Реферат: Антиоксидантная система плазмы крови в норме и при патологии

--PAGE_BREAK--Гидрофильные антиоксиданты
Глутатион:
Глутатион – тиол небелковой природы, встречающийся во всех животных и растительных тканях, а также у ряда микроорганизмов [Меньшиков, Кения, 1993; Косовер, Косовер, 1979]. Глутатион существует в двух формах восстановленный (ГSH) и окисленный (ГSSГ). Восстановленный глутатион – трипептид g-L- глутамилцистеинилглицин (g-L-Глу- Цис- Гли). Химическая активность ГSH связана с тиоловой группой остатка Цис, являющейся донором протонов для многих соединений. Отдавая протон, ГSH легко окисляется с образованием димера с S-S- мостиком.
Функции глутатиона многообразны: восстановление и изомеризация дисульфидных связей; влияние на активность ферментов и других белков, поддержание барьерных функций мембран, коферментные функции, резервирование цистеина, влияние на биосинтез нуклеиновых кислот и белка, пролиферацию и др. [Meister, Anderson, 1983; Кулинский, Колесниченко, 1990].
Аскорбат:
Витамин С (L-аскорбиновая кислота) по химическому строению является лактоном гулоновой кислоты со структурой, близкой a-глюкозе. Благодаря наличию двух асимметричных атомов углерода, аскорбиновая кислота образует четыре стереоизомера, биологической активностью обладает только L-аскорбат.
Присутствие в аскорбате двух двойных связей обуславливает ее способность к обратимому окислению, продуктом которого является дегидроаскорбиновая кислота (ДАК). ДАК устойчивое соединение. В ходе необратимого разрыва лактоновой связи часть ДАК превращается в 2,3 –декетогулоновую кислоту (ДКГК). При окислении ДКГК расщепляется на щавелевую и трионовую кислоты [Дегли, Никольсон, 1973].
1.2.1. Ферментативная антиоксидантная системаСупероксиддисмутаза:
Организмы различной степени сложности, утилизирующие кислород в процессах обмена веществ содержат ферменты, обладающие способностью дисмутировать супероксидные радикалы, обрывая тем самым опасную цепь свободнорадикальных превращений в самом зародыше. Эти ферменты называют супероксиддисмутазами (КФ 1.15.1.1., супероксид: супероксид оксидоредуктаза, СОД). СОД являются, в основном внутриклеточными ферментами и лишь небольшая часть СОД- активности обнаружена во внеклеточных жидкостях млекопитающих в виде гликозилированного тетрамера Cu,Zn-СОД с Mr 135 кДа. Этот гликопротеин проявляет сродство к сульфатированным полисахаридам таким, как гепарин и гепарансульфат [Marclund, 1984; Fridovich, 1997].
Каталаза:
Каталаза (КФ I.II.1.6, Н2О2: Н2О2- оксидоредуктаза, КТ), фермент участвующий в детоксикации нерадикальной активной формы кислорода – Н2О2.
По химическому составу является гемопротеином и состоит из 4-х идентичных субъединиц, каждая из которых в качестве простетической группы содержит _емм с трёхвалентным железом. Апобелки каталаз животного происхождения видоспецифичны [Вайнштейн, Мелик-Адамян, 1986]. _емм в белковой глобуле каталазы находится в гидрофобном окружении.

Глутатионтрансферазы:
Глутатионтрансфераза (КФ 2.5.1.18, донор: восстановленный глутатион трансфераза, ГТ) входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их конъюгации с восстановленным глутатионом.
Глутатионредуктаза:
Во многих реакциях, катализируемых ГП и ГSТ, отдавая протоны, две молекулы ГSH соединяются дисульфидной связью и образуют, так называемый, окисленный глутатион. Для восстановления ГSSГ и, следовательно, рециклирования ГSH, в клетках существует специальный фермент – глутатионредуктаза [Косовер, Косовер, 1979; Мартинчик, Бондарев, 1986].
Глутатионредуктаза (НAДФH: окисленный глутатион оксидоредуктаза, КФ 1.6.4.2, ГР) ‑ широко распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную концентрацию восстановленной формы глутатиона.
Глюкозо‑6‑фосфатдегидрогеназа:
Для восстановления окисленного глутатиона глутатионредуктазой в качестве доноров водорода используется НAДФH, который образуется в пентозофосфатном пути в ходе глюкозо–6–фосфатдегидрогеназной реакции [Атауллаханов, 1981].
