Реферат: Антиатерогенна дія кріоконсервованої плаценти при експериментальному атеросклерозі

--PAGE_BREAK--Електронно-мікроскопічні методи оцінки стану аорти кролів. Фіксовані в 2,5% розчині глютарового альдегіду шматочки артерій використовували для електронно-мікроскопічного вивчення ультраструктурних особливостей люмінальної поверхні судин методом скануючої електронної мікроскопії (СЕМ). Шматочки тканини аорти розміром 0,4х0,4 см зневоднювали в батареї спиртів висхідної концентрації і напиляли у вакуумі сріблом, золото-паладієм і досліджували в СЕМ РЕМА-202 (м. Суми). Для вивчення особливостей мікроархітектоніки внутрішньої еластичної мембрани (ВЕМ) аорти шматочки судин піддавали лужній дисоціації за методикою (Song S. H., 1983, 1984), промивали у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) і підготовляли до дослідження в СЕМ за наведеною методикою. Для дослідження в трансмісійному електронному мікроскопі (ТЕМ) зразки тканин дофіксовували в 1% розчині чотирьохосмію, відмивали у ФСБ, зневоднювали в спирті, ацетоні й заливали в епон-аралдіт (Fluka, Швейцарія). Ультратонкі зрізи контрастували уранілацетатом, цитратом свинцю й досліджували в ТЭМ JEOL-100.
Отримані результати обробляли статистистичним методом Вілкоксона-Уітні-Манна та каноничної корреляції за допомогою пакету компютерних програм «Statgraph 2.0. », ”Microsoft Exel”. Рівень вірогідності складав 0,05 та 0,01.
Використані в дисертаційній роботі матеріали і методи були розглянуті та узгоджені з комісією з біоетики ІПКі К НАН України.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Динаміка показників ліпідного обміну в крові кролів при моделюванні експериментального атеросклерозу. За результатами проведеного біохімічного дослідження встановлено, що годування тварин протягом шести місяців холестерином привело до помірної гіперхолестеринемії з переважним зростанням атерогенних фракцій і зниженням рівня антиатерогенних ліпопротеїдів. Одержані результати при створенні моделі експериментального атеросклерозу в кролів співпадали з данними літератури (Аничков Н.Н., 1913, Климов А.Н., 1999).
Результати порівняльного аналізу біохімічних даних показали, що відміна атерогенної дієти (АТД) приводило до 4-кратного зниження рівня ЗХС вже на першому тижні до 3,79±35 ммоль/л (табл.1). Зниження рівня ЗХС супроводжувалося зниженням концентрації ЛПНЩ до значень 2,67±0,25 ммоль/л. При падінні рівня ЗХС і ЛПНЩ збільшувалося концентрація ЛПВЩ до 0,35±0,03 ммоль/л і невірогідно зростали рівні ТГ і ЛПДНЩ у сироватці крові. На другому тижні зниження рівнів ЗХС і ЛПНЩ було вірогідним і становило 2,07±0,2 і 0,76±0,07 ммоль/л відповідно. При цьому рівні ТГ і ЛПДНЩ збільшувалися майже в 2 рази в порівнянні з першим тижнем. Рівень ЛПВЩ знижувався на 2-й тиждень і становив 0,16±0,01 ммоль/л, що впливало на КА (11,94±1,02).
До кінця 3-го тижня регресу показники рівня ЗХС незначно збільшилися (2,63±0,24 ммоль/л) відносно попереднього строку, при цьому відзначався феномен збільшення концентрації ЛПНЩ у порівнянні з 2-м тижнем експерименту (табл.1). Рівні ТГ і ЛПДНЩ також знизились майже в 2 рази й становили відповідно 1,49±0,11 і 0,68±0,05 ммоль/л.
У порівнянні з 2-м тижнем рівень ЛПВЩ підвищився у 2 рази, (0,32±0,02 ммоль/л) і майже досягав значень, які були установлені у інтактних тварин.
Дослідження показників ліпідного обміну після введення АКП виявило різке 5-кратне зниження рівня ЗХС вже на 1-му тижні у порівнянні з таким на піку атеросклероза. Рівень атерогенних ліпопротеїдів знижувався до 0,42±0,04 ммоль/л, що в 30 разів нижче, ніж на піку розвитку процесу. Значення ТГ і ЛПДНЩ були вищими, ніж при спонтанному регресі та склали 3,55±0,34 і 1,63±0,16 ммоль/л відповідно, тобто вищі в 2 рази у порівнянні з групою контролю (табл.1). Рівень антиатерогенних ліпопротеїдів на 1-му тижні знижувався й становив 0,28±0,02 ммоль/л. На 2-му тижні деяке зниження рівня ЗХС супроводжувалося зменшенням концентрації ТГ і ЛПДНЩ в 2 рази та приводило до 3-кратного зростання концентрації ЛПНЩ. До кінця 3-го тижня на тлі подальшого зниження ЗХС рівень ЛПВЩ досягав значень, встановлених у контрольних тварин. Вміст ТГ, ЛПДНЩ, ЛПНЩ знижувався, забезпечуючи КА 3,83±041, це значення було навіть нижчим, ніж у групі контрольних тварин.
