Реферат: Электронно-микроскопические методы исследования в медицине
ЭЛЕКТРОННАЯМИКРОСКОПИЯ
Электроннаямикроскопия– метод морфологическогоисследованияобъектов спомощью потокаэлектронов, позволяющихизучить структуруэтих объектовна макромолекулярноми субклеточномуровнях.
Послевыпуска первойпромышленноймодели просвечивающего(трансмиссионного)электронногомикроскопаЭМ прошла большойпуть развитияи позволилаперейти накачественноновый уровеньизучения материи.ЭМ нашла широкоеприменениев морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, медицинскойгенетике, иммунологии.Благодаря ЭМраскрытасубмикроскопическаяструктураклеток, открытряд неизвестныхранее клеточныхорганелл, такихкак лизосомы, рибосомы, эндоплазматическийретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичныедля отдельныхвидов клеток.ЭМ позволилапонять многиетонкие механизмыразвития болезней, в том числе наранних этапахих возникновения, еще до появлениячёткой клиническойсимптоматики.
ЭМ все ширеприменяетсядля раннейдиагностикизаболеваний, а также длявыявленияэтиологииинформационныхпроцессов. Еёиспользуютв онкологиидля определениягистогенезаопухолей, чтоимеет важноезначение влечении и прогнозеонкологическогозаболевания.В нефрологииисследованияс помощью ЭМматериала, полученногопри пункционнойбиопсии, позволяетвыявить ранееморфологическиеизмененияструктур пачек, диагностироватьформу гломерулонефритаи т.п. При ЭМпунктатовпечени удаетсяпровестидифференциальнуюдиагностикугепатитов, гепатозов идругих заболеванийпечени, определитьактивностьпроцесса инередко егоэтиологию.
Исследованиястроения материина субклеточноми макромолекулярномуровнях сдерживаютсявозможностямиразрешающейспособностиэлектронныхмикроскопов.ИспользованиеЭМ в сочетаниис другими методами, например, савторадиографией, гистохимическими, иммунологическими, обусловилопоявлениеэлектроннойавторадиографии, электроннойгистохимии, иммунной электронноймикроскопии(электроннойиммуноморфологии)и других. Этопозволилозначительнорасширитьинформацию, получаемуюс помощью ЭМ, наблюдатьструктурноевыражениетечения биохимическихпроцессов вклетке, что, всвою очередь, подтвердилоодин из основныхметодологическихпринциповсовременнойбиологии –диалектическоеединство структурыи функции.
ЭМ требуетспециальнойподготовкиобъектов изучения, от которой взначительноймере зависятвозможностиметода. В соответствиис целями исследованияметодика такойподготовкиможет бытьразличной.Однако непременнымусловием длялюбых электронно-микроскопическихисследованийявляется фиксациятканей илимикробов смаксимальнымсохранениемих прижизненногостроения. Существуютдва принципиальноразличныхспособа фиксации: химическийи физический, каждый из которыхимеет различныеварианты.
В ЭМ, как правило, используютхимическуюфиксацию спомощью фиксаторов, обладающихстабилизирующимисвойствами.Универсальногодля любых тканейфиксатора несуществует, поэтому в зависимостиот задачи конкретногоисследованияприменяютсоответствующиефиксаторы. Привыборе химическихфиксаторовисходят из ихспособностикоагулироватьбелки (спирты, ацетон, некоторыекислоты, солитяжелых металлови др.) либостабилизироватьлипиды и гели(четырехокисьосмия, глутаровыйальдегид, формалин, двухромовоксильныйкалий и др.).
Для исследованияберут биопсийныйматериал илиматериал оттрупа человекаили животныхвскоре посленаступлениясмерти. Существуютоптимальныесроки взятияразличныхтканей и клеток, обычно исчисляемыеминутами. Чемраньше тканьпомешают вфиксатор, темболее достоверныеданные получаюто прижизненнойструктуреклеток. Фиксаторыобладают различнойскоростьюпроникновенияв ткань: от этогозависит возможнаявеличина объектаисследования.Так, четырехокисьосмия и глутаровыйальдегид проникаютв ткань на 0,1-0,5 ммпримерно за1 — 1,5 часа, но длянекоторыхтканей ономожет бытьувеличено до4 часов или до20-30 мин. В отдельныхслучаях допускаетсяв течение однихсуток. Наибольшеераспространениеполучила фиксацияматериала вглутаровомальдегиде споследующейдофиксациейв четырехокиси осмия. Глутаровыйальдегид лучше, чем четырехокисьосмия фиксируетбелки, но хужестабилизируетлипиды, что иобуславливаетиспользованияобоих фиксаторовкак дополняющихдруг друга.