ВТОРИЧНАЯ АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ЗАЩИТЫ
Аэробные организмы в процессе эволюции приобрели хорошо сбалансированные механизмы, осуществляющие нейтрализацию окислительного действия кислорода и его активных интермедиатов. Эти механизмы (ферментативные и неферментативные), способные поддерживать и восстанавливать друг друга, объединены в единую антиоксидантную систему, которая осуществляет первичную защиту организма (клеток, тканей). Компоненты этой системы взаимодействуют непосредственно с АФК, то есть, стресс-факторами, способными вызывать окислительную модификацию различных биополимеров. Однако защитный потенциал, которым располагают аэробные организмы, наряду с АОС, включает вторичную антиоксидантную систему защиты, или репаративную систему, компоненты которой начинают функционировать при уже случившихся окислительных повреждених, когда появляется необходимость быстрого удаления и восстановления поврежденных клеточных структур.
К репаративной системе относятся липолитические ферменты (липазы, фосфолипазы), протеазы, пептидазы, ДНК-репаразы, эндо- и экзонуклеазы, лигазы.
В процессах перекисного окисления липидов, _емма_рованных АФК, происходит существенная модификация фосфолипидов плазматической и внутриклеточных мембран. В удалении поврежденных жирнокислотных ацилов мембранных липидов участвуют фосфолипазы А1 и А2, а также фосфолипаза С. Выяснено, что перекисное окисление мембранных липидов может стимулировать липолитическое действие фосфолипазы А2. Исследования показали, что предпочтительными субстратами для данного фермента служат именно перекисные формы фосфолипидов. По-видимому, это может иметь важное значение в процессах мембранной репарации, поскольку предоставляет клетке дополнительную защиту против ПОЛ.
В защите клетки принимают участие и протеолитические ферменты, осуществляющие деградацию окисленных белков, предотвращая тем самым их накопление. В последние годы было установлено, что деградацию окисленных белков осуществляют протеосомы, мультикаталитические протеазные комплексы, состоящие примерно из 28 субъединиц, организованных в цилиндрическую структуру. Комплекс протеаз, селективно деградирующий модифицированные белки (окисленные или помеченные убиквитином), играет главную роль в нелизосомальном расщеплении внутриклеточных белковых молекул. Две главные протеосомы (20S и 26S-частицы) идентифицированы. Только 20S протеосома деградирует окисленные белки. Протеосома содержит три главных активности – трипсиноподобную, химотрипсиноподобную и карбоксипротеазную. Протеолиз протеосомой требует разворачивания полипептидных цепей и транспорта развернутого белка во внутренний активный компартмент комплекса [Tsu-Chung Chang,Wei-Yuan Chou,Gu-Gang Chang,2000].
 1.3. Антиоксиданты плазмы крови Защита ферментов и белков, в частности липопротеинов, присутствующих в плазме крови, осуществляется внеклеточной АОС. Эта антиоксидантная система, как и клеточная, характеризуется наличием антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных биоантиоксидантов и присутствует не только в плазме крови, но и в межклеточной, спинномозговой, синовиальной жидкостях и лимфе.
К высокомолекулярным соединениям, содержащимся в плазме крови и обладающим антиоксидантной активностью, относятся экстрацеллюлярная СОД, каталаза и ГПО, альбумины, церулоплазмин, трансферрин, лактоферрин, ферритин, гаптоглобин и гемопексин (белок, связывающий _емм). По мнению [Halliwell, Gutteridge, 1986] удаление О2- и Н2О2 СОД, каталазой и ГПО вносит небольшой вклад в антиоксидантную активность внеклеточных жидкостей. Авторы считают, что главными защитными системами в плазме являются антиоксидантные белки, связывающие ионы металлов переменной валентности в формы, которые не могут стимулировать свободнорадикальные реакции, либо другим способом, препятствующим ионам металлов принимать участие в таких реакциях. Известно, что церулоплазмин, обладающий ферроксидазной активностью, ингибирует Fe2+-зависимое ПОЛ и образование ·ОН из Н2О2. ЦП считается основным антиоксидантом плазмы крови. Поскольку ЦП неспецифически связывает Cu2+, он тормозит также Cu2+-стимулируемое образование АФК.
К внеклеточной неферментативной АОС в настоящее время относят ураты и билирубин – метаболиты, образующиеся при расщеплении пуриновых нуклеотидов и _емма, а также витамины С, Е и А (каротины), поступающие в организм с пищей.
Компоненты АОС работают в комплексе: ферментативная АОС осуществляет обезвреживание О2- и Н2О2 ингибиторы органических радикалов также участвуют в цепочке взаимопревращений, в результате которых образуется менее активная форма радикала.
