Реферат: Мікробіологічне обгрунтування нових підходів до лікування та профілактики стафілококових інфекцій
--PAGE_BREAK--Здійснено широкомасштабне цілеспрямоване тестування екстрактів лікарських рослин флори України, що належать до різних таксономічних груп, на предмет виявлення природних джерел сполук з високим рівнем прямої протимікробної активності відносно MRS та імуномодулюючими властивостями, а також сполук нового виду фармакологічної дії – модифікаторів антибіотикорезистентності бактерій. Встановлено закономірності продукції метаболітів, які здатні модифікувати антибіотикорезистентність стафілококів, рослинами різних таксономічних груп, а також удосконалено методику їх спрямованого пошуку.Одержані результати істотно розширюють існуючі уявлення про фармакологічні властивості офіцинальних і неофіцинальних лікарських рослин, фармакопейних фітопрепаратів. Вперше виявлено і докладно вивчено виражену здатність компонентів водно-етанольного екстракту бруньок берези бородавчастої Betula verrucosa Ehrh. дозозалежним чином відновлювати чутливість поліантибіотикорезистентних штамів стафілококів до b-лактамних антибіотиків, макролідів, лінкозамідів, тетрациклінів і фторхінолонів. Розроблено технологію одержання модифікаторів антибіотикорезистентності стафілококів з фармакопейної рослинної сировини – бруньок берези бородавчастої (Патент України UA № 27940).
Практичне значення одержаних результатів. За результатами дисертаційного дослідження у Прикарпатському регіоні впроваджено постійно діючу динамічну багаторівневу систему епідеміологічного моніторингу (з елементами зворотного зв’язку) за розповсюдженням MRS в лікувальних закладах, що дозволило в 2003-2006 рр. досягнути зниження частоти та інтенсивності епідемічних спалахів, а також загального поширення MRS-інфекцій у великих багатопрофільних клініках.
З метою попередження внутрішньолікарняного поширення MRS рекомендуються бацилоцид, хлоргексидин, етоній та хлорофіліпт. Для епідеміологічного контролю за виникненням і поширенням внутрішньолікарняних спалахів інфекції MRS рекомендується визначення і співставлення антибіотикотипів виділених штамів. Для диференціації метіцилінрезистентних стафілококів (MRSA, MR-CNS) та стафілококів з пограничною метіцилінрезистентністю (BSSA, BS-CNS) при проведенні ретроспективного епідеміологічного аналізу слід використовувати матеріали досліджень чутливості штамів одночасно до оксациліну і цефазоліну. Встановлено регіональні особливості чутливості до антибіотиків метіцилінчутливих (MS-) і метіцилінрезистентних (MR-) штамів S. aureus та CNS, а також штамів з пограничною метіцилінрезистентністю, що доцільно використовувати при виборі антимікробних препаратів з лікувальною метою.
Розроблено комплексну лікувальну композицію етонію, амізону і силларду-П з протимікробними, протизапальними та імуномодулюючими властивостями (Патент України UA №19175), яка проявляє виражений терапевтичний ефект при хронічному генералізованому пародонтиті і може використовуватися для місцевого лікування інших гнійно-запальних процесів.
Відповідно до актуальних клінічних вимог удосконалено методологію первинного скринінгу і поглибленого мікробіологічного дослідження потенційних кандидатів у протимікробні лікувальні засоби, в основу яких покладено застосування в якості тест-об’єктів сучасних клінічних ізолятів з ідентифікованими детермінантами антибіотикорезистентності (продукція пеніцилінзв’язуючого білка PBP2symbol 162 \f «Symbol» \s 14ў, функціонування ефлюксних механізмів резистентності до фторхінолонів NorA, макролідів MsrA, тетрациклінів TetK) і репрезентативних панелей всесторонньо охарактеризованих штамів. Використані в дисертаційній роботі 17 авторських штамів S. aureus і 19 штамів CNS (виділених з клінічного матеріалу в 2000-2005 рр.) прийняті на зберігання до колекції філії музею мікроорганізмів ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України" (м. Харків) та в музей патогенних для людини мікроорганізмів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (м. Київ). Використання вказаних штамів стафілококів іншими колективами дослідників дозволить підвищити і підняти на якісно новий рівень інформативність розробок в області створення нових вітчизняних протимікробних засобів.
Виявлення нових видів лікарської рослинної сировини, що є джерелами сполук з високим рівнем прямої протимікробної активності відносно MRS, антиадгезивними, імуномодулюючими властивостями та низьким рівнем цитотоксичності відкриває широкі перспективи для розробки вітчизняних фітопрепаратів. Завершено доклінічне дослідження нового ефективного протимікробного засобу – настоянки бруньок берези (Патент України UA № 27940).
В межах первинного етапу складного багатостадійного процесу створення нового фармацевтичного засобу охарактеризовано синтетичні сполуки (L-131, M-116), які володіють значною протимікробною активністю відносно MRS і низьким рівнем токсичності. Вказані сполуки, а також похідні 2-(5-арил-2-фурил) — 4-хінолінкарбонових кислот (Патент України UA № 23769) і четвертинні солі N-феніл-6-(p-диметиламінобензиліден) циклопента [с] хінолінію доцільно використовувати для конструювання антисептиків і дезинфектантів.
Результати дослідження теоретично обгрунтовують новий напрямок подолання антибіотикорезистентності стафілококів – комбіновану хіміотерапію із застосуванням модифікаторів резистентності синтетичного або природного походження. Розроблено оригінальну просту і достатньо чутливу методику для скринінгу сполук (як природного, так і синтетичного походження) на здатність відновлювати чутливість резистентних штамів мікроорганізмів до класичних антибіотиків (Патент України UA 27939).
Результати дослідження рекомендовані і використовуються в програмах навчання лікарів, фармацевтів і біологів на кафедрах вищих навчальних закладів та в системі післядипломної освіти (Львівський і Вінницький національні медичні університети, Івано-Франківський, Буковинський, Тернопільський, Одеський медичні університети, Львівський національний університет ім. І. Франка, Прикарпатський державний університет), для контролю за якістю протимікробних фітопрепаратів при їх виробництві.
Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно провів патентно-ліцензійний пошук, сформулював тему і мету, розробив методологію виконання роботи, оформив усі наукові публікації, написав усі розділи дисертації, сформулював висновки та практичні рекомендації.
Вивчені у дисериаційній роботі гетероциклічні сполуки синтезовані вітчизняними хіміками: проф. Р.Б. Лесиком на кафедрі фармацевтичної, органічної і біоорганічної хімії Львівського Національного медичного університету ім. Д. Галицького (похідні тіазолідину і споріднені гетероциклічні структури), проф. М.Д. Обушаком на кафедрі органічної хімії Львівського Національного університету ім.І. Франка (похідні тіазолідину, тіазолу, фурану, хіноліну), доц. М.В. Мельник на кафедрі біологічної і біонеорганічної хімії Івано-Франківського державного медичного університету (похідні оксополігідроакридинів) і доц. З.Л. Новицьким на кафедрі хімії фармацевтичного факультету Івано-Франківського державного медичного університету (четвертинні солі циклопента [с] хінолінію). Заготівлю рослинної сировини, її ідентифікацію та екстрагування здійснено автором особисто. Автор висловлює подяку доц. Б.М. Зузуку (кафедра фармакогнозії і ботаніки фармацевтичного факультету Івано-Франківського державного медичного університету) за цінні поради з оптимізації способів та режимів екстрагування рослинної сировини.
Особисто здобувачем за робочою документацією клінічних бактеріологічних лабораторій лікувально-профілактичних закладів м. Івано-Франківська і області виконано епідеміологічний аналіз стафілококових інфекцій, вивчено закономірності поширення антибіотикорезистентних (в тому числі метіцилінрезистентних) стафілококів у регіоні. У бактеріологічній лабораторії кафедри мікробіології Івано-Франківського державного медичного університету від пацієнтів з гнійно-септичними і запальними процесами різноманітної локалізації здобувачем особисто впродовж 2000-2006 рр. виділено 360 штамів стафілококів. Вказані ізоляти, а також 170 штамів стафілококів, які були передані у лабораторію кафедри для подальшого вивчення з бактеріологічної лабораторії Івано-Франківської ОКЛ та міської централізованої бактеріологічної лабораторії, особисто здобувачем ідентифіковані, досліджені на чутливість до сучасних антибіотиків, антисептиків, дезинфікуючих засобів і офіцинальних фітопрепаратів. Самостійно встановлено механізми резистентності клінічних штамів до оксациліну, макролідів, тетрациклінів, фторхінолонів. Автором особисто відібрано і підготовлено до депонування в національних колекціях 36 клінічних штамів стафілококів (17 штамів S. aureus і 19 штамів CNS) з різними профілями антибіотикорезистентності. Самостійно розроблено алгоритми пошуку синтетичних і природних сполук з протимікробною активністю відносно MRS, відібрано типові клінічні ізоляти стафілококів для використання в якості тест-штамів при первинному мікробіологічному скринінгу, сформовано репрезентативні панелі штамів для поглиблених мікробіологічних досліджень.
Особисто здобувачем виконано первинний мікробіологічний скринінг 316 нових синтетичних сполук і 359 рослинних екстрактів з використанням в якості тест-культур колекційних і відібраних клінічних штамів MS — та MR-стафілококів різної видової належності. Самостійно визначено рівні протимікробної дії найбільш перспективних за результатами первинного скринінгу сполук і рослинних препаратів на сформованих панелях 50-150 клінічних штамів стафілококів з різними профілями і детермінантами антибіотикорезистентності. Автором особисто здійснено узагальнення результатів мікробіологічного дослідження, аналіз залежності протимікробної активності синтетичних сполук від їх структури. На основі результатів аналізу «структура – активність» дисертантом самостійно сформульовано пропозиції для хіміків-синтетиків щодо напрямків оптимізації структур-лідерів, що забезпечило можливість одержання нових серій активних сполук для мікробіологічного тестування. Докінгові дослідження афінності 4-азолідонів до ензиму біосинтезу пептидоглікану MurB виконані при допомозі проф. Р.Б. Лесика на кафедрі фармацевтичної, органічної і біоорганічної хімії Львівського Національного медичного університету ім. Д. Галицького.
Здобувачем особисто розроблено стратегію пошуку в рослинній сировині сполук нового спрямування дії – модифікаторів антибіотикорезистентності бактерій. Самостійно виконано дослідження синергізму протимікробної дії рослинних екстрактів і класичних антибіотиків відносно резистентних штамів стафілококів. Особисто вивчено вплив рослинних екстрактів на динаміку росту мікробних культур та адгезивні властивості стафілококів. Дослідження здатності рослинних екстрактів індукувати продукцію ендогенного IFN і TNF-a виконано за участю канд. мед. наук Н.М. Жолобак у відділі інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (зав. – докт. біол. наук., засл. діяч науки і техніки України, чл. -кор. НАН України, проф. М.Я. Співак).
Токсикологічні експерименти виконано за участю І.О. Нектєгаєва (Львівський Національний медичний університет ім. Д. Галицького) і проф. С.Б. Геращенка (Івано-Франківський державний медичний університет).