Для избирательнойфиксации отдельныхсубклеточныхструктур используютболее специфическиефиксаторы(перманганаткалия, двухромовокислыйкалий и др.).Качество фиксациив значительнойстепени зависитот рН и осмотическогодавления фиксирующегораствора. Оптимальнымявляется рН7,2-7,4, что соответствуетфизиологическимпараметрам.Поэтому применяютбуферные растворы.Чаще применяютфосфатные иликакодилатныйбуферы. Физиологическоеосмотическоедавление создаютпутем добавленияосмотическиактивных веществ, например сахарозыили некоторыхсолей.
Имеетсянесколькометодов химическойфиксации: перфузионный, когда фиксаторвводят в токкрови, фиксацияна месте, когдафиксатор вводятв ткань до ееиссечения, метод погруженияиссеченныхкусочков тканив фиксатор. Длязамедленияаутолитическихпроцессов, протекающихв иссеченныхкусочков тканидо полной ихфиксации, последнююпроводят притемпературе2-5 градусов.
После фиксациинеобходимоосуществитьобезвоживаниеткани. Этотпроцесс долженбыть относительнобыстрым, постепенными вместе с темобеспечитьмаксимальнополное удалениеводы из образца, что достигаетсяпроведениемподлежащейисследованиюткани черезбатарею спиртовили ацетоноввосходящейконцентрации(от 30 до 100%) в течениеодного часа.
Следующимважным этапомподготовкиматериала дляЭМ являетсязаливка (заключение)тканей в заливочныесреды с цельюполученияблока, обладающегооптимальнымсочетаниемтвердости иэластичности, позволяющимприготовитьтонкий срезткани (толщинойне менее 100 нм), через которыйможет пройтиэлектронныйлуч. Первымизаливочнымиматериаламибыли метилметакрилати бутилметакрилат.В настоящеевремя они почтине применяются, т.к. токсичныи легко возгоняютсяпод пучкомэлектронов, что приводитк выраженнымартефактами загрязнениюэлектронногомикроскопа.Наиболее широкодля заливкитканей используютэпоксидныесмолы, в основномаралдит и эпон, часто применяемыесовместно.Менее распространеныполиэфирныесмолы (вестопал), водорастворимыезаливочныесмеси, из которыхчаще пользуются гликольметакрилатоми дуркупаном.Однако, не одназаливочнаясреда не являетсяхимическиинертной и вкакой-то степениоказываетвлияние наткань: этонеобходимоучитывать приинтерпретациирезультатовмикрокопирования.
В последниегоды широкоеприменениенашла заливкав так называемыекомпаунды, т.е.в смесь определенныхвеществ: основу(мономера), отвердителя, придающегообразующемусяполимеру прочностьи твердость, пластификатора, обеспечивающегоэластичностьи упругостьполимера, инициатора, диссациирующегос образованиемсвободныхрадикалов, ускорителя, который, взаимодействуяс мономером, освобождаетактивныедополнительныерадикалы, икатализатора, способствующегоначалу реакцииполимеризации.В практикеобычно используюткомпаунд, состоящийиз основы, отвердителя, пластификатораи катализатора, роль которогоможет игратьускорительили инициатор.Имеется достаточнобольшое количествоспособов пропиткиткани заливочнымисредствами.Процесс пропиткиобычно протекаетпри комнатнойтемпературеили в термостатепри температуре30˚ в течение 48часов. Затемкусочки тканипереносят вмаркированныежелатиновыекапсулы илиспециальныеформы, наполненныезаливочнойсмесью. Дляполимеризациисмеси капсулына 48 часов помещаютв термостатпри температуре60˚. В результатеполимеризацииобразуетсяблок, обладающийсоответствующимисвойствами.
Для полученияультратонкихсрезов толщиной30-50 нм используютсястеклянныеили алмазныеножи. Алмазныеножи долговечнеестеклянных, но из-за высокойстоимости онине получилиширокогораспространения.