ROO· ® (токоферол)· ® (аскорбат)· ® (урат)·
Целесообразность существования таких взаимопревращений заключается в более гибкой регуляции и надежности гомеостазирования свободнорадикальных процессов в клетке [Соколовский, 1988].
Церулоплазмин: структура, свойства, биологическая роль
Церулоплазмин (КФ 1.16.3.1, ферро- О2- оксидоредуктаза, ЦП) – металлогликопротеин a2 – глобулиновой фракции, относится к семейству голубых оксидаз. ЦП – белок с большой молекулярной массой, представленный одной полипептидной цепью, но имеющий несколько изоформ и характеризующийся сложной картиной распределения в тканях, а также разнообразием кооперативных форм участия в метаболизме меди и железа в организме [Мжельская, 2000]. ЦП связывает более 95 % общего количества меди, содержащейся в сыворотке крови. Молекула ЦП состоит из 1046 аминокислотных остатков, содержит около 8 % углеводов и 6-7 атомов меди. Пространственная организация и каталитические свойства ЦП определяются присутствием меди [Василец, 1975]. ЦП – это мультифункциональный белок, одна из главных его функций – медьтранспортная, реализуется при взаимодействии со специфическими рецепторами, локализованными на наружной поверхности плазматических мембран клеток. Установлено существование специфического белка-рецептора на мембранах различных клеток, в том числе и на мембранах эритроцитов человека [Пучкова, Вербина и др. 1991]. Рецепция осуществляется путем связывания терминальных остатков сиаловых кислот эритроцитарной мембраны и остатков маннозы и ацетилглюкозамина углеводной части молекулы ЦП. Известно, что лишь 40 % ЦП содержит углеводный фрагмент способный прочно связываться с рецепторами эритроцитов [Саенко, Ярополов, 1991].
В гепатоцитах синтезируется три молекулярные формы ЦП: две из них – секретируемые (сывороточный ЦП и ЦП с молекулярной массой 200 кД), третья – внутриклеточный несекреторный ЦП-подобный белок с молекулярной массой 50 кД. Помимо печени мРНК ЦП обнаружены в коре головного мозга, мозжечке, гипоталамусе, сосудистом сплетении мозговых желудочков, кишечнике, почках, сердце, ретикулоэндотелиальной системе селезенки и бронхиолярном эпителии человека и лабораторных животных [Мжельская, 2000]
ЦП является одним из основных АО плазмы крови. Особенностью этого белка является высокая стабильность к токсическому действию АФК, что позволяет ему сохранять биологическую активность в условиях интенсивной генерации АФК [Gutteridge, Richmond, Halliwell,1980].
ЦП проявляет как специфическую, так и неспецифическую антиоксидантную активность. Специфическая активность, связанная со снижением уровня активных метаболитов кислорода, может быть реализована несколькими путями. В плазме крови церулоплазмин окисляет Fe2+ до Fe3+, после чего окисленные ионы железа связываются трансферрином и транспортируются в гепатоциты и развивающиеся ретикулоциты. Существенно, что окисление железа ЦП, в отличие от неферментативного окисления Fe2+ в присутствие О2, не сопровождается образованием супероксидного анион – радикала, поэтому в окислительных реакциях с участием ионов железа ЦП оказывается антиоксидантом [Киселев, 1988]. ЦП обладает способностью удалять из крови супероксидные анион-радикалы. Он вызывает дисмутацию О2-, которая имеет не ферментативный, а стехиометрический характер, таким образом происходит восстановление О2- до воды, а не до перекисей, в отличие от других антиоксидантных ферментов. Со способностью перехватывать О2- связывают ингибирующее действие ЦП на процессы ПОЛ в хиломикронах и липопротеинах [Санина, Бердинских, 1986]. ЦП является наиболее сильным среди белков сыворотки ингибитором образования гипогалоидов в системе милопероксидаза-Н2О2-Сl-, способен инактивировать АФК, генерируемые миелопероксидазой, защищая a1- антипротеиназу от окислительной инактивации гипохлоритом [Зенков и др., 1993].
Неспецифическая антиоксидантная активность Цп обусловлена образованием комплексных соединений с медью [Саенко, Ярополов,1991].
Глава 2. Материалы и методы 2.1. Объект исследования Были проведены исследования 3-х пациентов женского пола в возрасте от 21 до 51 года, поступивших в стационар ККБ №1 с заболеванием – эндемический зоб. Исследования проводили на крови, взятой из вены медперсоналом ККБ№1. У каждой пациентки кровь бралась 4 раза: А – до оперпции, Б — в день операции, В – через3-4 дня после операции, Г-через неделю после операции. Определяли активность церулоплазмина в плазме крови.