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації дисертації доповідались і обговорювались на ІX і Х з’їздах Товариства мікробіологів України (Чернігів, 2000; Одеса, 2004), 2-му з’їзді фтизіатрів і пульмонологів України (Київ, 1998), VІІ і VІІІ ювілейному з’їздах Всеукраїнського лікарського товариства (Тернопіль, 2003; Івано-Франківськ, 2005), VII, ІХ і Х Конгресах Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (Львів, Трускавець, 2000; Луганськ, 2002; Чернівці, 2004), на V Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених, приуроченому до 10-ї річниці незалежності України (Тернопіль, 2001), міжнародних конференціях пам’яті Р. Вейгля International Weigl Conference «Microorganisms in Pathogenesis and their Drug Resistance» (Lviv, 2003), «Chemistry of Nitrogen Containing Heterocycles» (Kharkiv, 2003), «Новые технологии получения и применения биологически активных веществ» (Алушта, 2002), «Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих регіонів» (Чернівці, 1999), міжнародних науково-практичних конференціях «Лекарства – человеку» (Харків, 2000), «Пробіотики – ХХІ століття: Біологія. Медицина. Практика» (Тернопіль, 2004), IV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології «Актуальні питання фармакології» (Вінниця, 2004), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Сучасні досягнення фармацевтичної науки та практики» (Запоріжжя, 2006), XXІ Українській конференції з органічної хімії (Чернігів, 2007), науково-практичних конференціях з міжнародною участю «Сепсис: Проблеми діагностики, терапії та профілактики» (Харків, 2006), «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (Тернопіль, 2006), «Сучасний стан і актуальні проблеми ортопедичної стоматології» (Івано-Франківськ, 2005), регіональній науково-практичній конференції «Антибіотикотерапія у внутрішній медицині і хірургії» (Івано-Франківськ, 2006), на Всеукраїнському науково-практичному семінарі «Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії» (Харків, 2004), 9-ій науковій конференції «Львівські хімічні читання – 2003» (Львів, 2003), науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження проф. Калини Георгія Платоновича «Розвиток санітарної мікробіології в Україні» (Чернівці, 2002), на науковій конференції, присвяченій 50-й річниці з часу заснування Івано-Франківської державної медичної академії (Івано-Франківськ, 1995), на підсумкових наукових конференціях Івано-Франківського державного медичного університету (1998, 2003, 2007), на засіданнях Івано-Франківського обласного товариства мікробіологів і епідеміологів.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 76 наукових робіт, серед них 37 статей у фахових наукових журналах і збірниках, рекомендованих ВАК України для публікації результатів дисертаційних досліджень, отримано 6 патентів України на корисні моделі і винаходи (і 1 позитивне рішення за заявкою на винахід), підготовлено до друку монографію.
Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 319 сторінках комп’ютерного тексту, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, 7 розділів власних досліджень з 40 рисунками і 63 таблицями, розділ аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновки, практичні рекомендації, список використаної літератури, який налічує 494 джерела (85 кирилицею і 409 латиною), а також 14 додатків, викладених у окремому томі на 289 сторінках.
Основний зміст роботи У вступі проаналізовано фактори, які сприяють формуванню і поширенню поліантибіотикорезистентних штамів стафілококів у сучасних умовах. Наголошується на відсутності у вітчизняних лікувальних закладах систем мікробіологічного моніторингу та протиінфекційного контролю, що призводить до порушення основних принципів застосування протимікробних препаратів. Обгрунтовано актуальність теми дисертаційного дослідження, викладено мету та завдання, які розв’язувались при його виконанні. Визначено зв’язок роботи з державними науковими програмами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, наведено дані щодо апробації дослідження, вказано обсяг і структуру дисертації.
У першому розділі подано огляд літератури, в якому стисло викладено проблему глобального поширення у світі MRSA і MR-CNS, охарактеризовано їх роль у виникненні опортуністичних та нозокоміальних інфекцій в сучасних умовах. Акцентовано увагу на механізмах метіцилінрезистентності стафілококів та їх асоційованої резистентності до антибіотиків інших груп, синтетичних хіміотерапевтичних засобів, антисептиків, дезинфектантів. Крім того, критично проаналізовано сучасні засоби і підходи до лікування інфекцій, спричинених MRS.
У другому розділі охарактеризовано матеріали, методи та обсяг виконаних досліджень. Із 1990 р. виконується постійний моніторинг за характером мікрофлори, що виділяється від пацієнтів у лікувальних закладах різного профілю м. Івано-Франківська і області. На основі комп’ютерної програми WHONET 5.1 (http: // www. who. int/drugresistance/whonetsoftware/en/) створена постійно поповнювана база даних, яка містить результати мікробіологічного дослідження різних видів клінічного матеріалу (включаючи антибіотикограми збудників) з докладною інформацією про відповідних пацієнтів. Проаналізовано результати вивчення чутливості до антибіотиків різних груп 9980 ізолятів стафілококів (4271 штамів, або 42,80% S. aureus і 5709 штамів, або 57, 20% CNS), виділених на Прикарпатті в 1990-2006 рр., досліджено епідеміологічні аспекти поширення MRS.
продолжение
--PAGE_BREAK--Для поглибленого мікробіологічного дослідження з визначенням профілів та детермінант антибіотикорезистентності відібрано 530 штамів стафілококів клінічного походження (в тому числі 204 штами S. aureus і 326 штамів CNS), які ідентифікували відповідно до рекомендацій 12-го видання «Визначника бактерій Берджі» за комплексом культуральних і біохімічних властивостей («STAPHYtest 16», Lachema, Чехія). Крім того, в роботі використано 17 колекційних штамів стафілококів з Музею патогенних мікроорганізмів ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМНУ" (м. Харків). Чутливість клінічних і колекційних ізолятів до антибіотиків визначали дискодифузійним методом на середовищі Мюллера–Хінтона з 4% хлориду натрію згідно з рекомендаціями Національного комітету клініко-лабораторних стандартів (NCCLS) США (1999), а також методами серійних розведень в агарі (Красильников А.П., 1995) та бульйоні (Thornsberry C. etc., 1983).
Ідентифікацію метіцилінрезистентних штамів стафілококів здійснювали на основі визначення чутливості до оксациліну методом двократних серійних розведень в сольовому агарі Мюллера–Хінтона та виявлення пеніцилін-зв’язуючого білка PBP2symbol 162 \f «Symbol» \s 14ў (продукту гена mecA) методом латекс-аглютинації (Slidex® MRSA Detection, bioMerieux, Франція). Ідентифікацію ефлюксного механізму резистентності до фторхінолонів здійснювали на основі зміни чутливості ізолятів до ципрофлоксацину в присутності специфічних інгібіторів помпи NorA – 20 мкг/мл резерпіну (Gibbons S. etc., 2003) і 25 мкМ верапамілу (Ince D. і Hooper D. C., 2001). Ефлюксний механізм резистентності стафілококів до макролідів (помпа MsrA) виявляли за зміною чутливості штамів до еритроміцину в присутності суббактеріостатичної концентрації (0,5 мкМ/мл) арсенату натрію (Wondrack L. etc., 1996). Крім того, вивчали чутливість клінічних ізолятів стафілококів до тетрацикліну в присутності 30 мкг/мл резерпіну – неспецифічного інгібітора помпи TetK (Gibbons S. і Udo E. E., 2000; Gibbons S. etc., 2003). Протимікробні концентрації антибіотиків та їх комбінацій з відомими інгібіторами ефлюксних механізмів резистентності визначали мікрометодом серійних розведень в бульйоні (Thornsberry C. etc., 1983).
Виконано первинний мікробіологічний скринінг 316 нових синтетичних гетероциклічних сполук (похідних тіазолідину, тіазолу, фурану, хіноліну та акридину) і 359 рослинних екстрактів (з них 203 водно-етанольні, 156 – органічні) різних органів 155 культивованих і дикоростучих лікарських рослин флори України. Скринінгові дослідження виконано за допомогою розробленої мікромодифікації методу дифузії в агар. Активні препарати досліджено методами серійних розведень в агарі та бульйоні з використанням сформованих тестувальних панелей колекційних і клінічних штамів стафілококів. З метою оцінки і порівняльного аналізу протистафілококової активності препаратів визначали їх ефективні діючі концентрації для груп штамів, сформованих в межах загальної вибірки за ознаками видової належності та антибіотикорезистентності: МБцК90 і МБцК50 (бактерицидні концентрації для 90% і 50% тест-штамів відповідно), МБсК90 і МБсК50 (бактеріостатичні концентрації для 90% і 50% тест-штамів), середні геометричні значення. МБцК і МБсК, співвідношення МБцК/ /МБсК. На основі спостережень за динамікою росту періодичних культур стафілококів визначали коефіцієнти відносного пригнічення росту в присутності різних концентрацій препаратів, розраховували значення ІС50 (концентрацій, що викликають пригнічення росту мікробних культур на 50%) в різні терміни експерименту. За допомогою пробіт-аналізу розраховували також значення Ki – концентрації, яка зумовлює двократне збільшення тривалості часу генерації клітин у логарифмічній фазі росту культур (Sompolinsky D. etc., 1973).
Для вияснення впливу особливостей структури синтетичних сполук на їх протимікробну активність використано QSAR (Quantitative structure-activity relationships) підхід (Khan N. etc., 2006, Kuz’min V. E. etc., 2002). Створені QSAR-моделі дозволили здійснити віртуальний дизайн структур з потенційною протимікробною активністю. Окремі теоретично змодельовані структури було синтезовано, і їх активність відносно MRS підтверджено експериментально.
Комп’ютерне моделювання зв’язування похідних тіазолідину з активним центром ферменту біосинтезу пептидоглікану MurB (гнучкий докінг) проведено з допомогою програми Glide (®Maestro, Macromodel, Schrodinger L. L. C), яка оцінює зв’язування ліганду та мішені з допомогою двох різних скорінгових функцій GlideScore (GS) та EnergyModel(EM) (в т. ч. енергії утворення водневих зв’язків, Ван-дер-Ваальсових взаємодій тощо). Альтернативне докінгове дослідження проведено програмою Fred (®Vida2, Omega, Fred, OpenEye Scientific Software). Для докінгових досліджень структури ферменту MurB обрані з Protein Data Bank (PDB, http: // www. rcsb. org/pdb) з кодами: 2MBR – структура виділена з E. coli (Benson T. E. etc., 1997) та 1HSK – структура виділена із S. аureus (Benson T. E. etc., 2001). Пошук моделей з багатьма змінними та відбір дескрипторів проведено за методом часткових найменших квадратів з використанням програм QSAR (®Gaussian03, Gaussian, Inc) та BuildQSAR (De Oliveira D. B., Gaudio A. C., 2000).
Для скринінгової оцінки синергізму дії синтетичних сполук і рослинних екстрактів з антибіотиками відносно стафілококів застосовану оригінальну просту та достатньо чутливу методику (Патент України UA № 27939). В якості тест-штаму використано докладно охарактеризований авторський штам S. aureus «Кунда» (MecA+NorA+MsrA+TetK+). Крім того, мікрометодом серійних розведень в бульйоні визначали ефективні протимікробні концентрації препаратів при їх ізольованому та поєднаному застосуванні. Біоавтографічні дослідження екстрактів виконано за методом A. Nostro і співавт. (2000).
