Реферат: Элементы метода капиллярного электрофореза

<m:mathPr> <m:mathFont m:val=«Cambria Math»/> <m:brkBin m:val=«before»/> <m:brkBinSub m:val="--"/> <m:smallFrac m:val=«off»/> <m:dispDef/> <m:lMargin m:val=«0»/> <m:rMargin m:val=«0»/> <m:defJc m:val=«centerGroup»/> <m:wrapIndent m:val=«1440»/> <m:intLim m:val=«subSup»/> <m:naryLim m:val=«undOvr»/> </m:mathPr>

<img src="/cache/referats/26939/image001.gif" v:shapes="_x0000_i1025"> МЗРФ

ДВГМУ

Кафедра общей, физической и коллоиднойхимии

Реферат

ЭЛЕМЕНТЫ МЕТОДА КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Выполнил:студент группы 201-Ф

Данилов Д. И.

Проверил: НемовВ. А.

г. Хабаровск, 2004

ПЛАН:

1.Введение

2.Основы метода

3.Техническая реализация метода КЭФ

4. Анализ анионов методом капиллярного электрофореза

5. Детектирование сигналов

6.Применение метода капиллярного электрофореза

7. Заключение

8. Литература

Введение

Опыт современной наукипоказывает, что сочетание казалось бы противоположных свойств приводит кполучению новых, неожиданных результатов. Именно такое сочетание свойств воды(водных растворов электролитов) и «камня» (диоксида кремния, кварца,из которого изготовлен капилляр), позволили создать новый метод анализа,который носит название капиллярного электрофореза (КЭФ). Собственно иэлектрофорез и капиллярность были известны достаточно давно, но только несколькодесятилетий назад удалось разработать новый метод анализа, в котором этиявления используются для разделения проб сложного состава на составляющиекомпоненты.

Капиллярныйэлектрофорез– это метод анализа сложных смесей, использующий электрокинетические явления –электромиграцию ионов и других заряженных частиц и электроосмос – дляразделения и определения компонентов. Эти явления возникают в растворах припомещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Еслираствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическоеполе, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц ипассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальныекомпоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого сортазаряженных частиц. В то же время, возмущающие факторы, как то: диффузионные,сорбционные, конвекционные, гравитационные и т.п., в капилляре существенноослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений.

Капиллярный электрофорез — это метод разделения с использованиемкварцевого капилляра заполненного гелем сложных смесей состоящих из больших ималых молекул. Для многих смесей капиллярный электрофорез позволяет получитьлучшее разделение по сравнению с другими стандартными методами.
Капиллярный электрофорез имеет целый ряд достоинств:
●Высокая разрешающая способность.
●Высокая скорость анализа до 15мин.
● Возможность анализа любыхвеществ, вне зависимости от молекулярной массы, гидрофобности и заряда.
●Минимальный объем анализируемогообразца (ввод пробы 10 – 100 нл).
●Низкий расход реагентов.
●Многоразовые регенерируемые капилляры.
●Минимальная пробоподготовка.
●Высокая чувствительность прииспользовании LIF детектора (до 10-11 М).
●Возможность полной автоматизацииисследований.

Основы метода

Теоретические основыкапиллярного электрофореза достаточно сложны, что обусловлено использованием вэтом методе свойств поверхности раздела двух фаз — жидкости и твердого тела,свойств вязкости жидкости и свойств ионной электропроводности жидкости, потому,не претендуя на академическую строгость изложения, постараемсяпродемонстрировать основные моменты метода капиллярного электрофореза.

Рис. 1. Схема процессов, происходящих на поверхности кварца

а) ювенильная (свежесозданная) поверхность кварца
б) образование силанольных групп на поверхности кварца
в) диссоциация силанольных групп в водном электролите
г) гидратация образовавшихся ионов
д) связывание части катионов с поверхностью, формирование двойного электрического слоя

Обратимся к процессам,происходящим на границе раздела двух фаз: внутренней поверхности кварцевогокапилляра и водного раствора электролита, заполняющего капилляр. Насвежеобразованной (ювенильной) поверхности плавленого кварца (SiO2)находятся главным образом силоксановые группы (рис. 1а). При контакте спарами воды или водными растворами силоксановые группы, обладающие двойнымисвязями, оказываются неустойчивыми и, присоединяя молекулу воды, образуютсиланольные группы (рис. 1б). При контакте поверхности кварца с воднымирастворами, силанольные группы диссоциируют с отщеплением ионов Н+(рис. 1в). Степень диссоциации зависит от температуры и состава водногораствора, в частности от величины рН. При рН> 2,5 на поверхности кварцаобразуются диссоциированные силанольные группы, которые создают отрицательныйповерхностный заряд.