2.2. Методика определения активности ЦП
Определение церулоплазмина в плазме крови модифицированным методом Ревина [].
Принцип метода основан на окислении р-фенилендамина при участии церулоплазмина [Камышников, 2000].
Реактивы:
1. 0.5 %-ный водный раствор солянокислого р-фенилендиамина.
2. <metricconverter productid=«0.4 М» w:st=«on»>0.4 М ацетатный буфер, рН 5.5. Готовят из двух растворов:
1) <metricconverter productid=«54.44 г» w:st=«on»>54.44 г ацетата натрия растворяют в 1л дистиллированной воды;
2) 22.6 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 1л.
Полученные растворы смешивали в отношении 9:1 в большом количестве.
3. 3%-ный раствор фтористого натрия. После растворения соли в дистиллированной воде раствор профильтровывают.
Ход определения:
В пробирки вносят по 8 мл ацетатного буфера и 0.1 мл плазмы. В контрольную пробирку добавляют 2мл раствора фтористого натрия (для инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем во все пробирки вносят по 1 мл раствора р-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивают, помещают в термостат и инкубируют в течение часа при температуре 37 С. После инкубации во все пробирки (за исключением контрольной) добавляют по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивают, затем их переносят в холодильник, где выдерживают 30 мин при 4С. Пробы колориметрируют против контроля (бледно-розовой окраски) в кюветах с шириной слоя <metricconverter productid=«1,0 см» w:st=«on»>1,0 см при  = 530 нм.
Умножая значение оптической плотности на коэффициент пересчета 875, получают величину концентрации церулоплазмина в мг/л.
2.3 Статистическая обработка результатов Обработка эксперементальных данный проводилась общепринятыми методами [Лакин, 1980].

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для определения изменения активности церулоплазмина в течение периода лечения, кровь бралась 4 раза:
А – до операции;
Б – через 1-2 часа после операции;
В – через 3-4 дня после операции;
Г – через 7 дней после операции.
В плазме крови людей в норме согласно литературным данным (http://www.health-ua.com/articles/1368.html) ЦП содержится в концентрации 0.20-0.40 мг/мл, т в среднем 0.3 мг/мл. У больных эндемическим зобом, наблюдается значительное увеличение концентрации данного антиоксиданта (рис.1.).
 <shapetype id="_x0000_t75" coordsize=«21600,21600» o:spt=«75» o:divferrelative=«t» path=«m@4@5l@4@11@9@11@9@5xe» filled=«f» stroked=«f»><path o:extrusionok=«f» gradientshapeok=«t» o:connecttype=«rect»><lock v:ext=«edit» aspectratio=«t»><imagedata src=«42961.files/image001.emz» o:><img border=«0» width=«389» height=«314» src=«dopb210793.zip» v:shapes="_x0000_i1025">
Рис.1. Содержание ЦП в плазме крови здоровых людей и больных эндемическим зобом (1: конц. ЦП в норме; 2: конц. ЦП до операции).
У пациентов была проведена операция по удалению части ЩЗ.
Динамика изменений концентрации ЦП приведена на рис.2.
<imagedata src=«42961.files/image003.emz» o:><img border=«0» width=«366» height=«268» src=«dopb210794.zip» v:shapes="_x0000_i1026">
Где
1 – до операции;
2 – через 1-2 часа после операции;
3 – через 3-4 дня после операции;
4 – через 7 дней после операции.
Рис.2.
После удаления части щитовидной железы у больных эндемическим зобом наблюдается постепенное уменьшение концентрации ЦП в плазме крови. Но на стадии 3 (через 3-4 дня после операции), заметно незначительное увеличение концентрации, после чего уровень ЦП приближается к нормальной величине, но не попадает в рамки допустимой нормы.
ВЫВОДЫ 1. Проанализирован литературный материал по теме данной курсовой работы.
2: Отработана методика определния церулоплазмина в плазме крови.
3. У больных с эндемическим зобом отмечается повышенный уровень церулоплазмина в плазме крови, превышающий контрольную величину на (%).
4. При данной патологии щитовидной железы после операции концентрация церулоплазмина в крови не достигает нормы.
ЛИТЕРАТУРА 1. Ю.А. Владимиров, Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А.Азизова, А.И.Деев и др.// Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. − 1991. − Т. 29. – С.
    продолжение
--PAGE_BREAK--