Фармакологічну активність відібраних рослинних екстрактів оцінювали також за їх здатністю пригнічувати адгезію стафілококів до клітин буккального епітелію людини (Ellen R. P. і Gibbons R. J., 1974), гальмувати розвиток проліферативної фази запалення на моделі ватяної гранульоми (D’Arcy P. F. etc., 1960), індукувати продукцію IFN і TNF в культурах клітин in vitro (Ершов Ф.И. і співавт., 1988; Meager A. etc., 1989). В дослідах in vivo на мишах вивчали вплив рослинних екстрактів на інтерфероновий статус організму (рівень сироваткового IFN, здатність спленоцитів в умовах in vitro синтезувати IFN-б у відповідь на введення віруса хвороби Ньюкастл та IFN-г у відповідь на введення ФГА), фагоцитарну активність макрофагів перитонеального ексудату відносно S. aureus 209-Р (Бутенко Г.М. і співавт., 2001) та їх киснево-залежну кіллерну активність в НСТ-тесті (Грачева М.П., 1984).
Токсикологічні дослідження окремих препаратів включали вивчення їх цитотоксичності in vitro в культурі перитонеальних макрофагів мишей (Вильнер Л.М., 1977). Гостру токсичність сполук in vivo оцінювали при різноманітних шляхах введення за значеннями максимально переносимих (МПД) і летальних доз (LD10, LD50 і LD90), встановленими методом пробіт-аналізу (Біленький М.Л., 1963). Також вивчали ефект кумуляції (Гацура В.В., 1974) та подразнюючу дію препаратів (Ієвлєва Е.А., 1974).
Для статистичної обробки результатів мікробіологічних та імунологічних експериментів застосовано методи варіаційної статистики, одно — і двовибірковий F-тест для дисперсії, кореляційний, лінійний регресійний, одно — і двофакторний дисперсійний (ANOVA), багатофакторний об’єднуючий кластерний аналіз, пробіт-аналіз із використанням спеціалізованих комп’ютерних програм WHONET 5.1, UTHSCSA ImageTool 2.0, STATISTICA for Windows 5.0, MSOffice Excel 2003.
Результати власних досліджень викладені у наступних семи розділах дисертації (3-9).
Аналіз чутливості сучасних клінічних штамів стафілококів до антибіотиків та антисептиків. Створена система моніторингу за збудниками опортуністичних і внутрішньолікарняних інфекцій дозволила з’ясувати особливості епідеміології MRS і штамів з пограничною метіцилінрезистентністю у Прикарпатському регіоні в 1990-2006 рр. У загальній структурі ізолятів стафілококів, визнаних етіологічними чинниками опортуністичних і госпітальних інфекцій, частка MRSA становить 27,0%, MR-CNS – 22,7%, штамів з пограничною метіцилінрезистентністю – 20,6% (BSSA) і 24,4% (BS-CNS). В нестаціонарних умовах MRS виступають в ролі етіологічних факторів нагнійних і запальних процесів значно рідше (4,9-8,8%). За частотою виділення стафілококів з пограничною метіцилінрезистентністю (18,6-23,0%) амбулаторні пацієнти майже не відрізняються від стаціонарних. Основними видами клінічного матеріалу, в якому присутні MRSA є гній, раневий ексудат та мазки з носоглотки. MR-CNS, крім того, досить часто виділяються із сечостатевого тракту. У цих же видах клінічного матеріалу часто присутні стафілококи з пограничною резистентністю до метіциліну. Основна частка MR-ізолятів стафілококів походить від пацієнтів хірургічного профілю. Серед CNS клінічного походження MR-ізоляти належать переважно до видів S. haemolyticus і S. cohnii ssp. cohnii, а BS-штами представлені в основному S. epidermidis і S. haemolyticus. Епідеміологічний аналіз дозволив встановити сезонні та вікові особливості поширення інфекцій, спричинених MRS. На основі співставлення антибіотикотипів виділених штамів ідентифіковано ряд внутрішньолікарняних спалахів MRS-інфекції у великих багатопрофільних стаціонарах. За схильністю до внутрішньогоспітального епідемічного поширення MRS розташовуються в наступному порядку: MRSA > MR-CNS >> BSSA > BS-CNS.
З’ясовано регіональні особливості чутливості до антибіотиків різних груп виділених MR — і BS-штамів S. aureus та CNS. Регіональні ізоляти MRS закономірно характеризуються значною резистентністю до цефалоспоринів, але 66,7-80,0% з них виявляють чутливість до карбапенемів (іміпенему і меропенему). Водночас штами MRSA і MR-CNS володіють високою частотою асоційованої резистентності до аміноглікозидів ІІ покоління (62,5-82,7%), макроділів (66,7-100,0%), лінкозамідів (50,0-96,7%), тетрациклінів (73,9-92,4%), нітрофуранів (60,0-85,7%). Лише 33,3-57,2% ізолятів MRSA проявляють задовільну чутливість до рифампіцину і фузидину. Чутливість до фторхінолонів проявляють 25,0-48,2% штамів MRSA, 25,0-57,1% MR-CNS, 50,0-75,2% BSSA і 50-70,9% BS-CNS. За допомогою регресійного аналізу визначено математичні лінійні функції, які описують темпи набування регіональними ізолятами MR-стафілококів резистентності до офлоксацину. У 1998-2004 рр. спостерігалася стабільна швидкість втрати чутливості до офлоксацину в межах 2,83% штамів на рік, яка за останні 2 роки дещо сповільнилася (до 1,83% штамів на рік).
Регіональні клінічні ізоляти MRS в цілому володіють задовільною чутливістю до ванкоміцину. Середній рівень чутливості до ванкоміцину в штамів MRSA вищий (МПК 2,35 мкг/мл), ніж у MR-CNS (МПК 3,89 мкг/мл). Проте в лікувальних закладах м. Івано-Франківська зареєстровано внутрішньолікарняні спалахи інфекції ванкоміцинрезистентними (VR-) стафілококами та штамами із зниженим рівнем чутливості до ванкоміцину, випадки носійства (в тому числі назофарингеального) цих мікроорганізмів серед клінічно здорових осіб, що робить загрозу їх глобального поширення у регіоні цілком реальною. Серед ізолятів MRSA виявлено 1,93% штамів VISA (S. aureus з помірною чутливістю до ванкоміцину, МПК 8 мкг/мл). Серед клінічних штамів MR-CNS частота поширення VI-CNS становить 12,0%, VR-CNS (з МПК 16-32 мкг/мл) – 6,0%. Переважна більшість VI-CNS і VR-CNS належить до S. haemolyticus (66,6% виявлених ізолятів).
На основі цілеспрямованого пошуку і відбору сформовано тестувальні панелі сучасних клінічних штамів стафілококів з різними профілями антибіотикорезистентності для вивчення протимікробних властивостей природних і синтетичних сполук. У цих штамів фенотипічно ідентифіковано класичну детермінанту метіцилінрезистентності (продукцію пеніцилінзв’язуючого білка PBP2¢) та детермінанти асоційованої резистентності до антибіотиків інших груп, зокрема ефлюксні механізми резистентності до фторхінолонів (помпа NorA), макролідів (MsrA), тетрациклінів (TetK).
Пошук похідних 4-азолідонів з активністю відносно MRS. В результаті тотального високоефективного скринінгу 154 нових синтетичних сполук з тіазолідиновими і спорідненими гетероциклами на 6 штамах MecA– і 7 штамах MecA+ стафілококів та наступного тестування на 50 клінічних ізолятах S. aureus і CNS ідентифіковано три нові класи похідних 4-азолідонів із значною протимікробною активністю відносно MRS:
5- [2-(арилметилокси) — 5-нітрофеніл] метиліден-2-тіоксотіазолідин-4-они;
2,4,5-тризаміщені 4-спіранові похідні тіазолідин-2-ону з піразолобензоксазиновим фрагментом;
похідні 6-оксо-5,6-дигідро [1,3] тіазоло [2,3-b] [1,2,4] тріазол-6-ону.
Досліджені 5-ариліден-2-тіоксотіазолідин-4-они є новою групою ефективних інгібіторів ферментів біосинтезу пептидоглікану S. aureus – MurC (Sim M. M. etc., 2002) і MurG (Helm J. S. etc., 2003). Встановлено критичний позитивний вплив 2-тіоксотіазолідин-4-онового фрагменту в поєднанні з 2-бензилокси-5-нітрофенілметиліденовим радикалом на антимікробну дію. В якості оптимальної структури з протистафілококовою активністю ідентифіковано 5- [2-бензилокси-5-нітрофеніл] метиліден-2-тіоксотіазолідин-4-он (сполука L131). Подальше ускладнення каркасу молекули за рахунок введення додаткових замісників у 2-бензилокси-5-нітрофенілметиліденовий залишок і особливо у різні позиції тіазолідинового циклу негативно відображається на протимікробній активності. Сполука L131 володіє мікромолярним діапазоном протимікробної активності відносно стафілококів (для MecA- S. aureus МБсК 3,85 мкг/мл, МБцК 19,55 мкг/мл; для MecA+ S. aureus – 6,73 і 26,48 мкг/мл відповідно). Її протистафілококова активність близька до активності хлоргексидину та етонію і значно переважає інші антисептики порівняння (ріванол, тімол, мірамістин, повідон-йодид).
Встановлено, що 4-спіранові похідні тіазолідин-2-ону з піразолобензоксазиновим фрагментом відносно MRSA активніші, ніж відносно MSSA. При цьому 2,4-дизаміщені спіранові похідні помітно поступаються за активністю 2,3,4-тризаміщеним і особливо 2,4,5-тризаміщеним. Структурою-лідером на основі проведеного тестування визначено сполуку L115 – 5-феніл-1,10b-дигідропіразоло [1,5-с] [1,3] бензоксазино-2-спіро-4¢- [5¢-(2¢¢-хлор) — бензилметиліден] тіазолідин-2¢-он (відносно MRSA МБсК 20,66 мкг/мл, МБцК 48,68 мкг/мл).
В ході докінгових і 3D-QSAR досліджень перевірено гіпотезу про можливість блокування 4-спірановими похідними тіазолідин-2-ону з піразолобензоксазиновим фрагментом активного центру ензиму MurB синтезу пептидоглікану (рис.1).
<shapetype id="_x0000_t75" coordsize=«21600,21600» o:spt=«75» o:divferrelative=«t» path=«m@4@5l@4@11@9@11@9@5xe» filled=«f» stroked=«f»><path o:extrusionok=«f» gradientshapeok=«t» o:connecttype=«rect»><lock v:ext=«edit» aspectratio=«t»><imagedata src=«66377.files/image001.wmz» o:><img width=«233» height=«280» src=«dopb269604.zip» v:shapes="_x0000_i1025"> <imagedata src=«66377.files/image003.wmz» o:><img width=«242» height=«242» src=«dopb269605.zip» v:shapes="_x0000_i1026">
Рис.1. Біохімічна роль ензиму MurB та імітування похідними 4-тіазолідонів фосфатної групи його природного ліганду.
