Реферат: Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации

Реферат.

Дипломнаяработа на тему:«Биохимическиепоказателикрови человекапри сальмонеллезнойинтоксикации»содержит 46 страницпечатноготекста, таблиц,8 рисунков, 59использованныхисточниковлитературы, из них 10 иностранных.

Переченьключевых слов: сальмонеллез, перекисноеокислениелипидов, циркулирующиеиммунные комплексы, каталаза, молекулысредней массы, сывороточныйальбумин, эндогеннаяинтоксикация.

Объектисследования: сыворотка кровипрактическиздоровых людейи больныхсальмонеллезомг. Пензы.

Практическоеприменение: в здравоохранении.

Списоксокращений.

ПОЛ– перекисноеокислениелипидов;

ЦИК– циркулирующиеиммунные комплексы;

ЧСА– человеческийсывороточныйальбумин;

МДА– малоновыйдиальдегид;

ПЭГ– полиэтиленгликоль;

АОС– антиокислительнаяспособность;

АТ –антитело;

АГ –антиген;

ИК –иммунный комплекс;

ЛПС– липополисахаридныйкомплекс;

МСМ– молекулысредней массы;

ТБК– тиобарбитуроваякислота;

ЭКА– эффективнаяконцентрацияальбумина;

ОКА– общая концентрацияальбумина;

ТХУ– трихлоруксуснаякислота;

ЦНС– центральнаянервная система;

ц-АМФ– циклическийаденозинмонофосфат;

АФК– активныеформы кислорода;

LOOH,HOOH– гидроперекиси;

СОД– супероксиддисмутаза.

Содержание.

Введение………………………………………………………………..

Обзор литературы ………………………………………………...

Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной инфекции…………………………..……..

Молекулярные механизмы развития эндогенной

интоксикации при сальмонеллезе……………………..…..

Показатели уровня эндогенной интоксикации

организма при сальмонеллезе……………………………….

Материалы и методы исследования………………………….

Материалы исследования…………………………………….

Методы исследования…………………………………………

Результаты и обсуждение………………………………….……

Определение показателей уровня интоксикации в

сыворотке крови практически здоровых людей……..

Определение показателей уровня интоксикации в

сыворотке крови больных сальмонеллезом………….…..

Список использованных источников……………………….…..

Выводы………………………………………………………………….

Приложения…………………………………………………………….

5-6

7-19

7-11

11-14

14-19

20-25

20

20-25

26-34

26-27

28-34

35-40

41

42-46

Введение

Успехи в борьбес инфекционнымизаболеваниямив нашей странеобщепризнанны.Вместе с темв инфектологииеще остаютсяпроблемы, имеющиесерьезноесоциально-экономическоезначение длявсех странмира. К их числуотносятсяострые кишечныеинфекционныезаболевания[1].

Сальмонеллез– группа острыхкишечных инфекционныхболезней, вызываемыхбактериямирода Salmonella, характеризующихсязначительнымполиморфизмомклиническоготечения, частымналичиеминтоксикации, лихорадки, признаковпораженияжелудочно-кишечноготракта [2].

Крупные достиженияотечественныхи зарубежныхисследователей, установившихпатогенетическоезначение нарушениябиологическойрегуляции приострых кишечныхинфекциях, далиновый импульсв изучениипатогенезасальмонеллеза[3].

Иммунная системапредставляетсобой сложнуюмногокомпонентнуюсистему избыстроделящихсяи покоящихсяклеток. Онаявляетсявысокочувствительнойк воздействиютоксинов бактерий.Это приводитк нарушениюиммунорегуляторныхпроцессов.

Наиболееинформативнымиявляются показателисостоянийпрооксидантно-антиоксидантногоравновесия, которое приусилении действияна организмтоксинов смещаетсяв сторону активизацииПОЛ, уровняхолестерина, ЦИК, Ит, МСМ.

ПОЛ – это фундаментальныйуниверсальныймолекулярныймеханизм, лежащийв основе устойчивостии адаптационныхвозможностейорганизма. Внорме ПОЛобеспечиваетусловие дляжизненно важныхфункций клетки, в случае жеинтоксикациистановитсяпусковым механизмомпатобиохимическихизменений ворганизмечеловека.

Целью моейдипломнойработы являетсяизучениебиохимическихпоказателейэндотоксикозав динамикепатологическогопроцесса. Взадачи исследованиявходило:

Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и активности каталазы в группе контроля, которую составили практически здоровые люди.

Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и активности каталазы у больных сальмонеллезом.

Исследование изменения изучаемых показателей у больных в зависимости от степени тяжести заболевания.

Обзор литературы

Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной инфекции

Сальмонеллезыпринадлежатк числу инфекционныхзаболеваний, весьма широкораспространенныхна всех континентахмира. Возбудителемсальмонеллезовявляютсямикроорганизмы, принадлежащиек роду Salmonella, семействакишечныхEnterobacteriaceae.