К заднейстороне ножаприкрепляютспециальнуюванночку иустанавливаютна ультратом, в ванночкуналивают 10% растворэтиловогоспирта и 10% растворацетона надистиллированнойводе. В подвижномдержателеультратомазакрепляютблок с тканью.Резка блокаосуществляетсяза счет поступательногодвижения стержнядержателя, аподъем и опусканиедержателяотносительнорежущей кромкиножа обеспечиваютсяэлектроннойсхемой. Обычнов начале изготовляюттак называемыетонкие срезытолщиной 1 мкм, изучая которые, выбирают интересующийисследователяучасток. Сориентируясоответствующимобразом полутонкийсрез и блок, проводят заточкублока с такимрасчетом, чтобына вершинеобразовавшийсяпирамиды находилсянеобходимыйучасток. Затемизготовляютультратонкиесрезы толщиной30-50 нм. Из ванночкисрезы переносятна металлическиесетки.
Для констатированиясрезов применяютвещества сбольшим атомнымвесом, такиекак соли тяжелыхметаллов, естественнорассеивающиеэлектроны. Ионынекоторых изэтих веществмогут образовыватьсвязи с кислородоми присоединятсяк фосфатнымгруппам нуклеиновыхкислот. Другие, особенноуранилацетат, помимо этого, действуют какуниверсальныекрасители.Свинец связываетсяс комплексамиткани и осмиевымифакторами.Обычно проводятконтрастированиеультратонкихсрезов илисочетаютконтрастированиекусочков иультратонкихсрезов ткани, после чегоизучают в электронноммикроскопе.
Химическиеметоды фиксациии заливки материалаимеют ряднедостатков.Так, при ихиспользованиипроисходятхимическиеизменениямакромолекулярнойструктурыклеток: прификсации иобезвоживанииклеток и тканитеряют некоторыевещества: привзаимодействииткани, фиксатораи заливочнойсреды можетменяться локализациявнутриклеточныхструктур. Поэтомуинтенсивноразрабатываютсяфизическиеметоды приготовленияткани для ЭМи особенногистохимиии цитохимии.Большая частьэтих методовоснована наочень быстромзамораживаниикусочков ткани.
При использованииметода замораживания-высушиваниякусочки тканипомещают вхладагенты(пропан, изопентанили фреон), охлажденныедо -150˚, и в клеткахмгновеннопрекращаютсяобменные процессы.При этом в тканине успеваютобразовыватьсякристаллы льда, и поэтомусубклеточныеструктуры неразрушаются, а вода переходитв стекловидноесостояние.Затем в высокомвакууме (10-6–10-7 ммрт.ст.) происходитсублимация, после чего вткани специальнымобразом заливаютзамороженныеметакрилаты, аралдит иливестопал В.Однако, не всегдаудается достаточнобыстро равномернозаморозитьткань, а, следовательно, полностьюизбежать образованиякристалловльда, которыепри повышениетемпературыповреждаютвнутриклеточныеструктуры.Возникают идругие трудности, приводящиек появлениюартефактов.Поэтому, чащеприменяютразновидностьэтого метода: замораживание-замещение.После замораживанияводу, перешедшуюв стекловидноесостояние, удаляют, помещаяткань в обезвоживающиевещества принизкой температуре.В этих условияхспирт и ацетонмало влияютна структуруклеток. Методкриоскалывания(замораживание-травление)позволяетизбежатьвозникновенияхимическойреакции приобработкетканей. Фрагментытканей замораживаютв хладагентесо скоростьюпревышающей1000˚ в 1 с. Объектпомещают ввакуумнуюкамеру и темили иным способомраскалываютили разрывают.На поверхностискола наносятплатиноуглеродноепокрытие (реплику).Затем репликуочищают оторганическихостатков врастворе сильногоокислителя, промывают вводе и помещаютна сеточку дляэлектронноймикроскопии.
Для исследованийповерхностибиологическихтканей используюти метод оттенения.Наибольшеераспространениеполучил методприготовленияреплик путемнапыления ввакуумнойкамере углеродана поверхностьобразца тканей.Для контрастированияобразовавшейсяреплики на неепод острымуглом напыляютэлектронно-плотныевещества (платинуили платиноиридиевый сплав). При этомколичествоатомов металлазначительнобольше, на тойстороне контуровобразца, котораяближе к источникунапыления: приисследованиив электронноммикроскопеона выглядитнеконтрастной.Противоположнаяповерхностьконтура имеетмало атомовметалла: вэлектронноммикроскопеона контрастнаи как бы оттеняетнеконтрастнуюповерхностьконтура. Методотраженияпозволяетрассчитатьвысоту контуровисследуемогообъекта, таккак известенугол напыления, длина тени иувеличения, при котором производилосьфотографированиереплики в электронноммикроскопе.