Задовільні значення скорінгових функцій, що оцінюють якість та енергію зв’язування докованих лігандів (досліджуваних сполук) з молекулою мішені отримано лише для структури 1HSK ферменту MurB S. aureus. Гіпотеза про можливість імітування взаємодії фрагменту фосфатної групи уридиндифосфат-N-ацетилглюкозаміну енолпірувату (Andres C. J. etc., 2000) підтвердилася тільки для активних щодо стафілококів сполук L115 та L103. Cаме 2-оксо-група при тіазолідиновому циклі в цих сполуках відтворює водневі зв’язки атома оксигену фосфату (природнього ліганду UDP-Glc-NAc-EP) з атомами водню амінокислотних залишків Gly-67 та Gly-65 ензиму MurB. У результаті аналізу докованих позицій визначено можливі шляхи модифікації структури для сполук-лідерів з метою покращення афінітету до MurB та протимікробної активності.
На основі виконаних досліджень запропоновано стратегію пошуку нових протимікробних сполук серед 4-азолідонів та споріднених гетероциклічних систем, яка включає комбінаторний підхід до синтезу з комп’ютерною систематизацією даних, поєднання традиційного та віртуального скринінгу і дизайну, QSAR-аналіз. Визначено структурні вимоги для молекулярного дизайну антимікробних 4-азолідонів та споріднених гетероциклічних систем.
Із врахуванням прогностичних даних 2D-QSAR аналізу шляхом цілеспрямованого синтезу отримано похідні 6-оксо-5,6-дигідро [1,3] тіазоло [2,3-b] [1,2,4] тріазол-6-ону (сполуки L-1558 і L-1369), активність яких поширюється на MS — і MR-стафілококи (для MRSA МБсК 18,57-27,60 мкг/мл, МБцК 41,02-74,30 мкг/мл). Співвідношення МБцК/МБсК (2,00-3,17) і характер кривих, що характеризують динаміку росту культур MSSA і MSRA, вказують на не різко виражену бактерицидну активність сполук L-1558 і L-1369. За здатністю викликати двократне продовження тривалості періоду генерації (Ki) в культурах MecA– і MecA+ S. aureus сполуки L-1558 і L-1369 практично не відрізняються (65,0-65,4 мкг/мл для MecA– S. aureus 209-Р і 63,8-75,0 мкг/мл для MecA+ S. aureus «Кунда»).
продолжение
--PAGE_BREAK--В ході досліджень встановлено, що 55,0% сполук із випадково сформованої вибірки похідних 4-азолідонів істотно підвищували чутливість до оксациліну MecA+ S. aureus «Кунда». Найбільш активними у цьому відношенні виявилися похідні 5- [2-(R-бензилокси) — 5-нітрофенілметиліден] -2-тіоксотіазолідин-4-онів (сполуки L-127 і L-1985). Виражений синергізм з оксациліном спостерігався при концентраціях вказаних сполук 12,5 мкг/мл (1/8–1/16 їх МПК для тест-штаму). Дещо слабшу, але стабільно постійну здатність потенціювати протимікробну дію оксациліну відносно MRSA проявили похідні 2-оксо-норборнено [2¢,3¢; 5,6] тіопірано [2,3-d] [1,3] тіазолу (2 сполуки із 2 тестованих: L149 і L1445), 4-ізонікотиноїлгідразонові похідні 2-оксотіазолідину (4 сполуки із 4 тестованих: Ш-17, Ш-20, Ш-21 і Ш-22), а також отримані шляхом цілеспрямованого синтезу на основі прогностичних даних 2D-QSAR аналізу N-(R-феніл) — тіазол-5-іл-ацетаміди (сполуки L-1558 і L-1995).
Невисока токсичність (V клас безпеки), властива похідним 4-азолідонів, в поєднанні з виразною специфічною фармакологічною активністю (пряма протимікробна дія та здатність до синергічної взаємодії з b-лактамними антибіотиками) є вагомими аргументами для поглибленого вивчення цих сполук як нових потенційних препаратів для боротьби з антибіотикорезистентними штамами мікроорганізмів, передусім MRS. Одержані результати свідчать, що ферменти ранніх етапів біосинтезу пептидоглікану (MurB, MurC, MurG) можуть розглядатися в якості важливих нових мішеней для дії протимікробних засобів у клітинах MRSA.
Дослідження протимікробної активності похідних фурану і тіазолу відносно MRS. Найперспективнішим класом сполук, які проявляють стабільно високу активність відносно стафілококів, у тому числі їх клінічних поліантибіотикорезистентних штамів, визначено похідні 2-(5-арил-2-фурил) — 4-хінолінкарбонових кислот (Патент України UA №23769). На основі аналізу «структура – активність» встановлено роль заміщуючих радикалів у різних позиціях базисних каркасів для вияву молекулами протимікробних властивостей, накреслено шляхи для подальшої оптимізації вказаних структур. Відносно MSSA найбільш активними є похідні з двома атомами галогену (Cl, Br) в різних позиціях бензольного кільця 5-R-феніл-2-фурильного фрагмента молекули (сполуки V042, V043, V044, V045). Відносно MRSA і MR-CNS високу активність проявляють похідні з галогеновими замісниками (Cl, Br) в позиції С6 хінолінового ядра і аліфатичними замісниками (ізо-пропіл, втор-бутил, метил) в пара-положенні бензольного кільця 5-R-феніл-2-фурильного фрагмента (сполуки V051, V052, V053). Вказані сполуки можна рекомендувати для поглиблених мікробіологічних досліджень в якості потенційних кандидатів у лікувальні засоби.
Протистафілококова активність похідних оксополігідроакридинів. Встановлено високий рівень бактерицидної активності відносно сучасних клінічних штамів S. aureus і CNS (незалежно від їх метіцилінрезистентності та рівнів асоційованої резистентності до фторхінолонів, тетрациклінів та макролідів) похідних 1-оксо-3,3-диметил-10-R-феніл-1,2,3,4-тетрагідробензо [j] акридинію та 1,8-діоксо-3,3,6,6-тетраметил-1,2,3,4,5,6,7,8,9,10-декагідроакридину. Сполука М116 – 1-фенілгідразил-3,3-диметил-10-(4-метил) феніл-1,2,3,4-тетрагідробензо [j] акридинію бромід (для MRSA МБсК 3,98 мкг/мл, МБцК 7,04 мкг/мл), яка характеризується значним хіміотерапевтичним індексом (61-163 при пероральному і 15-80 при парентеральному введенні), може розглядатися в якості перспективного кандидата у лікувальні засоби.
Дослідження протистафілококової активності четвертинних солей циклопента [с] хінолінію. Новим класом сполук з вираженою бактерицидною активністю (0,8-1,56 мкг/мл) відносно стафілококів, включаючи штами MRSA і MR-CNS, є четвертинні солі N-феніл-6-(4-диметиламінобензиліден) циклопента [с] хінолінію, проте вони характеризуються високим рівнем гострої токсичності (LD50 25,6? 56,0 мг/кг).
Дослідження протимікробної активності рослин флори України відносно поліантибіотикорезистентних клінічних штамів стафілококів. На основі цілеспрямованого тестування 203 водно-етанольних екстрактів різних органів 155 лікарських рослин флори України виявлено природні джерела сполук з високим рівнем протимікробної активності відносно MRS, придатних для створення нових лікувальних засобів (слань цетрарії ісландської Cetraria islandica (L) Ach. та евернії сливової Evernia prunastri (L) Ach., бруньки берези бородавчастої Betula verrucosa Ehrh. та тополі чорної Populus nigra L., трава і суцвіття гринделії розчепіреної Grindelia squarrosa (Pursh) Dun., кореневища гірчака зміїного Polygonum bistorta L., кермеку Мейєра Limonium meyeri (Boiss) O. Kuntze і кермеку південнобузького Limonium hypanicum Klok., листя мучниці звичайної Arctostaphylos uva-ursi (L) Sdivng. та ін). Розроблено оптимальні способи екстрагування, які дозволяють одержати з рослинної сировини комплекси сполук, що володіють не тільки прямою протимікробною активністю відносно MRS, але й антиадгезивними, протизапальними та імуномодулюючими властивостями (табл.1). Виявлено нові природні джерела індукторів ендогенного IFN і TNF-a. Водно-етанольні екстракти коренів живокосту лікарського Symphytum officinalis L. і пагонів омели білої Viscum album L. проявляють імуномодулюючі властивості також в умовах дослідів in vivo.
Таблиця 1
Спектр біологічних властивностей 90% водно-етанольних екстрактів лікарських рослин
№
п/п
Рослинні екстракти
Частини рослин
Протимікробна
дія
Пригнічення
адгезії
Протизапальна
дія
Індукція ендогенного
Антибіотикопотенціююча активність
IFN
TNF
OXA
CIP
TET
ERY
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
1.
Arctostaphylos uva-ursi (L) Sdivng.
Мучниця звичайна
лис.
++
++
ND
–
ND
+++
+/–
+
+
2.
Betula verrucosa L.
Береза бородавчаста
бр.
+++
++
+++
++
–
++++
++++
++++
++++
3.
Biota orientalis (L) Endl.
Біота східна (Широкогілочник східний)
хвоя, пл.
+++
+/–
+
–
++
++
+
ND
+++
4.
Calendula officinalis L.
Нагідки лікарські
суцв.
+
+++
ND
+++
–
–
++
–
+/–
5.
Cetraria islandica (L) Ach.
Цетрарія ісландська ("Ісландський мох")
слань
+++
+++
++
++
–
++
+/–
+++
+/–
6.
Cotinus coggygria Scop.
Скумпія звичайна
лис.
++
–
ND
+
ND
+++
+
+++
+
7.
Evernia prunastri (L) Ach.
Евернія сливова («Дубовий мох»)
слань
+
+++
+/–
++
–
++
–
+++
–
8.
Geranium pratense L.
Герань лучна
корен.
++
+/–
ND
+/–
ND
++
+
+
+/–
9.
Ginkgo biloba L.
Гінкго дволопатеве
лис.
+/–
+++
+
++
–
++
+/–
ND
+
10.
Grindelia squarrosa (Pursh) Dun.
Гринделія розчепірена
н/ч
++
+++
+++
+
+
++
+
++
–
11.
Hypogymnia physodes (L) Nyl.
Гіпогімнія здута
слань
+++
ND
ND
+++
–
++++
–
ND
++
12.
Juniperus communis L.
Ялівець звичайний
хвоя
+++
+++
ND
–
ND
+
+
ND
+/–
13.
Limonium hypanicum Klok.
Кермек південнобузький
кор.
++
ND
ND
+++
–
+++
–
+/–
–
14.
Limonium meyeri (Boiss) O. Kuntze
Кермек Мейєра
кор.
++
++
ND
+
–
++
–
+/–
–
15.
Populus nigra L.
Тополя чорна (Осокір)
бр.
++
++
ND
+/–
–
+++
+++
++++
+++
16.
Potentilla erecta (L) Rausch.
Перстач прямостоячий (Калган)
корен.
++
ND
ND
+
ND
+++
++
++
+
17.
Rhododendron kotschyi Simonk.
Рододендрон східнокарпатський
лис.