Сальмонеллы– это мелкие бактерии вытянутой формы с закругленными концами длиной от 1 до 3 и диаметром0,5-0,8 нм [4].

Сальмонеллезвстречаетсячаще у жителейгородов, чемсел, что связываетсяс лучшей регистрациейзаболеваемости, наличиеммножественныхдетских учреждений, широким употреблениемпищевых полуфабрикатов.Заболеваниеотмечаетсякруглый год, но максимальноечисло регистрируетсяв теплое времягода, что объясняетсяблагоприятнымиусловиямиразмножениясальмонеллв пищевых продуктахи реализацииинфекции [5].

Таблица1.1.1.

Статистическиеданные больныхсальмонеллезомг. Пензы.

Год

Количество больных

г. Пензы

На 100 тыс. населения, %

Кол-во больных Пензенской

области

На 100 тыс. населения, %

1996

187

34,9

362

23,1

1997

140

26,1

316

20,3

1998

230

43,0

448

28,8

В возникновениисальмонеллезаведущую рольиграют живыебактерии, гибелькоторых в организмебольногосопровождаетсяразвитиемэндотоксинемии.Принято выделятьдва вида токсичныхпродуктовжизнедеятельностимикробов-экзотоксиии эндотоксии.К экзотоксинамотнесены токсичныепродуктыжизнедеятельностибактерий, активно(при жизни)секретируемыев окружающуюсреду, а к эндотоксинам– те ядовитыедля макроорганизмапродуктыжизнедеятельности, которые освобождаютсятолько прилизисе микробнойклетки [6].

Кроме токсинапалочка имеетряд антигеновклеточнойстенки. О-антигенрасположенна поверхностимикробнойклетки и представляетсобой фосфолипидно-полисахаридныйкомплекс, включающий60 % полисахарида,20-30 % липида и 3-4,5 %гексозамина.Н-антигенопределяетсяжгутиками.Поверхностныеантигены клеточнойстенки провоцируюттипоспецифическийантительныйответ, а глубинные– видоспецифический[6,7].

При сальмонеллезеразвитие итяжесть симптомовобусловленыинтоксикациейи обезвоживанием.По мнению А.Ф.Билибина интоксикация– явление сложное, сводящеесяк изменениюнервнорефлекторнойдеятельностии гуморальнойрегуляции собменнымисдвигами. К.В.Бунин в основусиндрома интоксикацииставит воздействиетоксина на:

падение артериального давления, снижение сократительной способности миокарда;

гормональную регуляцию водно-солевого обмена с изменениями биосинтеза гормонов в коре надпочечников с угнетением процесса их метаболизма;

функцию почек (снижение клубочковой фильтрации, повышение канальцевой реабсорбции воды, снижение концентрации очищения мочевины) [8].

Сальмонеллезнаяинтоксикациявозникает какрезультатпатологиипервичногоответа наинфекционныйагент вследствиезначительныхпотерь водыи электролитовс рвотой и жидкимстулом. По мереувеличениядефицита водыи электролитовна первый планвыступаютсимптомыобезвоживанияи пораженияЦНС. Если процесспрогрессирует, обезвоживаниенарастает, появляютсяпризнакинедостаточностикровообращения, которые приинтоксикацииимеют клиникушока. Частаярвота и понос– первые признакиинтоксикации[9].

Обязательнымусловием развитиязаболеванияявляются наличиебольшого количествавозбудителейи их токсинов, массовоепроникновениеантигенов вкровь. Наибольшейтоксичностьюотличаетсялипид А, вызывающийследующиеосновные реакции: активациюлейкоцитови макрофагов, стимуляциювыброса эндогенногопирогена, антогонистаглюкокортикоидов, интерферона, интерлейкинов, подавлениетканевогодыхания, активациюсистемы комплемента, тромбоцитов, факторов свертываниякрови другие[10,11], [рис. 1.1.1].

Главной причинойразвития шокапри сальмонеллезесчитается неповреждающеедействие самихмикробов илиих токсинов, а своеобразныйответ организмана них. Подтоксико-инфекционнымшоком следуетпониматьэкстремальноесостояниеорганизма, наступающеев результатедействия токсичныхсубстанцийвозбудителей, патогенныхиммунных комплексовна органы иткани организма, сопровождающеесяострым нарушениемметаболизмав них [12].

Схематическоеизображениелипополисахаридов

стенок микробов.

/>

Рис. 1.1.1.