Диссоциированные ионы,находящиеся как на кварцевой поверхности, так и в объёме электролита,гидратируются (рис. 1г). За счёт сил кулоновского взаимодействия, противоположнозаряженные гидратированные ионы, находящиеся на поверхности и в объёмежидкости, взаимно притягиваются. Действующие при этом силы настолько велики,что ионы (часть катионов и остатки силанольных групп) частично теряютгидратирующую воду. В результате этого, первый слой катионов, непосредственноприлегающий к поверхности, теряет подвижность, связывается (рис. 1д). Поскольку«пушистые» гидратированные катионы не могут все разместиться в видемонослоя и полностью компенсировать отрицательный заряд поверхности, некотораячасть катионов, нейтрализующих отрицательный заряд, отходит в толщу раствора иобразует заряд, распределённый в объеме жидкости, прилегающем к границе разделаи, в силу меньшей энергии связи с поверхностью, обладающий способностью к перемещению(рис. 2а).

Рис. 2. Формирование двойного электрического слоя (а) и
ход потенциала на границе раздела кварц-электролит (б)

Несмотря на сильноекулоновское взаимодействие рекомбинации зарядов не происходит. В результатевзаимодействующие системы зарядов образуют двойной электрический слой,состоящий как бы из двух изолированных друг от друга обкладок конденсатора,имеющих заряды противоположного знака. Одну из обкладок составляют отрицательнозаряженные остатки силанольных групп, другая состоит из двух частей — неподвижного слоя катионов, непосредственно примыкающих к поверхности кварца, идиффузного слоя, образованного катионами, находящимися в объеме жидкости.Распределение катионов между неподвижным и диффузным слоями, а, следовательно,и толщина двойного электрического слоя зависит в первую очередь от общейконцентрации электролита в растворе. Чем она выше, тем бo льшая частьположительного заряда диффузного слоя перемещается в неподвижный слой и темменьше становится толщина диффузного слоя (рис. 2б). При концентрации бинарногооднозарядного электролита 10-3...10-4 М толщина двойногоэлектрического слоя составляет в среднем 30...50 мкм.

Свернём (мысленно)рассматриваемую поверхность в виде трубы с внутренним диаметром 50...100 мкм,тогда окажется, что практически вся жидкость, заполняющая её, будетпредставлять собой диффузную часть двойного электрического слоя. Трубу столь малогодиаметра принято называть капилляром. Если в такой системе вдоль оси капилляраприложить электрическое поле, то в капилляре возникнет продольное движениесвободных носителей электрических зарядов (разнополярных ионов) во взаимнопротивоположных направлениях, а поскольку в диффузной части двойногоэлектрического слоя присутствует избыточная концентрация катионов, то числоионов, перемещающихся к катоду будет значительно больше, при этом их движениебудет увлекать за собой всю остальную массу жидкости в капилляре (вследствиемолекулярного сцепления и внутреннего трения). Возникает так называемыйэлектроосмотический поток (ЭОП), направленный к катоду, который будетосуществлять пассивный перенос раствора внутри капилляра (рис. 3).

Рис. 3. Схема процессов в кварцевом капилляре. Стрелкой показано направление электроосмотического потока.

Вследствие этого процессав электролите, заполняющем капилляр, возникает направленное перемещение массыжидкости, которое вызвано приложенной разностью потенциалов, при этом вся массажидкости (за малым исключением приповерхностного слоя) перемещается содинаковой скоростью, т.е. формируется плоский профиль скоростей. Это оченьважное обстоятельство, которое позволяет получить чрезвычайно высокуюразрешающую способность метода, поэтому на него надо обратить особое внимание.

Техническая реализация метода КЭФ

Минимальный составсистемы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен иметь в своёмсоставе следующие компоненты: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения,устройство ввода пробы, детектор и устройство вывода информации. Дополнительныеустройства позволяют автоматизировать подачу образцов, термостатироватькапилляр и сделать более удобной обработку получаемой информации.

На рис. 4 представленасхема системы капиллярного электрофореза в простейшем случае. Капиллярзаполняется раствором электролита, своими концами капилляр опущен в два сосуда,содержащих тот же электролит. Электролит обязательно должен обладать буфернымисвойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению составараствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояниекомпонентов пробы в процессе анализа. В сосуды введены электроды, к которымприкладывается разность потенциалов. Под действием разности потенциалов вкапилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через него протекаетэлектроосмотический поток (ЭОП), на который будет накладываться электромиграциякатионов и анионов во взаимно противоположных направлениях.