++
ND
ND
++
–
+/–
+/–
–
+/–
18.
Rhus coriaria L.
Сумах дубильний
лис.
+/–
ND
ND
+
–
++
++
+/–
–
19.
Polygonum aviculare L.
Спориш звичайний
н/ч
–
ND
ND
++
+++
–
+/–
+
–
20.
Polygonum bistorta L.
Гірчак зміїний
корен.
++
–
+++
+++
–
+++
++
++
+
21.
Salix aurita L.
Верба вушката
кора
+
+
ND
ND
ND
+++
–
++
–
22.
Sanguisorba officinalis L.
Родовик лікарський
кор.
++
+
ND
+
–
++
–
ND
–
23.
Sieversia montana (L) R. Br.
Сіверсія гірська
корен.
++
+
ND
++
–
+++
–
ND
–
24.
Thea sinensis L.
Чай китайський
лис.
+++
++
ND
+/–
ND
+++
–
++++
++
25.
Vaccinium myrtillus L.
Чорниця
н/ч
+
ND
ND
+++
–
+
–
+/–
+/–
26.
Vaccinium vitis-idaea L.
Брусниця
н/ч
+
ND
ND
+++
–
++
–
–
+/–
27.
Viscum album L.
Омела біла
н/ч
+/–
–
ND
+++
++
+/–
–
ND
+/–
Примітки: 1. ND – показник не вивчали; OXA –, CIP –, ERY –, TET –
2. Градація ступеня зниження МПК антибіотиків у присутності екстрактів: +/symbol 45 \f «Symbol» \s 14- symbol 45 \f «Symbol» \s 14- в 2-4 рази, + symbol 45 \f «Symbol» \s 14- у 4-8 разів, ++ symbol 45 \f «Symbol» \s 14- у 16-32 рази, +++ symbol 45 \f «Symbol» \s 14- у 64-128 разів, ++++ symbol 45 \f «Symbol» \s 14- > 128 раз.
3. Частини рослин: бр. – бруньки, лис. – листки, суцв. – суцвіття, пл. – плоди, н/ч – надземна частина, кор. – корені, корен. – кореневища.
Доведено їх стимулюючий вплив на інтерфероновий статус піддослідних тварин (підвищення титрів сироваткового IFN, продукції спонтанного IFN та стимульованого ФГА IFN-g спленоцитами), поглинальну здатність макрофагів перитонеального ексудату при фагоцитозі S. aureus 209-P, киснево-залежну бактерицидну активність у спонтанному НСТ-тесті та функціональний резерв фагоцитів
Антибіотикопотенціюючі властивості рослин флори України. Розроблено оригінальну просту і достатньо чутливу методику для скринінгової оцінки синергізму дії біологічно активних сполук рослинних екстрактів з антибіотиками відносно стафілококів (Патент України UA №27939). Рослинні екстракти наносяться у вигляді плям діаметром до 1,0 см на на пластинки із силікагелем для тонкошарової хроматографії «Sorbfil», після чого їх заливають розплавленим і остудженим поживним агаром з антибіотиком в концентрації 1/2-1/4 МПК, попередньо свіжо засіяним тест-культурою в кінцевій концентрації 107 КУО/мл. Контрольні дослідження виконуються з використанням поживного середовища без антибіотиків. Для виявлення життєздатних бактерій і контрастування зон відсутності або пригнічення росту піcля інкубації в термостаті впродовж доби агар обробляють 1% водним розчином 1,3,5-трифенілтетразолію хлориду. Посіви повторно інкубують в термостаті впродовж 2 год. При цьому ділянки інтенсивного росту культури добре контрастуються формазаном (рис.2). Метричний аналіз цифрових зображень здійснюється за допомогою спеціалізованої комп’ютерної програми UTHSCSA ImageTool 2.0 (http: // ddsdx. uthscsa. edu). Застосування в якості тест культури штаму MRSA «Кунда» з детально охарактеризованими детермінантами резистентності дозволило виявити присутність у рослинній сировині інгібіторів класичного механізму метіцилінрезистентності стафілококів (пов’язаного з продукцією PBP2¢), а також ефлюксних механізмів резистентності NorA, MsrA, TetK.
Валідність запропонованої скринінгової методики підтверджено співставленням результатів тестування 36 рослинних екстрактів з відповідними даними, отриманими за допомогою традиційного методу «титрувальної тест-панелі» («сheckerboard titration»), що звичайно використовується для вивчення синергізму протимікробної дії. Принципового розходження результатів при цьому не спостерігалося. Не було зафіксовано жодного хибно позитивного результату скринінгового тестування. Рівень чутливості запропонованого скринінгового методу знаходиться в межах 97,22±2,74%.
На основі тестування 203 водно-етанольних екстрактів встановлено, що найбільш перспективними представниками флори України для пошуку модифікаторів антибіотикорезистентності бактерій є лишайники родин пармелієві (Parmeliaceae) і уснеєві (Usneaceae); папороті родини щитникові (Aspidaceae) та покритонасіні родин сумахові (Anacardiaceae), селерові (Apiaceae), айстрові (Asteraceae), шорстколисті (Boraginaceae), вересові (Ericaceae), букові (Fagaceae), геранієві (Geraniaceae), лілійні (Liliaceae), кермекові (Limoniaceae), розові (Rosaceae), вербові (Salicaceae).
Синергічна взаємодія рослинних екстрактів із терапевтичними концентраціями класичних антибіотиків відносно полірезистентних стафілококів проявляється в діапазоні концентрацій екстрагованих речовин 5-200 мкг/мл, що відповідає рівням розведень екстрактів (1: 160 — 1: 5210), які не володіють цитотоксичними властивостями.
Виконано поглиблене дослідження антибіотикопотенціюючих властивостей бруньок берези бородавчастої Betula verrucosa Ehrh. (Gemmae Betulae), які є фармакопейною лікарською сировиною. Водно-етанольний екстракт бруньок берези володіє вираженою дозозалежною здатністю відновлювати чутливість поліантибіотикорезистентних штамів стафілококів до b-лактамних антибіотиків, макролідів, лінкозамідів, тетрациклінів та фторхінолонів in vit-ro (табл.2). Водночас синергізм його взаємодії з аміноглікозидами (гентаміцином) виражений значно слабше. Здатність відновлювати чутливість поліантибіотикорезистентних MRSA і
Таблиця 2
Відновлення чутливості до антибіотиків клінічних штамів стафілококів під впливом 90% водно-етанольного екстракту бруньок берези бородавчастої
Кратність зниження протимікробних концентрацій антибіотиків
Штами стафілококів
1: 640 (46,88 мкг/мл†)
1: 1280 (23,44 мкг/мл)
1: 2560 (11,72 мкг/мл)
МБсК
МБцК
МБсК
МБцК
МБсК
МБцК
Оксацилін
S. aureus ICA-5
—
—
32
128
8
8
S. aureus «Кунда»
—
—
>256
128
16
8
S. auricularis 5-03
8
8
16
8
4
2
S. haemolyticus «Сопуляк»
16
8
16
32
8
2
S. haemolyticus «Баб’як»
32
8
32
16
16
4
Ципрофлоксацин
S. aureus ICA-5
—
—
4
4
2
1
S. aureus «Кунда»
—
—
8
8
4
4
S. auricularis 5-03
256
8
2
1
1
0,5
S. haemolyticus «Сопуляк»
256
128
2
4
0,5
1
S. haemolyticus «Баб’як»
256
4
1
2
0,5
1
Еритроміцин
S. aureus ICA-5
—
—
1024
64
32
8
S. aureus «Кунда»
—
—
1024
32
64
8
S. auricularis 5-03
32
64
4
8
1
0,5
S. haemolyticus «Сопуляк»
32
1024
4
64
0,5
4
S. haemolyticus «Баб’як»
2
64
>16
512
8
32
Кліндаміцин *
S. aureus ICA-5
—
—
>512
>16
4
>2
S. aureus «Кунда»
—
—
>32
>16
>2
>2
Тетрациклін
S. aureus ICA-5
—
—
1
0,5
1
1
S. aureus «Кунда»
—
—
4
4
2
4
S. auricularis 5-03
>256
>1024
>256
2
64
8
S. haemolyticus «Сопуляк»
>8
4
>8
>8
4
2
S. haemolyticus «Баб’як»
0,5
8
>4
64
1
4
Гентаміцин
S. aureus ICA-5
—
—
1
1
1
2
S. aureus «Кунда»
—
—
32
1
4
2
S. auricularis 5-03
>64
128
0,25
0,25
0,5
0,5
S. haemolyticus «Сопуляк»
>32
32
0,5
0,25
0,5
0,5
S. haemolyticus «Баб’як»
4
0,5
1
0,5
0,5
0,5
продолжение
--PAGE_BREAK--Примітки: 1. † — концентрація нелетких екстрагованих сполук.
* — чутливі до кліндаміцину штами S. haemolyticus і S. auricularis не тестувались.
MR-CNS до оксациліну і еритроміцину проявляється при розведеннях екстракту 1: 2560 – 1: 5120 (що відповідає концентрації нелетких екстрагованих сполук 5,86-11,72 мкг/мл).
Після 10 пасажів на середовищах із суббактеріостатичними концентраціями 90% водно-етанольного екстракту бруньок у штамів MecA+ стафілококів зареєстровано зниження рівня продукції пеніцилінзв’язуючого білка PBP2¢. Біоавтографічні дослідження тонкошарових хроматограм сумарного 90% водно-етанольного екстракту бруньок берези, а також хлороформного і етилацетатного екстрактів у різних системах розчинників (хлороформ – метанол – вода 80: 18: 2, н-бутанол – оцтова кислота – вода 40: 12: 28 і етилацетат – метанол – вода 100: 13: 17) дозволяють пов’язати оксацилінпотенціюючу дію екстракту бруньок берези з присутністю в них танінів (катехінів), а їх пряму протимікробну активність – із терпеновими сполуками.
При послідовній вичерпній екстракції бруньок берези органічними розчинниками із зростаючою полярністю максимальне нагромадження сполук з ципрофлоксацинпотенціюючою активністю відносно NorA+ штамів S. aureus спостерігається у хлороформній витяжці. При цьому виразний синергічний ефект з ципрофлоксацином проявляється в концентраціях екстракту, рівних 1/4-1/8 МБцК (31,25-62,5 мкг/мл). Менш виражений синергічний ефект з ципрофлоксацином проявляють гексановий і етилацетатний екстракти (в концентраціях 1/2-1/4 МБцК), але активність останніх поширюється і на штами CNS. Компоненти хлороформного екстракту також знижують рівень асоційованої резистентності MRSA до тетрацикліну.
В ході виконаної роботи розроблено і оптимізовано технологію одержання екстрактів, яка дозволяє забезпечити максимальний вихід сполук із прямою протимікробною активністю відносно стафілококів (включаючи MR-ізоляти) та компонентів з властивостями модифікаторів антибіотикорезистентності бактерій (Патент України UA № 27940). Одержаний комплекс екстрагованих біологічно активних сполук бруньок берези характеризується низькою гострою токсичністю, не володіє подразнюючими і алергізуючими властивостями.