Для изученияповерхностиизолированныхклеток и тканейслужит сканирующая(растровая) ЭМ.Одним из основныхусловиемприготовленияобъекта длясканирующейЭМ являетсянеобходимостьсохранениясоответствующегоповерхностногонатяженияклеток во избежаниеих деформации.Поверхностьизучаемой тканипромываютсбалансированными изотоническимизабуференнымисолевыми растворамиили безбелковымикультуральнымисредами с рН7,3-7,4, подогретымидо температуры37˚. Для фиксацииобычно применяютизотоническийраствор глутаровоальдегидас последующейдофиксациейчетырехокисьюосмия. Тканьобезвоживаютв спиртах илиацетонах, азатем высушиваютметодамизамораживания-высушиванияили переходакритическойточки. Последнийоснован наиспользованиитакого физическогоявления каквозникновениепри определенныхусловиях критическогосостоянияравновесияпара и жидкости.При этом методеткань оказываетсяв газовой среде(т.е. высушенной), что позволяетизбежатьповреждающегодействияповерхностногонатяжения. Длядостижениявысоких степенейразрешенияповышаютэлектропроводностьобъекта, напыляяна него тяжелыеметаллы: золото, платину, сереброили их сплавы.
Применяетсятакже методионной бомбардировкив вакууме пластинкиметалла ионамиинертного газа.«Выбитые» атомыметалла оседаютна поверхностиобъекта исследования.Для выявлениявнутритканевыхи внутриклеточныхструктур применяютмеханические, термические, химическиеи другие методы.
Для ЭМ микробовприменяютсходные методыс учетом строениямикробов ихразмеров, осмотическогодавления и др.Особый подходосуществляетсяпри ЭМ вирусов.Изучение структурвирусов затрудненоиз-за малыхразмеров ислабой рассеивающейспособностивириона. Напервых этапахЭМ вирусов этатрудностьпреодолеваласьоттененениемчастиц прииспарениитяжелых металловв вакууме. Вплотьдо конца 50-ыхгодов 20 векаметодика оттенениявирусных частицбыла основнойпри изучениивирусов в суспензиях.Чаще для этойметодики использовалиуран 238, платину, палладий илисплавы платиныс палладием.Наибольшеераспространениеполучил сплавплатины с палладиемв соотношении4:1. Зная заданныйугол оттенения, по длине образующейсятени определяютвысоту вируснойчастицы и еедиаметр. Оттенениеметалламиисследуемогообъекта присочетании скриогеннымиметодиками(замораживание-высушивание)позволяетполучить важнуюинформациюпри изученииструктурывириона изометрическихвирусов.
Широкоераспространениеполучила методиканегативногоконтрастированиявирусов с помощьювольфрамофосфорнойкислоты (Н3РW12О40), которая приподщелачиванииедким калиемили едким натрием(от значениярН 2,0 до рН 7,0) изменяетсяи после нанесенияпрепарата навирус создаетзону высокогорассеиванияэлектронов, в результатечего выявляютсяморфологическиепризнаки вируса.
Развитиюзнаний о структуревириона способствоваликриогенныеметодики. Одиниз простейшихвариантов такихметодик заключаетсяв следующем: сетки с подложкойи находящимисяна них вирусамипосле нанесенияконтрастирующегораствора помещаютв сжиженныйпропан (температура-150˚) или переохлажденныйазот (температура-200˚). Дальнейшеевысушиваниеобразца притемпературе-100˚ в глубокомвакууме способствуетсохранениютрехмернойорганизациивириона. Исключениев этих условияхдеформирующейроли сил поверхностногонатяжения водыпривело к пересмотруточки зрения, что форма вирионау липидосодержащихвирусов обладаетвысокой лабильностью.Более сложныекриогенныеметодики, применяемыев электронноймикроскопии(например, криоскалывание), также внеслизаметный вкладв развитиепредставленийо структуревирионов, особеннооб имеющихлипопротеиднуюоболочку.
Структурагенома вирусовизучается спомощью модифицированнойв 1959 году Клейштейноми Лангом методикиоттенениялинейных макромолекултяжелыми металлами, которые испаряютсяс В-образнымкатодов подуглом в 5-10˚.