Рис. 4. Схема системы капиллярного электрофореза

Как правило, в приборахкапиллярного электрофореза ЭОП направлен от входного конца капилляра кдетектору поэтому, при использовании кварцевого капилляра, разность потенциаловустанавливают таким образом, что входной конец капилляра имеет положительнуюполярность (анод), а детектор устанавливается вблизи катода. Если теперь вкапилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будетпереносить зону пробы к катоду, и она некоторое время будет находиться вкапилляре под воздействием электрического поля высокой напряженности. В течениеэтого времени компоненты пробы, имеющие заряды и отличающиеся от компонентоврабочего буфера, будут перемещаться в соответствии с присущими имэлектрическими подвижностями, специфичными для каждого компонента. Катионныекомпоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток.Скорость их движения будет складываться из скорости ЭОП и скоростиэлектромиграции, поэтому на выходе капилляра катионные компоненты будутпоявляться первыми и тем раньше, чем больше электрическая подвижность данногоиона. Нейтральные компоненты пробы будут перемещаться только под действием ЭОП,и появятся на выходе, когда его достигнет зона пробы. Анионные компонентыперемещаются к аноду с различными скоростями. Некоторые из них, медленномигрирующие, будут появляться вблизи детектора после выхода ЭОП, а те, чьяскорость миграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, рано илипоздно выйдут из капилляра в прианодное пространство.

Если время нахожденияпробы в капилляре (которое можно регулировать длиной капилляра, скоростью ЭОПили приложенной разностью потенциалов) достаточно, то на выходе капилляравблизи катода формируются зоны раствора, в которых находятся индивидуальныекомпоненты пробы. Происходит, таким образом, разделение исходной смеси. Еслитеперь с помощью детектора зарегистрировать появление компонентов на выходе изкапилляра, то полученная запись будет называться электрофореграммой и можетслужить основой для качественного и количественного анализа смеси. Описанныйвариант анализа носит название капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). В этомварианте могут определяться катионные компоненты проб и некоторые медленномигрирующие анионы. Однако главные анионы, определяющие минеральный составводы, зарегистрировать таким способом невозможно.

Анализ анионов методом капиллярного электрофореза

Для того чтобы методом КЗЭможно было определять анионные компоненты проб, необходимо изменить полярностьприкладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не тольконаправление миграции анионов, но также направление ЭОП и он будет препятствоватьперемещению в сторону детектора медленно мигрирующих анионов. Для изменениянаправления ЭОП необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляратаким образом, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись наобратные, и направление ЭОП совпадало с направлением перемещения анионов. Этодостигается введением в рабочий буферный раствор катионногоповерхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ).Катион ЦТАБ активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая придостаточной его концентрации, все вакансии в ближайшем к поверхности слое.Поверхность как бы «ощетинивается» длинными цетильными (С16Н33-) цепочками. при дальнейшей промывке рабочим буферным растворомповерхность сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона,ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция «щетка в щетку»).В результате первая обкладка двойного электрического слоя становитсяположительно заряженнной, а вторая (в том числе и диффузная её часть) приобретаетотрицательный заряд, и теперь ЭОП снова перемещается в направлении от входногоконца капилляра к детектору.

Аналогичными свойствами помодификации поверхности капилляра обладают и другие буферные растворы,например, приготовленный на основе 2-[ N-Циклогексиламино] этан-сульфоновойкислоты с модификатором электроосмотического потока в гидроксильной форме(тетрадецетилтриметил аммония гидроксид) и т.п.

Детектирование сигналов

В системах капиллярногоэлектрофореза наиболее часто применяется фотометрическое детектирование, вкотором используется одна ила несколько длин волн, обычно лежащих вультрафиолетовой области спектра. Соответственно отклик детектора будетнаблюдаться только в том случае, когда определяемый компонент имеет заметноепоглощение на длине волны детектирования. Это — прямое детектирование.Электрофореграмма будет представлять собой набор положительных пиков,возвышающихся над базовой линией.

Однако, анионы,растворенные в воде, зарегистрировать таким простым способом не удается, т.к.они не обладают собственным поглощением в указанном спектральном диапазоне. Вэтом случае применяется косвенное детектирование, суть которого состоит в том,что ведущий электролит готовится с добавкой вещества, поглощающего свет надлине волны детектирования. В случае определения анионов добавка также должнабыть анионом, например, это может быть хромат-ион. Вследствие того, что ионнаясила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне,где находится непоглощающий ион, эквивалентно уменьшается концентрацияпоглощающего иона. В этом случае на электрофореграмме будут наблюдатьсяобратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациямопределяемых ионов. В дальнейшем, при компьютерной обработке результатовизмерений, график «переворачивается» и приобретает вид, удобный длярассмотрения, с положительно расположенными пиками.