Аналіз і узагальнення одержаних результатів викладено в наступному розділі дисертації. В ньому у стислій формі наведено підсумки виконаної роботи, обговорено основні результати експериментів, які дозволили реалізувати мету і завдання дослідження, обгрунтувати висновки.
Результати виконаної роботи дозволили сформулювати основні стратегічні напрямки створення нових ефективних протистафілококових препаратів, попередження виникнення та подолання резистентності госпітальних штамів стафілококів:
Раціональний підхід до молекулярного дизайну нових синтетичних сполук із протимікробними властивостями на основі застосування сучасних комп’ютерних технологій моделювання ліганд-рецепторної взаємодії та прогностичних можливостей QSAR-аналізу.
Ідентифікація нових бактеріальних мішеней для потенційних протимікробних засобів (ензими ранніх етапів біосинтезу пептидоглікану MurB, MurC).
Пошук ефективних інгібіторів ефлюксних помп резистентності (NorA, MsrA, TetK та ін) серед синтетичних і природних сполук.
Подальша розробка і впровадження у клінічну практику засобів для комбінованої протимікробної хіміотерапії.
Висновки В дисертаційній роботі на основі даних експериментальних досліджень та їх теоретичних узагальнень обгрунтовано стратегію пошуку нових ефективних засобів для лікування та профілактики сучасних стафілококових інфекцій, подолання медикаментозної стійкості стафілококів. На основі встановлених взаємозв’язків «структура – активність» визначено напрямки синтезу гетероциклічних сполук з протимікробною активністю відносно поліантибіотикорезистентних стафілококів в рядах похідних тіазолідину, тріазолу, хіноліну, акридину. Обгрунтовано і експериментально доведено синергізм протимікробної дії відносно MRS синтетичних сполук і біологічно активних сполук рослинного походження з класичними антибіотиками (b-лактамами, фторхінолонами, макролідами, тетрациклінами). Запропоновано комплексну лікувальну композицію. Завершено доклінічне дослідження нового протимікробного засобу – настоянки бруньок берези бородавчастої.
У загальній структурі ізолятів стафілококів, визнаних етіологічними чинниками опортуністичних і госпітальних інфекцій, частка метіцилінрезистентних штамів S. aureus становить 27,0%, MR-CNS – 22,7%. Клінічні штами MRSA виділяються переважно з гною, раневого ексудату та носоглотки, а MR-CNS, крім того, із сечостатевого тракту.
У великих багатопрофільних лікувальних закладах Прикарпаття існують внутрішньолікарняні осередки інфекції MRS. За схильністю до внутрішньогоспітального епідемічного поширення вони розташовуються в наступному порядку: MRSA > MR-CNS >> BSSA > BS-CNS. Впровадження у регіоні постійно діючої динамічної багаторівневої системи епідеміологічного моніторингу (з елементами зворотного зв’язку) дозволило в 2003-2006 рр. обмежити поширення MRS в лікувальних закладах, досягнути зниження частоти та інтенсивності спричинюваних ними епідемічних спалахів.
Крім значної резистентності до цефалоспоринів, регіональні штами MRS характеризуються високою частотою асоційованої резистентності до аміноглікозидів, макролідів, лінкозамідів, тетрациклінів, нітрофуранів. Лише 33,3-57,2% ізолятів MRSA проявляють задовільну чутливість до рифампіцину і фузидину. Впродовж 16-річного періоду спостереження (1990-2006 рр) у Прикарпатському регіоні спостерігається стабільна тенденція до прогресуючого набування клінічними штамами стафілококів резистентності до фторхінолонів. Знижену чутливість або резистентність до ванкоміцину виявлено у 1,93% штамів MRSA, серед MR-CNS вона сягає 18,0% і властива переважно штамам S. haemolyticus.
На основі цілеспрямованого пошуку і відбору сформовано репрезентативні панелі сучасних клінічних штамів стафілококів з фенотипічно ідентифікованими детермінантами антибіотикорезистентності: пеніцилінзв’язуючим білком PBP2¢, ефлюксними помпами резистентності до фторхінолонів (NorA), макролідів (MsrA), тетрациклінів (TetK).
Запропонована стратегія пошуку нових протимікробних сполук серед похідних 4-азолідонів, яка включає комбінаторний підхід до синтезу з комп’ютерною систематизацією даних, поєднання традиційного та віртуального скринінгу і дизайну, QSAR-аналіз, забезпечує істотну оптимізацію процесу фармакологічних досліджень та ідентифікації «структур-лідерів», що відображено у високому відсотку активних сполук (22,1%) серед структур-кандидатів для мікробіологічних досліджень.
Застосована процедура тотального високоефективного скринінгу і QSAR-аналізу дозволяє визначити структурні вимоги для молекулярного дизайну антимікробних 4-азолідонів та споріднених гетероциклічних систем. Ідентифіковано нові класи сполук із значною протимікробною активністю відносно метіцилінрезистентних стафілококів – 5- [2-(арилметилокси) — 5-нітрофеніл] метиліден-2-тіоксотіазолідин-4-они та 2,4,5-тризаміщені 4-спіранові похідні тіазолідин-2-ону з піразолобензоксазиновим фрагментом, активність яких очевидно пов’язана з блокуванням ферментів біосинтезу пептидоглікану MurC і MurB. Оптимальною структурою з протистафілококовою активністю є 5- [2-бензилокси-5-нітрофеніл] метиліден-2-тіоксотіазолідин-4-он (сполука L131). Похідні 4-азолідонів і оксацилін проявляють синергізм протимікробної дії по відношенню до MRSA.
Використання прогнозуючої здатності 2D-QSAR аналізу результатів фармакологічного скринінгу значно підвищує ефективність молекулярного дизайну структур, активних відносно поліантибіотикорезистентних штамів мікроорганізмів. Достовірність методу доведено синтезом теоретично змодельованих структур – похідних 6-оксо-5,6-дигідро [1,3] тіазоло [2,3-b] [1,2,4] тріазол-6-ону (сполук L-1558 і L-1369), високоактивних відносно MS — і MR-стафілококів.
Стабільно високу протистафілококову активність виявляють 2-(5-арил-2-фурил) — 4-хінолінкарбонові кислоти, похідні 1-оксо-3,3-диметил-10-R-феніл-1,2,3,4-тетрагідробензо [j] акридинію, 1,8-діоксо-3,3,6,6-тетраметил-1,2,3,4,5,6,7,8,9,10-декагідроакридину, четвертинні солі N-бензил-6-(4-R-бензиліден) циклопента [с] хінолінію.
Серед лікарських рослин флори України виявлено природні джерела сполук з високим рівнем протимікробної активності відносно MRS, придатних для створення нових лікувальних засобів (слань цетрарії ісландської Cetraria islandica (L) Ach. та евернії сливової Evernia prunastri (L) Ach., бруньки берези бородавчастої Betula verrucosa Ehrh. та тополі чорної Populus nigra L., трава і суцвіття гринделії розчепіреної Grindelia squarrosa (Pursh) Dun., листя мучниці звичайної Arctostaphylos uva-ursi (L) Sdivng., кореневища гірчака зміїного Polygonum bistorta L., кермеку Мейєра Limonium meyeri (Boiss) O. Kuntze і кермеку південнобузького Limonium hypanicum Klok. та ін). Біологічно активні сполуки вказаних рослинних екстрактів, поряд із прямою протимікробною активністю відносно MRS, володіють антиадгезивними, протизапальними та імуномодулюючими властивостями.
Оптимізовано методологічні підходи до стратегії цілеспрямованого пошуку модифікаторів антибіотикорезистентності бактерій в рослинній сировині. Розроблено оригінальну просту і достатньо чутливу методику для скринінгового дослідження сполук (як природного, так і синтетичного походження) на предмет виявлення у них здатності відновлювати чутливість резистентних штамів мікроорганізмів до класичних антибіотиків. Рівень чутливості запропонованого скринінгового методу знаходиться в межах 97,22±2,74%.
Модифікатори антибіотикорезистентності бактерій достатньо широко розповсюджені в рослинній сировині. Здатністю відновлювати чутливість MRSA до оксациліну володіє 33,99% досліджених екстрактів. Лікарські рослини є джерелом сполук, здатних блокувати ефлюксні механізми асоційованої резистентності MRSA до фторхінолонів (ципрофлоксацину) – 24,63% досліджених екстрактів, макролідів (еритроміцину) – 24,14% екстрактів, тетрацикліну – 38,89% екстрактів. У рослин різних таксономічних груп існують закономірності продукції метаболітів, здатних модифікувати антибіотикорезистентність стафілококів.
Водно-етанольний, хлороформний і етилацетатний екстракти бруньок берези бородавчастої володіють вираженою дозозалежною здатністю відновлювати чутливість поліантибіотикорезистентних штамів стафілококів до b-лактамних антибіотиків, макролідів, лінкозамідів, тетрациклінів і фторхінолонів in vitro.
Практичні рекомендації З метою вдосконалення системи епідеміологічного моніторингу за поширенням MRS в лікувальних закладах рекомендовано застосування спеціалізованого комп’ютерного програмного забезпечення (програма WHONET 5.1, WHO Collaborating Centre for the Surveillance of Antibiotic Resistance).
Для проведення ретроспективного епідеміологічного аналізу поширення метіцилінрезистентних стафілококів (MRSA, MR-CNS) та стафілококів з пограничною метіцилінрезистентністю (BSSA, BS-CNS) доцільно використовувати матеріали досліджень чутливості штамів одночасно до оксациліну і цефазоліну: метіцилінрезистентні стафілококи характеризуються фенотипом резистентності OxarCzor, штами з фенотипом OxarCzos належать до ізолятів з пограничною резистентністю.
Встановлені регіональні особливості чутливості до антибіотиків MS — і MR-штамів S. aureus та CNS, а також штамів з пограничною метіцилінрезистентністю, що доцільно використовувати при виборі антимікробних препаратів з лікувальною метою.
Для попередження внутрішньолікарняного поширення MRS рекомендувати використовувати бацилоцид, хлоргексидин, етоній і хлорофіліпт.
Розроблено комплексну лікувальну композицію етонію, амізону і силларду-П з протимікробними, протизапальними та імуностимулюючими властивостями для місцевого застосування при хронічному генералізованому пародонтиті та інших гнійно-запальних процесах (Патент України UA №19175).
Створено колекцію 36 авторських штамів стафілококів клінічного походження з ідентифікованими детермінантами антибіотикорезистентності (продукція пеніцилінзв’язуючого білка PBP2¢, функціонування ефлюксних механізмів резистентності до фторхінолонів NorA, макролідів MsrA, тетрациклінів TetK) для використання в якості об’єктів у різноманітних фундаментальних та прикладних дослідженнях. Штами знаходяться на зберіганні в колекціях музею мікроорганізмів ДП "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМНУ" (м. Харків), в музеї патогенних для людини мікроорганізмів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМНУ (м. Київ).
Рекомендовано методику дослідження синергізму протимікробної дії лікувальних антимікробних препаратів (Патент UA №27939).
Для поглибленого фармакологічного дослідження рекомендувати синтетичні препарати (L-131, M-116) в якості потенційних кандидатів для створення нових антимікробних засобів з високою активністю відносно метіцилінрезистентних стафілококів.
