порознь активностью. Рекомбинация их и взаимодействие с коферментом приводили к восстановлению активности. Первым был очищен Е-белок. Определение молекулярного веса показало, что это довольно большой белок с мол. массой около 128 000. В отличие от ферментов, рассмотренных выше, добавление Кобаламина не защищало Е-компонент глутаматмутазы от инактивации в растворе. Е-компонент связывал 1 моль аденозилкобаламина, а в присутствии семикратного избытка S -компонента дополнительно связывал еще один моль кофермента. Компонент S после очистки, как оказалось, обладал намного меньшей мол. массой 17000 и, по-видимому, содержал важные для проявления ферментативной активности SH — группы. Титрование S -белка сульфгидрильными реагентами показало, что на 1 моль белка приходится пять SH -групп. Примечательной особенностью компонента была его способность к димеризации в присутствии О 2. Расщепление димера осуществлялось обработкой последнего каким-либо RSH -соединением. Это свидетельствовало об образовании межмолекулярного дисульфидного мостика. Инактивация S -белка с помощью AsO 2 — доказывала наличие в активном центре по крайней мере одной из двух вицинальных тиольных групп.
Метилмалонил-СоА-мутаза
Другой аденозилкобаламин-зависимый фермент, осуществляющий перегруппировку углеродного скелета метилмалонил-СоА в сукцинил-СоА был также сначала выделен из микроорганизмов, а затем из тканей млекопитающих. Оказалось, что этот кобаламин-зависимый фермент выполняет метаболически важную роль на пути превращения пропионил-СоА в сукцинил-СоА. Схема этого участка метаболизма включает 3 фермента: биотин-зависимую карбоксилазу, рацемазу, превращающую D -метилмалонил-СоА в L-изомер и рассматриваемую кобаламин-мутазу. После очистки метилмалонил-СоА-мутазы оказалось, что это субъединичный фермент с мол. массой 124000, расщепляющийся на два компонента с мол. массой 61 000 и 63000. Выделенная из печени овцы метилмалонил-СоА-мутаза представляет собой окрашеный в оранжевый цвет белок с мол. массой 165000. Фермент связывал 1 моль аденозилкобаламин на 75000 2-метиленглутаратмутаза Следующий сходный по действию Аденозилкобаламин-зависимый фермент-это 2-метиленглутаратмутаза, катализирующая обратимое превращение между 2-метиленглутаратом и 2-метилен-З-метилсукцинатом. Фермент был выделен из микробиологических источников при выращивании Clostridium на средах, содержащих никотиновую кислоту. Определение молекулярной массы частично очищенного препарата дало величину 170000. Обработка йодацетатом приводит к потере активности, что, очевидно, свидетельствует о наличии важных для катализа SH-групп. Действие AsО 2 —, однако, не выявило присутствия вицинальных дитиольных групп.
    продолжение
--PAGE_BREAK--