С.А. Степановс помощьюаспирационнойбиопсии обнаружилв тонкой кишкебольных сальмонеллезомизменениеэпителия, остроевоспалениеслизистойоболочки, нарушениемикроциркуляциии сосудистойпроницаемости.К.Х. Ходжаев вэкспериментена крысах показал, что сальмонеллезнаяинфекция вызываетнарушениепроцесов тканевогодыхания ифосфорилирования.Состояниеподжелудочнойжелезы изученоБелянской Т.А.В острый периодболезни отмеченоснижениеферментативнойактивностипанкреатическогосока – уровеньтрипсина былснижен в 71 % случаев, липазы в 55 %, амилазы– в 66 %.

Таким образомэндотоксинвызывает активациюсинтеза, преимущественнопротеолитическихферментов, задержку экструзиисекретируемыхпроэнзимов, что приводитк секреции ипоступлениюферментов влимфатическоеи кровеносноерусло [13,14].

При сальмонеллезеразвиваетсяобезвоживание, обусловленноепотерей внеклеточнойжидкости, а притяжелом течениизаболеванияи части клеточной.Дегидратацияв большинствеслучаев имеетизотоническийхарактер, сочетаясьс развитиемсгущения крови, дефицитомэлектролитов, метаболическимацидозом вкапиллярнойи венознойкрови [15], [рис.1.1.2].

Молекулярные механизмы развития эндогенной

интоксикациипри сальмонеллезе

Явления интоксикациивызывают заболевания, сопровождающиесяповышеннымраспадом тканей, усиленнымипроцессамикатаболизма, недостаточностьюфункции печении почек, снижениемпроцессовмикроциркуляции[16].

В ответ на действиепервичногопатогена, которымявляются эндотоксины, сальмонелл, в организмеразвиваютсятиповые каскадныереакции, чтолежит в основесовременнойконцепции СЭИ.

На Международномсимпозиумев Санкт-Петербурге(1994 г) было даноопределениеэтого синдромакак клиническогосиндрома спроявлениемсимптомовинтоксикациипри патологическихсостоянияхнеоднородныхпо этиологиии обуславливающихнакоплениев тканях ибиологическихжидкостяхорганизмапродуктовпатологическогообмена веществ, метаболитов, деструкцииклеточных итканевых структур, разрушениябелковых молекул[17,18].

Шано В.П. с соавторамиподчеркивает, что токсическоевлияние липополисахариднойсубстанцииэндотоксинапроявляетсякомплексомнарушений, обусловленныхповреждениемкак циркулирующихклеток в кровотоке, так и эндотелиоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, следствиемчего являетсявыброс в кровотокряда биологическиактивных веществ– цитокинов, интерлейкинов.Главной точкойприложенияэндотоксинаявляютсяэндотелиальныеклетки, активацияих приводитк высвобождениюпростациклина, выделениюэластазы, токсическихметаболитовкислорода, факторов активациитромбоцитови комплементас высвобождениемтерминальногокомплексакомплемента, брадикининас последующимформированиемсиндрома повышеннойпроницаемостикапилляров.Это приводитк тому, что вочаг воспаленияначинают входитькомпонентыкрови, преждевсего фибриногени тромбоциты.Фибрин способствуетагрегациитромбоцитов, полимеризациифибрина и –возникновениютромбов. Следствиемтромбоза являютсянарушениямикроциркуляциис последующейгипоксией, чтоприводит кдальнейшимповреждениямклеток в очагевоспаления.Метаболическимрезультатомэтого являетсяизменениеаэробногометаболизмаклеток на анаэробный, повышенноепродуцированиелактата и протонов, снижение показателейрН [19].

Среди тканевых(клеточных)медиатороввоспаленияважное местозанимаютпростагландины.Исходнымипродуктамидля биосинтезапростагландиновявляются ненасыщенныежирные кислоты: линолевая, арахидоновая, пентаноевая.Наибольшеезначение имеетв организмеарахидоноваякислота, котораясодержитсяв фосфолипидахклеточныхмембран.

Простагландинывызывают сильноедиуретическоеи натрийуретическоедействие, оказываютразнообразноедействие нажелудочно-кишечныйтракт. Они могутстимулироватьи тормозитьсокращениеи секреторнуюактивностьтонкой кишки, тормозят секрециюсоляной кислотыслизистойоболочки желудка.Простагландинывызывают секрециюводы и электролитовв просвет кишки, вызывая диарею, повышают концентрациюц-АМФ в слизистойоболочке тонкойкишки, влияютна прочностьи упругостьэритроцитарноймембраны [20, 21, 22,49].

Показатели уровня эндогенной интоксикации

организмапри сальмонеллезе

Анализируяданные литературыза последниедесятилетия, можно сказать, что основнымипоказателямиинтоксикациипри сальмонеллезеявляются ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, ИТ, МСМ иактивностькаталазы. Приразвитии интоксикациина фоне сальмонеллезапроисходитактивный хемотаксиснейтрофилловв очаг воспаления, где они поглощаяи перевариваячужеродныйагент, изменяютсвою метаболическую активность, характеризующуюсяусилениемпоглощениякислорода, повышеннойутилизациейглюкозы игиперпродукциейАФК (/>)[23, 24].