Завершено доклінічне дослідження настоянки бруньок берези бородавчастої Betula verrucosa Ehrh. (Gemmae Betulae) в якості фармацевтичного протимікробного засобу (Патент України UA №27940).
Список робіт, опублікованих за темою дисертації 1. Куцик Р.В. Скринінгове дослідження протимікробної активності лікарських рослин Прикарпаття відносно поліантибіотикорезистентних клінічних штамів стафілококів: Повідомлення 1 // Галицький лікарський вісник. — 2004. -Т.11, №4. -С.44-48.
2. Куцик Р.В. Дослідження чутливості до офіцинальних препаратів лікарських рослин штамів метіцилінорезистентних стафілококів, виділених від пацієнтів з фурункульозом і неспецифічними уретритами // Арх. клін. мед. — 2005. -№2(8). -С. -65-69.
3. Куцик Р.В. Скринінгове дослідження протимікробної активності лікарських рослин Прикарпаття відносно поліантибіотикорезистентних клінічних штамів стафілококів: Повідомлення 2 // Галицький лікарський вісник. — 2005. -Т.12, №3. -С.52-58.
4. Куцик Р.В. Протимікробна активність екстрактів лишайників Cetraria islandica (L) Ach. і Evernia prunastri (L) Ach. відносно стафілококів з різним рівнем метіцилінорезистентності // Анали Мечниківського інституту. — 2008. -№1. -С.42-46. -Режим доступу: http: // www. nbuv. gov. ua/ e-journals/AMI/2008/j12008. htm.
5. Куцик Р.В. Антибіотикопотенціююча активність бруньок берези бородавчастої Betula verrucosa Ehrl. // Акт. питання фармацевт. та мед. науки та практики. -2006. -Вип.15, Т.1. -С. 205-211.
6. Кучеренко К.В., Куцик Р.В. Етіологічна структура та особливості антибіотикограми збудників при деяких фонових та передракових станах шийки матки // Галицький лікарський вісник. — 1999. -Т.6, №2. -С.51-54. Особистий внесок автора: мікробіологічні дослідження, узагальнення і аналіз результатів, оформлення статті.
7. Куцик Р.В., Куровець Л.М. Видовий спектр і чутливість до антибіотиків стафілококів, виділених від пацієнтів з фурункульозом // Мікробіол. журн. — 2002. -Т.64, №5. -С.60-63. Особистий внесок автора: постановка завдання, забір і бактеріологічне дослідження біологічного матеріалу, аналіз результатів, оформлення статті.
8. Нозокоміальні пневмонії у хірургічних хворих / Р.Б. Костирко, І.І. Тітов, Р.В. Куцик, Р.М. Мізюк, Т.І. Клюфінська, О.О. Янків // Галицький лікарський вісник. — 2002. -Т.9, №3. -С.162-164. Особистий внесок автора: мікробіологічні дослідження, аналіз результатів.
9. Поточний контроль санепідрежиму, як складова реалізації нового підходу до управління якістю медичної допомоги та профілактики внутрішньолікарняних інфекцій / С.К. Борщ, Р.В. Куцик, О.В. Борщ, Б.І. Васильчук, В.М. Вовчук, І.С. Грибовська, К.М. Грибовський, Л.Б. Ярич // Галицький лікарський вісник. — 2003. -Т.10, №3. -С.106-111. Особистий внесок автора: участь у розробці тактики поточного контролю за санепідрежиммом, редагування статті.
10. Синтез та мікробіологічний скринінг четвертинних солей циклопента [с] хінолінію / Р.В. Куцик, З.Л. Новіцький, М.В. Мельник, А.О. Стецьків, Л.М. Куровець, О.В. Боднарчук // Вісн. Вінницького Націон. мед. ун-ту. — 2004. -№8(2). -С.430-434. Особистий внесок автора: постановка завдання, дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів, оформлення статті.
продолжение
--PAGE_BREAK--11. Вивчення антагоністичної активності лактобацил, введених у пробіотичний препарат лактобактерин, щодо етіологічних чинників дисбактеріозу кишечника, гнійно-запальних процесів та пробіотичних штамів мікроорганізмів / С.К. Борщ, Н.М. Середюк, Р.В. Куцик, О.Д. Матейчук, Р.М. Мізюк // Галицький лікарський вісник. — 2004. -Т.11, №3. -С.16-19. Особистий внесок автора: постановка завдання, виділення штамів стафілококів, аналіз результатів, редагування статті.
12. Антиінфекційна резистентність школярів м. Івано-Франківська в сучасних екологічних умовах / А.П. Юрцева, Р.В. Куцик, Б.М. Павликівська, О.В. Фофанова, З.О. Ціхонь, Р.М. Мізюк // Арх. клін. мед. — 2004. -№1(5). -С. -69-71. Особистий внесок автора: мікробіологічні дослідження, узагальнення і аналіз результатів, оформлення статті.
13. Борщ С.К., Середюк Н.М., Куцик Р.В. Вивчення на прикладі E. coli шт. М-17, введеної в препарат біфікол, закономірностей прояву антагоністичних властивостей мікроорганізмів, що належать до різних таксономічних одиниць, є збудниками дисбактеріозу кишечника, гнійно-запальних процесів та пробіотичними штамами // Галицький лікарський вісник. — 2004. -Т.11, №4. -С.9-11. Особистий внесок автора: постановка завдання, виділення штамів стафілококів, аналіз результатів, редагування статті.
14. Спосіб визначення антиколонізаційної резистентності слизової оболонки порожнини рота / У.Р. Никифорчин, М.М. Рожко, Р.В. Куцик, Т.М. Михайленко, Г.С. Орнат. — Інформ. лист №70-2004. -Київ, 2004. -2c. Особистий внесок автора: постановка завдання, інтерпретація і узагальнення результатів.
15. Куцик Р.В., Куровець Л.М., Зузук Б.М. Дослідження протистафілококової активності екстрактів гірчака зміїного (Polygonum bistorta L) // Вісн. Одеського національного університету. Сер. біол. — 2005. -Т.10, Вип.7. -С. -137-143. Особистий внесок автора: постановка завдання, одержання екстрактів, логіка, тактика та виконання експериментальних досліджень, узагальнення результатів, оформлення статті.
16. Клінічні та мікробіологічні прояви дисбактеріозу кишечника у пацієнтів із гастроінтестінальною патологією / С.К. Борщ, Н.М. Середюк, Р.В. Куцик, Л.С. Малофій, В.М. Вовчук, В.М. Благодатний, Р.М. Мізюк, Н.С. Духович // Арх. клін. мед. — 2005. -№2(8). -С. -44-48. Особистий внесок автора: дослідження антибіотикорезистентності виділених штамів, аналіз результатів, редагування статті.
17. Мізюк Р.М., Куцик Р.В., Борщ С.К. Особливості мікробного спектру та резистентності до антибіотиків мікроорганізмів, виділених в стаціонарах Івано-Франківської області // Галицький лікарський вісник. — 2005. -Т.12, №2. -С.36-41. Особистий внесок автора: дослідження антибіотикорезистентності виділених штамів, аналіз і узагальнення результатів, редагування статті.
18. Скринінгове дослідження протимікробної активності спиртових екстрактів лікарських рослин / Р.М. Мізюк, Р.В. Куцик, Б.М. Зузук, С.К. Борщ, Н.І. Фрич // Галицький лікарський вісник. — 2005. -Т.12, №4. -С.66-71. Особистий внесок автора: постановка завдання, одержання екстрактів, аналіз результатів, редагування статті
19. Борщ С.К., Куцик Р.В. Обгрунтування патогенетичних варіантів синдрому дисбактеріозу кишечнику для вибору схем базової пробіотичної терапії // Ліки України. — 2005. -№12(101). -С.113-119. Особистий внесок автора: постановка завдання, редагування статті.
20. Кукурудз Н.І., Герелюк В.І., Куцик Р.В. Клініко-мікробіологічна ефективність застосування композиції амізон-етоній імобілізованої на кремнеземі «Силлард-П» у лікуванні генералізованого пародонтиту // Ліки. — 2006. -№3-4. -С.93-102. Особистий внесок автора: бактеріологічне дослідження біологічного матеріалу, аналіз результатів.
21. Кукурудз Н.І., Куцик Р.В., Луцак Л.В. Мікробіологічне обгрунтування застосування композиції амізон-етоній, імобілізованої на сорбенті «Силлард-П», для лікування генералізованого пародонтиту // Укр. мед. альманах. — 2006. -Т.9, №5. -С.67-70. Особистий внесок автора: постановка завдання, дослідження антимікробної активності композиції, узагальнення результатів, оформлення статті.
22. Курбатова С.С., Куцик Р.В., Герелюк В.І. Мікробіологічне обгрунтування застосування зинаксину в комплексному лікуванні генералізованого пародонтиту // Вісн. стоматол. -2006. -№2(52). -С.50-54. Особистий внесок автора: постановка завдання, логіка, тактика та виконання експериментальних досліджень, узагальнення і аналіз результатів.
23. Борщ С.К., Куцик Р.В. Класифікація різновидів антагністичної активності мікроорганізмів при виборі пробіотичних препаратів для хворих із синдромом дисбактеріозу кишечника // Ліки України. — 2007. -№10(114). -С.66-71. Особистий внесок автора: постановка завдання, редагування статті.
24. Порівняльний аналіз чутливості до антибіотиків золотистих стафілококів і грибів, виділених у пацієнтів із дисбактеріозом кишечника / С.К. Борщ, В.Г. Войцеховський, Р.В. Куцик, В.П. Борщ // Галицький лікарський вісник. — 2007. -Т.14, №4. -С.17-21. Особистий внесок автора: постановка завдання, аналіз і узагальнення результатів, оформлення статті.
25. Синтез и антимикробная активность 5(R1-бензил-) — 2-(R2-бензилиденгидразоно) — 3-фурфурил-4-тиазолидинонов / В.М. Цялковский, В.С. Матийчук, Р.В. Куцык, Н.Д. Обушак, Т.И. Клюфинская // Хим. -фарм. журн. — 2005. -Т.39, №5. -С. 20-22. Особистий внесок автора: дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів.
26. Synthesis and antimicrobial activity of 5-(R1-benzyl) — 2-(R2-benzylidenehydrazono) — 3-(2-furylmethyl) thiazolidin-4-ones / V. M. Tsyalkovsky, V. S. Matiychuk, R. V. Kutsyk, N. D. Obushak, T.I. Klyufinskaya // Pharmacuetical Cemistry J. — 2005. -Vol.39, №5. -P.245-247. Особистий внесок автора: дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів.
27. Синтез и противомикробная активность амидов 2,4-диоксотиазолидин-5-уксусной кислоты / Б.С. Зименковский, Р.В. Куцик, Р.Б. Лесык, В.М. Цялковский, В.С. Матийчук, Н.Д. Обушак, Т.И. Клюфинская // Хим. -фарм. журн. — 2006. -Т.40, №6. -С.13-16. Особистий внесок автора: дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів.