Надалі до виведення тварин з експерименту параметри ліпідного обміну вірогідно не змінювалися й не перевищували показників контрольної групи.
Дослідження показників рівня естрадіолу у сироватці крові показали, що в нормі рівень естрадіолу становить 42,4±5,92 пг/мл, годування кролів холестерином протягом 180 діб призводить до зниження цього показника майже удвічи 21,86±6,48 пг/мл (табл.2). Після відміни холестеринової дієти вже на 1-му тижні регресу рівень естрадіолу знизився до 9,65±0,75 пг/мл. Поступове невірогідне зменшення рівня естрадіолу продовжувалось до кінця 3-го тижня.

Таблиця 1.
Динаміка показників ліпідного обміну в сироватці крові
експериментальних тварин у нормі, на піку розвитку моделі, при
регресі атеросклерозу та введенні АКП (ммоль/л)
Группи тварин
ЗХС
ЛПВЩ
ТГ
ЛПДНЩ
ЛПНЩ
КА
Інтактні тварини
2,87±0, 19
0,33±0,03
1,70±0,16
0,78±0,07
1,82±0,18
8,07±0,81
Пік моделі
12,76±1,22*#
0,25±0,02#
1,45±0,10
0,66±0,05
11,86±1,21*#
47,64±4,16*#
1 тижд.
регрес
3,79±0,35*
0,35±0,03*
1,84±0,18
0,84±0,07
2,67±0,25*#
10,23±1,12*
2 тижд.
регрес
2,07±0, 20*
0,16±0,01*#
2,88±0, 19*#
1,32±0,09*#
0,76±0,07*#
11,94±1,02#
3 тижд.
регрес
2,63±0,24*
0,32±0,02*
1,49±0,11*
0,68±0,05*
1,62±0,26*
7,29±0,96*
1 тижд.
АКП
2,48±0,23*
0,36±0,03
3,55±0,34*#
1,63±0,16*#
0,42±0,04*#
6,15±0,60*#
2 тижд.
АКП
2,42±0,14#
0,28±0,02*
1,73±0,16*
0,79±0,07*
1,35±0,12*
8,16±0,89
3 тижд.
АКП
1,45±0,04* #
0,36±0,01*
0,72±0,11*#
0,33±0,05*#
0,76±0,04* #
3,83±0,41* #
Примітка: * — розходження показників ліпідного обміну вірогідні відповідно до попередніх в ході експерименту, р< 0,05; # — розходження показників ліпідного обміну вірогідні відповідно до групи контролю, р< 0,05.
У групі тварин після введення АКП також спостерігалось зниження рівня естрадіолу відносно показників на піку моделі (13,93±3,74 пг/мл), але рівень естрадіолу був вірогідно вищий, ніж у підгрупі з регресом атеросклерозу, в аналогічні терміни спостереження.
Надалі спостерігалося поступове невірогідне зменшення рівня естрадіолу, яке продовжувалось до кінця 3-го тижня. При порівняльному аналізі показників рівня естрадіолу у наведених підгрупах встановлено, що його рівень протягом 3-х тижнів був вірогідно вище у 2-й підгрупі тварин.

Таблиця 2.
Динаміка показників рівня естрадіолу в сироватці крові
експериментальних тварин, пг/мл
Групи тварин
Тижні експерименту
1 тиждень
2 тиждень
3 тиждень
Контроль
42,4±5,92
Пік моделі
21,86±6,48
Спонтанний регрес
9,65±0,75
8,85±1,47
8,63±0,24
Введення АКП
13,93±3,74*
14,8±2,36*
14,65±2,2*
Примітка: * — розходження показників вірогідні відповідно до підгрупи зі спонтанним регресом, р< 0,05.
Кореляційний аналіз між показниками ліпідного обміну та рівнєм естрадіолу в сироватці крові виявив прямий вірогідний зв’язок між показниками ЗХС та ЛПНЩ у двох досліджуваних підгрупах (табл.3).
Таблиця 3.
Коефіцієнт кореляції між показниками ліпідного обміну та
показниками рівня естрадіолу в сироватці крові експериментальних
тварин
Підгрупи тварин
Показники ліпідного обміну
ЗХС
ЛПНЩ
Регрес моделі
r = 0,996
p = 0,003
r = 0,995
p = 0,007
Введення АКП
r = 0,99
p = 0,01
r = 0,998
p = 0,001
Таким чином, порівняльний аналіз стану ліпідного обміну при спонтанному регресі атеросклерозу і при такому з введенням АКП, встановив істотні вірогідні розходження у темпі та якості змін ліпідного спектра.