Перекисноеокислениеявляетсяуниверсальныммеханизмомвзаимодействиякислорода сомногими органическимисубстратами, в том числе слипидами. Внедрениекислорода вмолекулы окисленногосубстратаприводит кобразованиюреакционно-способныхпромежуточныхпродуктов –свободныхрадикалов, гидроперекисей, которые в дальнейшемвызывают повреждениедругих классовсоединений– белков, нуклеиновыхкислот, углеводов(рис. 1.3.1).

Метаболизмсупероксидногорадикала внорме

и припатологии(ВладимировЮ.Я., 1998)

/>

Рис.1.3.1.

Накопленныек настоящемувремени данныелитературыпозволяютсделать выводо том, чтосвободнорадикальноеокислениелипидов присальмонеллезнойинфекции играетопределеннуюпатогенетическуюроль [25, 50].

Установлено, что при развитииПОЛ в биомембранахпонижаетсясодержаниелегкоокисляемыхполиненасыщенныхжирных кислоти изменяютсяфизико-химическиесвойства: микровязкость, текучесть, мембранныйпотенциал, полярностьвнутреннихобластей мембран. Таким образом, изменяютсятранспортныесвойства мембраныи активностьферментов [26].

Регуляциясвободнорадикальногоокисленияобеспечиваетсяв клетке системойантиоксидантнойзащиты. Так, накапливающаясяв процессе ПОЛперекись водородаобезвреживаетсяс помощью каталазы, присутствующейво всех тканяхорганизма.Каталаза (КФ1.11.1.6.) представляетсобой гемсодержащийфермент смолекулярноймассой около250000 Д, локализованныйв пероксисомахклеток [27].

Митохондриальнаякаталаза участвуетв оксидазномпути окисления, сопровождающемсязапасаниемэнергии в видеАТФ. Блокированиетранспортаэлектроновв дыхательнойцепи приводитк стимуляциипероксисомальногоокисления. Припотологиях, связанных снарушениемэнергетическихпроцессов, каталаза пероксисомможет выходитьиз них и участвоватьв окислениина мембранахэндоплазматическогоретикулума[28, 53].

В работе Л.Б.Оконенко ссоавторамио состоянииантиоксидантнойсистемы судилипо активностиСОД, глутатионпероксидазыи каталазы, анализ данныхвыявил дефицитантиоксидантов[29, 30].

При инфекционномтоксикозе вмембранахэритроцитоврезко снижаетсясодержаниеобщих фосфолипидов, но увеличиваетсяколичествоНЭЖК и лизофосфотидилхолина, что косвенноуказывает наповышениеактивностифосфолилаз, которые избирательноразрушаютлипиды мембран.Холестеринподвергаетсякак активному, так и пассивномуобмену в мембранахэритроцитов[29]. Ферментлецитинхолестеролацилтрансферазапревращаетэфиры холестеринав свободныйхолестерини тем самымрегулируетуровень свободногохолестеринав плазме, чтоспособствуетпроникновениюего в мембраны.Следовательно, инактивацияэтого ферментав результатегипоксии приэндотоксикозеведет к повышениюуровня эфировхолестеринав мембранахэритроцитов[31,32].

Наряду с уровнемМДА, активностикаталазы иуровня холестеринадля диагностикизаболеванияи его прогнозаимеют значениеи другие неспецифическиепоказатели– ЦИК, Ит, МСМ.

Синтезирующиесяпри формированиииммунитетаспецифическиеантитела обладаютспособностьювзаимодействоватьс антигенамивозбудителейи тем самымвызыватьнейтрализациюпатогенныхмикробов и ихтоксинов. Этареакция сопровождаетсяобразованиемиммунных комплексовантиген – антитело[33, 34, 54, 55]. При патологическихсостоянияхобразованиеИК выходит изпод контроля, в результатечего развиваетсята или инаяболезнь ИК[рис. 1.3.2.].

--PAGE_BREAK--

Патогенетическиемеханизмыболезней иммунных

комплексов(Сура В.В., 1987)

/>

Рис. 1.3.2.

В результатеразвития эндотоксемиипри сальмонеллезеорганизм длительноевремя контактируетс избытком АГкак экзогенного(компонентымикробныхклеток), так иэндогенного(компонентыразрушенныхклеток самогоорганизма)происхождения.Вместе с темнаблюдаетсяугнетениесистемы комплемента, ответственногоза лизис микробныхклеток. В этихусловияхзначительногоизбытка АГ инедостаточностивыработки АТможет привестик образованиюИК, которыеспособныоткладыватьсяв определенныхтканях и вызыватьострые воспалительныереакции. Призначительныхотложенияхнаблюдаютсяфункциональныеи морфологическиеповрежденияорганов и тканей[35].