28. Synthesis and antimicrobial activity of 2,4-dioxothiazolidine-5-acetic acid amides / B. S. Zimenkovskii, R. V. Kutsyk, R. B. Lesyk, V. S. Matyichuk, N. D. Obushak, T.I. Klyufinska // Pharm. Chemstry J. — 2006. -Vol.40, №6. -P.303-306. Особистий внесок автора: дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів.
29. Синтез та вивчення антимікробної активності похідних азолідину з 2-(2-хлорбензилокси) — 5-нітрофенільним фрагментом в молекулах / Р.Б. Лесик, Б.С. Зіменковський, Р.В. Куцик, Д.В. Атаманюк, Г.М. Семенців // Фармацевт. журн. — 2003. -№2. -С.52-56. Особистий внесок автора: дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів.
30. Куцик Р.В. Протистафілококова активність екстрактів грінделії розчепіреної Grindelia squarrosa (Pursh) Dun. // Фармацевт. журн. — 2005. -№1. -С.81-88.
31. Куцик Р.В. Вивчення протимікробної активності екстрактів бруньок берези бородавчастої відносно стафілококів з різними детермінантами антибіотикорезистентності // Фармацевт. журн. — 2006. -№.2-С.74-82.
32. Мельник М.В., Куцик Р.В., Клюфінська Т.І. Протимікробна активність солей оксотетрагідроакридинію і їх фенілгідразонів // Фармацевт. журн. — 2004. -№2. -С.59-62. Особистий внесок автора: постановка завдання, дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів, оформлення статті.
33. Мельник М.В., Куцик Р.В., Калин Т.І. Дослідження протимікробної активності похідних діоксодекагідроакридинів // Фармацевт. журн. — 2004. -№4. -С.78-83. Особистий внесок автора: постановка завдання, дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів, оформлення статті.
34. Вивчення протимікробної активності рослин родини вересові (Ericaceae Juss) / Н.І. Фрич, Л.М. Вівчарук, Р.М. Мізюк, Л.М. Куровець, Р.В. Куцик // Фармацевт. журн. — 2005. -№2. -С.97-104. Особистий внесок автора: постановка завдання, одержання екстрактів, узагальнення результатів, оформлення статті.
35. Вивчення антимікробної активності та молекулярне моделювання похідних тіазолідину з піразолобензоксазиновим фрагментом в молекулі як потенційних інгібіторів MurB ферменту / Б.С. Зіменковський, Д.Я. Гаврилюк, Р.Б. Лесик, Р.В. Куцик, Д.В. Атаманюк // Фармацевт. журн. — 2006. -№.6-С.41-48. Особистий внесок автора: мікробіологічні дослідження, участь у обговоренні результатів.
36. Куцик Р.В., Мізюк Р.М., Куровець Л.М. Протимікробні властивості рослин роду кермек (Limonium spp) // Фармацевт. журн. — 2007. -№.2-С.88-98. Особистий внесок автора: постановка завдання, логіка, тактика та виконання експериментальних досліджень, узагальнення результатів, оформлення статті.
37. Виникнення нозокоміальної пневмонії у хворих після виконання планових реконструктивних операцій / Р.Б. Костирко, І.І. Тітов, О.В. Волошинський, Р.В. Куцик // Клінічна хірургія. — 2002. -№5-6. -С.13-14. Особистий внесок автора: мікробіологічні дослідження, аналіз результатів.
38. Пат. №27939 Україна, МПК С12 Q 1/04, G 01 N 33/15. Спосіб скринінгу рослинних екстрактів на предмет виявлення їх здатності модифікувати резистентність мікроорганізмів до антибіотиків: Пат. №27939 Україна, МПК С12 Q 1/04, G 01 N 33/15. Р.В. Куцик. -№u200705188; Заявл.11.05. 2007; Опубл.26.11. 2007, Бюл. №19. -7с.
39. Пат. №37874А Україна, МПК G 01 N 33/50. Спосіб визначення рівня антиколонізаційної резистентності слизової оболонки порожнини рота: Пат. №37874А Україна, МКВ G 01 N 33/50. У.Р. Никифорчин, М.М. Рожко, Р.В. Куцик, Р.М. Никифорчин, І.В. Палійчук, З.Р. Ожоган, Г.С. Орнат, О.В. Бугерчук. -№2000042396; Заявл.26.04. 2000; Опубл.15.05. 2001, Бюл. №4. -5с. Особистий внесок автора: постановка завдання, інтерпретація і узагальнення результатів.
40. Пат. №19175 Україна, МПК А 61 К 6/00. Спосіб одержання засобу для місцевого лікування хронічного генералізованого пародонтиту: Пат. №19175 Україна, МКВ А 61 К 6/00. Н.І. Кукурудз, В.І. Герелюк, Р.В. Куцик, Я.С. Гудивок. -Заявл.13.04. 2006; Опубл.15.12. 2006, Бюл. №12. -7с. Особистий внесок автора: дослідження антимікробної активності композиції, узагальнення результатів, оформлення заявки на патент.
41. Пат. №23769 Україна, МПК С07D 215/00; С07D 307/34; С07D 405/04; С07D 209/00.2-(5-Арил-2-фурил) — 4-хінолінкарбонові кислоти, які виявляють протимікробну активність: Пат. №23769 Україна, МПК С07D 215/00; С07D 307/34; С07D 405/04; С07D 209/00. М.Д. Обушак, Р.В. Куцик, В.С. Матійчук, Ю.І. Горак; Львівський національний університет ім.І. Франка (UA). — № 200613987; Заявл.28.12. 2006; Опубл.11.06. 2007, Бюл. № 8. Особистий внесок автора: ідея, дослідження протимікробної активності сполук, аналіз результатів.
42. Пат. №26076 Україна, МПК А 61 В 10/02. Спосіб забору матеріалу для діагностики мікробного біоценозу ротової порожнини у осіб із знімними протезами: Пат. №26076 Україна, МКВ А 61 В 10/02. Т.М. Михайленко, М.М. Рожко, Р.В. Куцик. -№а20070006; Заявл.02.01. 2007; Опубл.10.09. 2007, Бюл. №14. -2с. Особистий внесок автора: мікробіологічні дослідження, узагальнення результатів.
43. Пат. №27940 Україна, МПК А 61 К 36/00. Спосіб одержання екстракту бруньок берези, що володіє протимікробною активністю і зменшує рівень резистентності стафілококів до антибіотиків: Пат. №27940 Україна, МПК А 61 К 36/00. Куцик Р.В., Зузук Б.М… -№u200705188; Заявл.11.05. 2007; Опубл.26.11. 2007, Бюл. №19. -4с. Особистий внесок автора: ідея, постановка завдання, логіка і тактика експериментальних досліджень, аналіз результатів, оформлення заявки на патент.
44. Патент України за заявкою №а200512420, МПК A 61 K 31/435. Спосіб синтезу нових стирилових похідних четвертинних солей циклопента [c] хінолінію з високим рівнем протистафілококової і антикандидозної активності: Пат. за заявкою №а200512420 Україна, МПК A 61 K 31/435. Р.В. Куцик, З.Л. Новіцький, М.В. Мельник, Л.М. Куровець, О.В. Боднарчук. -№а200512420; Заявл.23.12. 2005; Опубл.25.06. 2007, Бюл. №9 Особистий внесок автора: ідея, дослідження протимікробної активності сполук, аналіз результатів, оформлення заявки на патент.
45. Куцык Р.В., Зузук Б.М. Береза бородавчатая (син. Береза повислая) Betula verrucosa Ehrh. (син. Betula pendula Roth): Аналитический обзор // Провизор. — 2001. -№10. -С.17-20; 2001. -№11. -С.23-27. Особистий внесок автора: опрацювання і аналіз літератури, оформлення статті.
46. Толокнянка обыкновенная Arctostaphylos uva-ursi (L) Sdivng.: Аналитический обзор / Р.В. Куцык, Б.М. Зузук, А.Т. Недоступ, Т. Пецко // Провизор. -2003. -№18. -С.27-31; 2003. -№19. -С.27-29. Особистий внесок автора: опрацювання і аналіз літератури, оформлення статті.
47. Окопник лекарственный Symphytum officinale L.: Аналитический обзор / Р.В. Куцык, Б.М. Зузук, И.Р. Костюк, Г.Г. Мельничук, Р.Й. Гайдук // Провизор. -2004. -№17. -С.30-34; 2004. -№18. -С.25-28; 2004. -№19. -С.35-38. Особистий внесок автора: опрацювання і аналіз літератури, оформлення статті.
48. Зузук Б.М., Куцык Р.В. Цетрарія ісландська (ісландський мох) Cetraria islandica L. .: Аналітичний огляд // Провизор. -2007. -№12. -С.36-39; 2007. -№13-14. -С.52-55. Особистий внесок автора: опрацювання і аналіз літератури, оформлення статті.
49. Спрямований пощук сполук з антимікробною активністю серед 4-азолідонів та споріднених гетероциклічних систем / Б.С. Зіменковський, Є.Н. Муратов, А.Г. Артеменко, Р.Б. Лесик, Р.В. Куцик, О.Р. Піняжко, В. Є. Кузьмін, О.Й. Андрашко, Д.В. Атаманюк, С.М. Голота, Д.Я. Гаврилюк, І.Ю. Субтельна, О.М. Роман, Г.В. Казьмірчук, Г.М. Семенців, С.М. Ярощук, Л.М. Куровець, Т.І. Клюфінська // Актуальні питання фармакології: Матер. IV Української наук. -практ. конф. з міжнар. участю з клінічної фармакології. -Вінниця, 2004. -Ч.1. -С.39-48. Особистий внесок автора: визначення перспективних напрямків для синтезу, дослідження антимікробної активності сполук, аналіз і узагальнення результатів.
50. Вивчення антагоністичної активності апатогенних представників роду Bacillus, введених в пробіотичний препарат біоспорин, щодо етіологічно значимих збудників дисбактеріозу кишечника та гнійно-запальних процесів / С.К. Борщ, Н.М. Середюк, Р.В. Куцик, Р.М. Мізюк // Матеріали міжнар. наук. -практ. конф. «Пробіотики — ХХІ століття: Біологія. Медицина. Практика». -Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. -С.12-16. Особистий внесок автора: постановка завдання, виділення штамів стафілококів, аналіз результатів, редагування статті.
51. Лизанець Л.М., Куцик Р.В. Вивчення чутливості до антибіотиків госпітальних штамів мікроорганізмів, виділених в лікувальних закладах м. Івано-Франківська в 1991-1995 рр. // Збірник наукових праць, присвячений 50-й річниці з часу заснування Івано-Франківської державної медичної академії. -Івано-Франківськ, 1995. -С.48-51. Особистий внесок автора: бактеріологічне дослідження біологічного матеріалу, аналіз результатів, оформлення публікації.
52. Куцик Р.В. Вивчення антибіотикорезистентності госпітальних штамів стафілококів, виділених в лікувальних закладах м. Івано-Франківська // Зб. праць молодих вчених Івано-Франківської державної медичної академії: 29-а обл. наукова конф. молодих вчених-медиків. — Івано-Франківськ, 1997. -С.74-76.
продолжение
--PAGE_BREAK--
еще рефераты
Еще работы по медицине