Отримані дані свідчать про те, що введення АКП на тлі регресу стимулює нормалізацію показників ліпідного обміну у експериментальних тварин, і, можливо, сприяє регресу атеросклеротичного процесу.
Таким чином, введення АКП на тлі регресу впливає на рівень естрадіолу в сироватці крові експериментальних тварин, за рахунок дії естрадіолу та можливо, посилює захват ЛПНЩ гепатоцитами через рецептор-обумовлений механізм.
Частота й поширеність осередків ліпоїдозу в інтимі аорти кролів в експерименті.
При дослідженні аорт інтактних тварин осередки ліпоїдозу не спостерігались.
Аналіз поширеності осередків ліпоїдозу на піку розвитку атеросклерозу показав, що середній відсоток площі поразки грудного відділу аорти склав 46,51±13,85%. Морфометрично поширеність осередків ліпоїдозу у тварин з регресом (6 тижнів) становила 7,06±4,38%, що було вірогідно нижче, ніж у тварин на піку моделі (р<0,05). Після введення АКП поширеність осередків становила 0,89±0,37%, що було вірогідно нижче, ніж у тварин на піку моделі й при спонтанному регресі (р<0,05).
У тварин після введення АКП у ділянках типового розташування ліпідних утворень виявлялися чашеподібні вдавлювання. Ділянки суданофілії виявлялися навколо чашеподібних вдавлювань. Мікроскопічний аналіз чашеподібних вдавлень показав, що їх локалізація відповідала розташуванню атеросклеротичних бляшок. Стінка аорти в цих ділянках стоншена, на краях — потовщена й трохи піднята над люмінальною поверхнею у вигляді суданофільного валика.
Результати візуально-планіметричного дослідження показали, що частота й поширеність осередків ліпоїдозу залишалися вірогідно вищими в групі тварин зі спонтанним регресом атеросклерозу, ніж у підгрупі введення АКП.
Характеристика осередків ліпоїдозу аорти при моделюванні експериментального атеросклерозу, при його спонтанному регресі й на тлі введення АКП. При моделюванні атеросклерозу на люмінальній поверхні аорти виявлено 2 види осередків ліпоїдозу: ліпідні смужки та бляшки.
При регресі атеросклерозу неоінтимальні ділянки зустрічалися винятково в місцях гемодинамічної травматизації. Середня третина медії аорти петрифікована, осередки кальцинозу були або кільцеподібної форми, охоплюючи периметр судини, або у формі напівмісяця. У ділянках медії аорти з петрифікатами відзначали масивну круглоклітинну інфільтрацію з боку інтими та адвентиції.
У місцях чашеподібних вдавлювань, виявлених у стінці аорти на тлі введення АКП, гістологічно визначалося стоншення медії аорти в центрі та валикоподібні стовщення стінки по краях. Верхівки валикоподібних стовщень, розташованих проти току крові, були утворені скупченнями пінистих клітин і макрофагів, які були розташовані перпендикулярно внутрішній еластичній мембрані. При детальному аналізі судинної мережі, розташованої в субендотеліальному просторі, доведено, що вона являє собою систему vasa vasorum, утворену моношаром ендотелію, та безпосередньо примикає до гладком’язових клітин.
Таким чином, у середній третині медії аорти, де на піку холестеринової моделі виявлялися ділянки дистрофії та некрозу, розташовувалися ділянки кальцинозу. Реакція судинної стінки на петрифікацію полягає в гіперплазії модифікованих гладком’язових клітин середньої оболонки, які лізують петріфикат і транспортують продукти лізису за системою vasa vasorum у венозні й лімфатичні колектори адвентиції аорти. Введення АКП перешкоджає петрифікації стінки аорти. Наші дослідження доводять, що цей ефект досягається прискореним зворотним розвитком атеросклеротичних уражень за рахунок участі клітинних елементів крові та стимуляції неоангіогенезу. Після введення АКП у середній оболонці аорти бурхливо розвивається мережа vasa vasorum, яка досягає внутрішньої еластичної мембрани й поширюється в субендотеліальний простір. Такий потужний судинний дренаж, досягаючи основи бляшки, призводить до швидкої резорбції атероматозного ядра та утворення описаних чашеподібних вдавлювань. На наш погляд, прискорений регрес атеросклерозу аорти у кролів можна пояснити тим, що введення АКП стимулює ангіогенез і сприяє прискореному регресу за рахунок посилення трофіки в місцях атеросклеротичних уражень.