Связываясьс клеточноймембраной ЦИКвызывают выделениев окружающуюсреду протеолитическихферментов иосновных пептидов.Эти веществаповреждаютпротеогликановыекомпонентытканей, действуютна базальнуюмембрану ивызывают некрозэндотелиальныхклеток [36].

ЦИК наряду спродуктамиПОЛ вызываютнарушениепроницаемостимембран, вплотьдо их разрыва, что в конечномитоге можетпривести кгибели клетки.В результатепоявляютсяразличныевещества пентиднойприроды. Из нихнаибольшийинтерес представляютмолекулы среднеймассы.

Являясь олигопептидамис молекулярноймассой 300-5000 Дальтон, они расцениваютсякак универсальныйкритерий эндогеннойинтоксикациии влияют на ееуровень и прогноз[37, 38].

МСМ образуютсяв организмепод воздействиемповреждающихэндогенныхили экзогенныхфакторов различногогенеза, являютсяпромежуточнымипродуктамипротеолиза.[39, 57].

Пристальноевниманиеисследователейк МСМ объясняетсявысокой биологическойактивностьюих отдельныхфракций, которыеингибируютгликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновыхкислот, мембранныйтранспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию, обладаютиммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропнымсвойствами.Сейчас, квалификационнаяоценка степенитяжести состояниябольных присальмонеллезенемыслима безопределенияМСМ [40].

Установлено, что значительнаячасть циркулирующихв крови СМ нетолько растворенав плазме крови, но и связанас альбумином.

Человеческийсывороточныйальбулин (ЧСА)– важнейшийтранспортныйбелок, осуществляющийперенос эндогенныхметаболитови ксенобиотиковв плазме крови, межклеточнойжидкости, влимфе.

Универсальностьтранспортнойфункции ЧСАобеспечиваетсяего уникальнойспособностьюсвязыватьлиганды различнойхимическойприроды. Интенсивнаялиганднаянагрузка молекулальбулинаприводит кизменению ихструктуры исвязывающейспособности.Такие модификационныеформы ЧСАобнаруживаютсяпри патологии[41].

О величинетоксическогодействия вредныхвеществ можносудить по ЭКА, которая снижаетсяпосле того, кактоксическиевещества займутцентры связыванияв молекулеальбулина, чтоприводит кснижениюдетоксикационныхсвойств организма.Изучение свойствальбулинаявляется важнымс точки зрениякак диагностики, так и лечения[42].

Материалы и методы исследований

Материал исследований

Уровень интоксикацииоценивалсяпо изменениямв крови больныхэффективнойи общей концентрацийсывороточногоальбулина, малоновогодиальдегида, как одного изпродуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и активностикаталазы.

Для всех исследованийбралась сывороткакрови. Исследовано30 больных сальмонеллезомв возрасте от17 до 46 лет. Дляконтроля набираласьгруппа 51 человекаразного полав возрасте от20 до 46 лет.

Кровь браласьиз локтевойвены, преимущественнонатощак в количествене менее 5 мл.Центрифугируем1500 об/мин 10 минут.Для выполненияанализов сывороткинеобходимоиспользоватьсразу или заморозитьи хранить приt=-20/>С.

Методы исследований

2.2.1. ОпределениеМДА с тиобарбитуровойкислотой

(Конюхова В.С.,1989)

Об измененииинтенсивностиПОЛ судим поизменениюуровня вторичногопродукта ПОЛ– малоновогодиальдегида.

Метод основанна том, что привысокой температурев кислой средеМДА реагируетс 2-ТБК, образуяокрашенныйрозовый триметиновыйкомплекс смаксимумомпоглощенияпри 535 им.

Ход работы: К0,2 мл сывороткикрови добавить0,2 мл дистиллированнойводы, 1 мл 0,6 % ТБКв ледяной уксуснойкислоте. Кипятить30 минут, охладитьи добавить 1 мл5№ КОН и 2 мл изопропанола.Центрифугируютпри 6000 об/мин 20минут. Колориметрируютпри 535 нм и 580 нмпротив контроля, содержащеговместо плазмыводу.

Расчет: />(мкМоль/л), гдеЕ – оптическоепоглащениеизопропиловогоэкстракта; 106– коэффициентпересчетаоптическойплотности.

Пример расчета: больной МаксимовС., 19 лет

/>

концентрацияМДА = />(мкМоль/л).

2.2.2. Определениеактивностикаталазы

(Королюк М.А.,1988)

Метод основанна способностиперекиси водородаобразовыватьс солями молибденастойкий окрашенныйкомплекс.