Таким образом, вариантзонного капиллярного электрофореза с модификацией поверхности капилляра инепрямым детектированием позволяет анализировать компоненты, которые в условияхпроведения анализа находятся в форме анионов.

Применение

Капиллярный электрофорезблагодаря гибкости метода и широким возможностям имеет множество примененний:

вобласти медицинской диагностики

какприбор для контроля качества медикаментов и пищевых веществ

дляанализа ДНК

дляразделения энантиомеров

В области медицинскойдиагностики капиллярный электрофорез это прибор позволяющий контролироватьуровень медикаментов в крови, моче, ЦСЖ или слюне при минимальнойпробоподготовке или вообще без нее, производить анализ катехоламинов и другихбиогенных аминов крови и мочи.(в комплекте с лазерным флуориметром)

А также производить:
Анализ белков крови и мочи.
Определение гликозилированного гемоглобина при сахарном диабете.
Аномальных гемоглобинов при талассемии и сходных заболеваниях.
Анализ липопротеинов крови.
Анализ биологически активных пептидов в крови и моче.
Изоферментов креатинфосфокиназы, щелочной фосфатазы, и т.п.

Как прибор для контролякачества медикаментов и пищевых веществкапиллярный электрофорезидеален из-за минимальной пробоподготовки, крайней устойчивости к постороннимпримесям в пробе и низкой себестоимости анализа.

Капиллярный электрофорез это единственный в своем роде способ разделения энантиомероввсилу крайней экономичности и большей разрешающей способности по сравнению сНРLC

Высокочувствительный лазерный флуориметр и наборы для DNA позволяют крайнеэффективно производить HLA-типированиеи идентификацию личности по STR участкам ДНК, другие работы с ДНК иРНК. Прекрасное дополнение ПЦР!

Стандартные интерфейсыпозволяют легко подключить прибор к масс-спектрометру. Такой прибор простонезаменим в научной работе, службеСЭС, криминалистике, контроле качества лекарственных средств и пищевых добавок,при допинг- контроле.

Определениепримеси в инсулине

Человеческий инсулин является одним изпервых коммерческих продуктов биотехнологии и генной инженерии. Инсулин какконечный продукт может содержать следы тяжелых металлов. захваченныхпротеиновым скелетом. Капиллярный электрофорез это самый быстрый метод оценкиотносительной чистоты инсулина, не требующий никакой пробоподготовки, кромефильтрации.

Электрофорограмма инсулина

1 — инсулин; 2 — примесь

Анализкриминального использования лекарственных средств,
разделение прокаина, лидокаина и кокаина

Прокаин и лидокаин, лекарственныепрепараты локального анастезиологического действия, часто добавляются к порошкукокаина перед его нелегальным распространением. Отсутствие или присутствие этихкомпонентов и их концентрации могут служить полезным источником информации опроисхождении наркотиков и путей их распространения. Смеси наркотиков частоочень сложны, поэтому возможность сканирования по длинам волн значительноувеличивает вероятность однозначной идентификации.

Электрофорограмма с разверткой по длинам волн: 1 — прокаин; 2 — кокаин; 3 — лидокаин

Заключение

На сегодняшний денькапиллярный электрофорез является одним из наиболее перспективных методованализа, он динамично развивается и получает всё более широкое применение вразличных областях аналитической химии. Простота и доступность этого метода, атакже неоспоримые преимущества, которые он даёт при выполнении измерений,позволяют надеяться на динамичное развитие методического обеспечения искорейшее включение капиллярного электрофореза в перечень физико-химическихметодов анализа, наиболее часто применяемых в повседневной лабораторнойпрактике.

Для регистрации сигналов всистемах капиллярного электрофореза используются флуориметрические детекторы,детекторы с использованием фотодиодных линеек, масс-спектрометрическиедетекторы и т.п. В качестве аналитических методов, помимо капиллярного зонногоэлектрофореза, используются мицеллярная электрокинетическая хроматография,капиллярная электрохроматография, изотахофорез, капиллярный гель-электрофорез,капиллярная изоэлектрическая фокусировка и др

ЛИТЕРАТУРА

Духин С.С., Дерягин Б.В. Электрофорез, М: Наука,1976. www.geocities.com/novedu/2001/forez <a href=«www.chemreactiv.ru/?page=»8139638271">www.chemreactiv.ru/?page=8139638271 www.textronica.com/aplicate/ electrophoresis/application_list.htm www.grohmann.ru/phores/phores.htm

еще рефераты

Еще работы по химии

Реферат по химии

Поверхностно-активные вещества