Експериментальна гіперхолестеринемія й лейкоцитарний кліренс ліпідів при введенні АКП. Згідно з даними деяких авторів, зворотний транспорт надлишку холестерину з інтими артерій може здійснюватися шляхом ретроендоцитозу ендотеліальними клітинами, а також за рахунок лейкоцитарного кліренсу ліпідів з осередків атеросклеротичних уражень (Gerrity R. G., 1981; Климов А.Н. 1986). У тварин контрольної групи кількість «ліпіднавантажених» лейкоцитів крові не перевищувала 12%.
Результати порівняльного аналізу динаміки процентної кількості «ліпіднавантажених» лейкоцитів в ході експерименту подані на рис.1.
<shapetype id="_x0000_t75" coordsize=«21600,21600» o:spt=«75» o:divferrelative=«t» path=«m@4@5l@4@11@9@11@9@5xe» filled=«f» stroked=«f»><path o:extrusionok=«f» gradientshapeok=«t» o:connecttype=«rect»><lock v:ext=«edit» aspectratio=«t»><imagedata src=«58363.files/image001.emz» o:><img width=«324» height=«232» src=«dopb254630.zip» v:shapes="_x0000_s1026">
При моделюванні атеросклерозу процентне число ліпіднавантажених лейкоцитів до 23 тижня становило 28% від загального числа лейкоцитів, до 24 тижня їх кількість знижувалась до 14%, потім поступово зростало й на піку моделі становила близько 35%. Протягом наступного тижня відзначалося зростання їхнього числа до 40%.
Рис.1. Лейкоцитограма крові кролів на піку розвитку експериментального атеро-склерозу, його регресу та після введення АКП
Що стосується введення АКП на тлі регресу, то процентна кількість «ліпіднавантажених» лейкоцитів після введення знижувалося на першому тижні до 24%, на 2-му тижні становила 16% і на 3-му — 9%. По цитологічним і морфометричним показникам ці клітинні елементи відповідали моноцитам і сегментоядерним лейкоцитам.
З огляду на різну динаміку зміни процентного числа «ліпіднавантажених» лейкоцитів у крові в ході експерименту, нами проаналізований ступінь можливих взаємозв'язків між числом «ліпіднавантажених» клітин і показниками ліпідного обміну при спонтанному регресі й такому при введенні АКП (табл.4).
При цьому (див. табл.4) найбільш вірогідні та значні взаємозв'язки існували: з ТГ, ЛПДНЩ, ЛПВЩ.
Наявність ліпідних включень у цитоплазмі лейкоцитів свідчить про існування механізму кліренсу ліпідів із крові. При введенні кріоконсервованої плаценти високий кореляційний взаємозв'язок між кількістю «ліпіднавантажених» лейкоцитів і ТГ, ЛПВЩ, ЛПДНЩ свідчить про участь лейкоцитів у прискореній утилізації атерогенних фракцій холестерину із крові.
Порівняльна морфологічна оцінка ангіотрофичних ефектів кріоконсервованої плаценти. Дані морфологічного дослідження показали, що у кролів 3-ї підгрупи 2-ї групи відзначалося стовщення інтими в магістральних судинах коронарних артерій, що приводило до редукції кровотоку, дистрофії кардіоміоцитів і розвитку осередкового кардіосклерозу.
Таблиця 4
Коефіцієнт кореляції між показниками ліпідного обміну й процентною кількістю «ліпіднавантажених» лейкоцитів у крові
Показники ліпідного обміну
Групи тварин
ЗХС
ЛПНЩ
ЛПДНЩ
ТГ
ЛПВЩ
Регрес моделі
r = 0,48
p = 0,58
r = 0,41
p = 0,59
r = 0,11
p = 0,6
r = 0,1
p = 0,89
r = 0,63
p = 0,37
Введення АКП
r = 0,01
p = 0,98
r = 0,08
p = 0,91
r = 0,98
p = 0,01
r = 0,98
p = 0,01
r = 0,98
p = 0,02
У кролів 1 підгрупи через 6 тижнів не спостерігалося регресу атеросклеротичних змін в артеріях і збільшення щільності розподілу інтрамуральних судин. Введення АКП приводило до регресу атеросклеротичних уражень у магістральних судинах коронарних артерій і до прискореного ангіогенезу інтрамуральних судин міокарда, що підтверджується вірогідним збільшенням їх щільності на одиницю площі серцевого м'яза (табл.5).
Отже, отримані дані вказують на те, що введення АКП сприяє прискореному зворотному розвитку експериментального атеросклерозу й неоваскуляризації міокарда.
Таблиця 5.
Щільність розподілу інтрамуральних судин у міокарді в ході
експерименту (1/мм2).
Контроль
Пік моделі
Регрес
Введення АКП
4,5±0,5
2,5±1,5*
2,36±0,36*
5,0±1,0**
    продолжение
--PAGE_BREAK--