Ход определения: Реакция запускаетсядобавлением0,1 мл сывороткикрови к 2 мл 0,03 %раствора перекисиводорода. Вхолостую пробувместо сывороткивносят 0,1 млдистиллированнойводы. Реакциюостанавливаютчерез 10 минутдобавлением1 мл 4% молибдатааммония. Интенсивностьокраски измеряютна спектрофотометрепри длине волны410 нм противконтрольнойпробы, в которойвместо перекисиводорода вносят2 мл воды.

Расчет: />(мкат/л), где

Е – активностькаталазы вмкат/л;

А – оптическаяплотностьхолостой иопытной проб;

V – объем вносимойпробы, 0,1 мл;

t – время инкубации,600 сек;

К – коэффициентмиллимолярнойэкстинкцииперекиси водорода, равный />.

За единицуактивностикаталазы принимаютто количествофермента, котороеучаствует впревращении1 мкат перекисиводорода за1 секунду призаданных условиях.Расчет активностикаталазы ведутна 1 л сывороткикрови.

Пример расчета: больной КрайновТ.В., 31 год.

/>

/>

/>(мкат/л)

2.2.3. Определениеобщего холестеринав сывороткекрови ферментативнымметодом «Фотокол»

(ТвороговаМ.Г., 1995)

Определениеосновано насопряженныхреакциях, которыекатализирует холестеринэстераза, холесериноксидазаи пероксидаза:

Эфиры холестерина/>холестерин+ Ж.К.;

Холестерин+ О2/>холестинон+ Н2О2;

Н2О2 + хромогены/>Н2О + окрашенныйпродукт.

Концентрацияобразующегосяв ходе реакцииокрашенногопродуктапропорциональнаконцентрациихолестеринав пробе.

Ход определения: Рабочий реагентобязательновносить в пробиркипосле проб, содержащиххолестерин.Пробирки встряхнутьи инкубироватьпри t = 37oС.Через 10 минутпосле началаинкубациипробирки повторновстряхнутьи инкубировать20 минут при t= 37oС. Окрашенныепробы фотометрироватьпри 500 нм в кюветес длиной оптическогопути 5 мм или10 мм относительнохолостой пробы.Окраска стабильнав течении двухчасов при комнатнойтемпературе.

Концентрациюхолестеринав исследуемыхпробах рассчитатьпо формуле:

/>ммоль/л, где

ЕОП и ЕК –оптическиеплотностиисследуемойпробы и пробыс калибратором.

Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.

2.2.4. Определениециркулирующихиммунных комплексов

в крови методомПЭГ-теста (ГриневичЮ.А., 1988)

Метод основанна селективнойпреципитациикомплексовАТ-АГ в 3,75 % ПЭГ(полиэтиленгликоля)с последующимопределениемплотностипреципитата.

Реактивы:

0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры растворить в 1 л дистиллированной воды)

10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.

Ход определения: К 0,3 мл сывороткикрови добавить0,6 мл реактива№1, перемешатьи перенестипо 0,3 мл в 2 пробирки.В I добавить2,7 мл раствора№1 (контроль).Во II добавить2,7 мл раствора№2 (опыт). Перемешать, инкубироватьв течение 60 минутпри комнатнойтемпературе.На спектрофотометре(КФК-3) определяютоптическуюплотность вкюветах />при 450 нм.

Расчет: Высчитываютразность показателейоптическойплотности, результатумножают на1000 и получаютколичествоИК в 100 мл сыворотки.Ответ выражаютв единицахоптическойплотности. /> — количествоЦИК в 100 мл сыворотки.

Норма: 54,24 + 2,03 усл.ед.

Пример расчета: больной МаксимовС.И., 19 лет.

/>

/>

КоличествоЦИК в 100 мл сыворотки:

/>усл. ед.

2.2.5. Определениеуровня МСМ вкрови (ГабриэленН.И., 1984)

Метод основанна осаждениибелков из исследуемойжидкости 10 %раствором ТХУс последующемцентрифугированиеми определениемабсорбции светасупернатантомв 10 раз разведеннымдистиллированнойводой.

Ход работы: Сыворотку кровиобрабатывают10 % растворомТХУ. В качествеконтроля лучшеиспользоватьсам растворТХУ в 30 раз разведенныйдистиллированнойводой. Оптическаяплотность егопротив водысоставляет0,1230,012 усл.ед. на волне254 нм при 23-25/>С.Центрифигируем3000 об/мин в течение30 минут. К 0,5 млнадосадочнойжидкости +4,5 млдистиллированнойводы. Измерениепроводим наспектрофотометрев УФ свете при280 нм для определенияароматическихаминокислоти при длиневолны 254 нм дляопределениянуклеотидов.Уровень МСМвыражают вединицах, количественноравных показателямэкстинции.

2.2.6. Определениепоказателей«эффективнаяконцентрация

альбумина»и «общая концентрацияальбумина»в сывороткекрови человекафлуоресцентнымметодом

(Миллер Ю.И., 1994).

Принцип метода:

Метод основанна специфическомвзаимодействиифлуоресцентныхорганическихсоединенийс альбуминомв сывороткекрови. В зависимостиот условийэтого взаимодействияинтенсивностьфлуоресценциикрасителя изальбуминаотражает различныесвойства белка.Индекс ЭКА/ОКАне зависит отчисла молекулальбумина впробе и характеризуетфизико-химическиесвойства молекулыальбумина.

Состав набора:

Реактив I (4 ампулыпо 5 мл). Предназначендля приготовленияраствораиспользуемогопри разбавлениисывороткикрови. Он содержитантикоагулянтЭДТА.

Реактив II (4 ампулыпо 0,7 мл). Основнымкомпонентомявляется специальноефлуоресцирующеесоединение, интенсивностьфлуоресценциикоторого всыворотке кровипропорциональнаконцентрациисывороточногоальбумина.

Реактив III (4 ампулыпо 0,7 мл). Взаимодействиереактивов №2и №3 с сывороткойпозволяетопределитьОКА.

ОпределениепоказателяЭКА:

К 2,0 мл надосадочнойжидкости добавить0,025 мл реактива2. Перемешать.Измеритьинтенсивностьфлуоресценциипри длине волнывозбуждения420 нм и длине волныиспускания515 нм.

ОпределениепоказателяОКА:

В ту же пробудобавить 0,025 млреактива 3.Перемешать.Измеритьинтенсивностьфлуоресценции.Нормальныевеличины показателяЭКА лежат винтерваленормальныхзначений ОКАот 40 г/л – 55 г/л.

Подготовкаобразцов кровик измерениям:

Буферный раствор: Содержимоеампулы с реактивом1 перенести в100 мл дистиллированнойводы. Перемешать.0,025 мл сывороткикрови добавитьв пробирку, содержащую5 мл растворадля разбавлениякрови. Для анализаберут жидкость2,0 мл полученногообразца.

ИспользуютспециализированныйанализаторАКЛ-0,1.

Результаты исследования и их обсуждение

Определение показателей уровня интоксикации

в сывороткекрови практическиздоровых людей

Нами было произведеноисследованиебиохимическихпоказателей– МДА, активностькаталазы, уровеньхолестерина, ЦИК, МСМ, Ит всыворотке крови51 донора в возрастеот 20 до 46 лет. Сывороткакрови доноровбыла полученана ОСПК (областнаястанция переливаниякрови) г. Пензы.

Полученныерезультатыбиохимическиханализов былиподвергнутыстатистическойобработке, согласно методами приемамстатистическогоанализа.

По данным комитетаэкспертовМеждународнойфедерацииклиническойхимии по референтнымвеличинамрекомендуетсяверхняя и нижняяграницы нормына уровне М1,96σ, состояниепредболезниМ2σ, состояниеострой формыМ3σ.

Об уровне процессовПОЛ судили поконцентрациивторичногопродукта МДА.СодержаниеколичестваМДА составляет3,610,07 мкМоль/л.Это значениеблизко к данным, найденным влитературе(табл. 3.1.1). У 48 человекзначение содержанияМДА входит вграницы М1,96σ.У 3 человек (5 %)содержаниеМДА соответствуетзначению М2σ, что соответствуетсостояниюпредболезни.

Активностькаталазы упрактическиздоровых людейсоставила16,70,15 мкат/л(табл. 3.1.1). Приисследованииактивностикаталазы вгруппе доноровотклоненийза пределыМ1,96σ мыне наблюдали.

Уровень холестерина, определяемыйнами у практическиздоровых людейсоставил 4,450,68ммоль/л (табл.3.3.1.), показателиуложились вграницу референтнойвеличины М1,96σ.

СодержаниеЦИК, определяемоенами в сывороткекрови практическиздоровых людейсоставило52,623,52 усл.ед. (табл. 3.1.1). 94 % людейпо показателямЦИК входит вграницы нормы, а 6% находятсяв состояниипредболезни.

Уровень МСМу обследованныхдоноров в среднемсоставил 0,2800,01усл. ед. Это значениеблизко к данным, найденным влитературе(табл. 3.1.1). ПриисследованииМСМ отклоненийза пределыМ1,96σмы не наблюдаем.

У практическиздоровых людейопределенадетоксикационнаянагрузкасывороточногоальбумина, т.е.определениеобщей и эффективнойконцентрацииальбумина.Токсичностьпо альбуминусоставляет0,130,01 усл.ед. (табл. 3.1.1). Всезначения токсичностипо альбуминувошли в границыМ1,96σ.

Полученныенами данныене имели существенныхотличий отзначений этихпоказателей, имеющихся влитературев сравнениис приложением2.

Таблица3.1.1.

Содержаниебиохимическихпоказателейв сывороткекрови практическиздоровых людей

Группа

обследованных

n

МДА

мкМоль/л

Активность

каталазы

мкат/л

ЦИК

усл. ед.

МСМ

усл. ед.

Ит

усл. ед.

Холестерин

ммоль/л

Практически

здоровые

51

3,610,07

16,70,15

52,623,52

0,280,01

0,130,01

4,450,68

Определение показателей уровня интоксикации

в сывороткекрови больныхсальмонеллезом

Сыворотка кровибольных исследоваласьна базе центрагоссанэпиднадзораг. Пензы. Исследованиябиохимическихпоказателейвелись в оструюфазу заболеванияи в период раннейреконвалесценции.Обследованонами 30 больныхсальмонеллезомв возрасте от17 до 46 лет, с цельюустановленияпоказателей, характеризующихэндотоксикоз: перекисноеокислениелипидов, уровеньхолестерина, Ит по сывороточномуальбумину, циркулирующихиммунных комплексов, молекул среднеймассы и активностикаталазы. Причембиохимическиепоказателикрови в разгарзаболеванияотличалисьот показателейв период раннейреконвалесценции.

Таблица 3.2.1.

Биохимическиепоказателисыворотки крови

у больныхсальмонеллезом

Группа

обследованных

МДА

мкМоль/л

Активность

каталазы

мКат/л

Ит

усл. ед.

ЦИК

усл. ед.

МСМ

усл. ед.

Холестерин ммоль/л

Контроль, n=51 (практически

здоровые)

3,610,07

16,70,15

0,130,01

52,623,52

0.2800,01

4,450,68

Больные (острый период) n=30

7,190,2

13,090.16

0,290,01

100,634,04

0,5500,02

6,540,07

Больные (ранняя

реконвалесценция) n=30

3,870,15

15,840,19

0,150,01

68,92,8

0,3100,02

4,650,7

р≤0,001

р≤0,01

р≤0,001

р≤0,001

р≤0,05

р≤0,01

Так, в ходеисследованиявыявлено достоверноеувеличениеколичестваМДА в сывороткекрови больныхсальмонеллезомна 99 % по отношениюк контролю, т.е. возрастаетв 2 раза. Данныенаших исследованийподтверждаютсясведениямиЛ.Б. Оконенко, Л.Д. Мартыненкои другими. Поданным этихавторов концентрацияМДА при сальмонеллезевозрастаетв 2-2,5 раза.

Как видно изтаблицы (табл.3.2.1), у больныхнаблюдаетсяинтенсификацияПОЛ.

Под воздействиемсальмонеллезноготоксина происходитнарушениелипидных бислоевклеточных исубклеточныхмембран. Накоплениев крови первичныхи вторичныхпродуктов ПОЛидет не в силуколичественныхизменений всодержаниифосфолипидовплазмы крови, а вследствиеинтенсификацииих свободнорадикальногоокисления.Результатоминициации ПОЛстановитсяобразованиекритическихконцентрацийпродуктов ПОЛ, которые токсичныдля организма.Известно, чтоповышение ПОЛможет приводитьк нарушениюпроницаемостимембран с последующейинактивациеймембранно-ассоциированныхферментныхсистем, выходомлизосомальныхгидролаз вцитозоль, чтовызывает повреждениеДНК т другиесущественныеизменения вструктуре ифункциональномсостоянииклетки [29, 43, 51, 52].

Установлено, что при рядеинфекционныхзаболеванийразвиваетсяантиоксидантнаянедостаточность.Одновременноснижаетсяактиностьферментовантиоксидантнойзащиты, в частностикаталазы [44].

По нашим наблюдениям, активностькаталазы снизиласьна 22 % в острыйпериод заболеванияпо отношениюк контролю. Впериод раннейреконвалесценциипоказательактивностикаталазы приближаетсяк контролю(табл. 3.2.1).

Л.Б. Оконенко, Л.И. Волкова всвоих работахотмечает угнетениекаталазнойактивности.В острый периодзаболеванияпроисходитрезкое сокращениеантиоксидантнойобеспеченностиорганизма [26,29].

А.С. Волков указываетна то, что в процессеэндотоксикацииметаболическиерасстройстваприводят кгиперлипидемии.Это подтверждаетсяданными нашихнаблюдений.Так, уровеньхолестеринав сывороткекрови больныхсальмонеллезомв среднем составил6,540,07 ммоль/л, что на 46,9% большеконтроля (табл.3.2.1).

Таким образом, гиперхолестеринемияхарактеризуетпатологиюобмена липидови липопротеидов[32,45].

В период раннейреконвалесуценции уровень холестеринаприближаетсяк контролю[рис. 3.2.1].

    продолжение
--PAGE_BREAK----PAGE_BREAK----PAGE_BREAK--