Условием, позволяющимизучить нуклеиновыекислоты, и особеннооднонические(поперечныйразмер 1-1,1 нм), является связываниеих с основнымибелками, т.к.при этом образующийсянуклеопротеидимеет диаметрдо 18 нм в двунитчатыхструктурахи до 15 нм – воднонитчатых.В качестветакого белкачаще используютцитохром С.Помещеннаяна подложкунуклеиноваякислота в белковомчехле имеетсамый причудливыйконтур, и возможностьувидеть ее навсем протяженииосуществиматолько в томслучае, есливо время оттененияметаллами будетсовершен хотябы один поворотсетки с объектомдля напыленияна 360˚. Лучшиерезультатыдостигаютсяпри длительномоттенении (до10 минут) сплавомплатины с палладиеми многократномповорачиваниинапыленнойсетки на вращающемсястолике.
Многочисленныемодификацииметодики Клейшмидтаи Ланга позволяютполучать данныене только одлине генома, но изучать истепень гомологиигенома различныхвирусов, локализоватьвставку тогоили иного гена в состав гибридныхмолекул, исследоватьгибридныемолекулы нуклеиновыхкислот.
Общая информацияо морфогенезевирусов полученас помощьюультратонкихсрезов вирусов.Техника полученияультратонкихсрезов вирусовне отличаетсяот общепринятой.
В последниегоды возрастаетудельный весЭМ как экспресс-методаили диагностикивирусных инфекций.Особенно великароль методаиммунной микроскопии, позволяющегоустановитьродовую принадлежностьвируса.
ИммуннаяЭМ сыграларешающую рольна первых этапахисследованияинфекционногогепатита (гепатитаА), а также вирусныхгастроэнтеритови внесла существенныйвклад в изучениегепатита В.
Теоретическиеосновы иммуноморфологиина светооптическомуровне разработаныв 1942 году Кунсомс сотрудниками, которые впервыепоказали, чтов молекулуантитела можноввести некоторыевещества, ненарушая существенноих специфичности.Развитие этойидеи позволилов 1959 году Зингеруразработатьиммунноморфологический метод наэлектронномикроскопическомуровне, основанныйна использованиеантител, меченныхферритином.Ферритин-белокс высоким содержаниемжелеза, в котороматомы металлаорганизованныв 4 субъединицы, расположеныблизко другк другу, чтообеспечиваетвысокое рассеиваниеэлектроновпри ЭМ и четкоевыявлениемолекулы.
Конъюгациябелка с антителомвозможна спомощью различныхбифункциональныхагентов, наибольшеераспространениесреди которыхполучили3,4-толуендиизоцианати ксиленметадиизоцеанат.Иммунная электроннаямикроскопияс помощью антител, меченных ферритином, эффективнадля выявленияэкстрацеллярныхантигеновмикробов винфицированныхтканях, в томчисле вирусныхантигенов наповерхностиклетки, а такжеповерхностныхантигенов вклетке. Вместес тем эта методикав ряде случаевнеэффективна, например, еслинеобходимоисследоватьвнутриклеточныеобъекты, антигенымикробов внутриклетки, чтоимеет место, в первую очередь, при вирусныхинфекциях. Этообусловленотем, что молекулярныйвес (масса) антител, меченных ферритином, около 800 тыс., ипоэтому проихождениеих через плазматическуюмембрану клеткиневозможно, а антитела, меченные ферритином, проникшие черезнее путем эндоцитозане вступаютв контакт соспецифическимантигеном.Поэтому основнаямасса исследований, связанная свыявлениемвнутриклеточныхантигенов спомощью антител, меченных ферритином, выполнена приразрушенииплазматическоймембраны путейзамораживания-оттаиванияили обработкикомплиментом.Замена ферритинанизкомолекулярнымисоединениями, содержащимиртуть, йод, ненашла широкогопримененияиз-за низкойспецифичностиметода.
С конца 60-ыхгодов 20-го векав иммунологииприменяетсяиммуннопероксидазнаяметодика ЭМдля обнаруженияантигеноввнутри и наповерхностиклеток. Перексидаза, используемаядля метки антител, позволяетполучить наилучшийэффект по сравнениюс другими ферментами(фосфотазы, некоторыеоксидазы) благодаряболее низкомумолекулярномувесу (около 40тыс) и устойчивостик различнымгистологическимпроцедурам.Антитела, меченныепероксидазой, проникают вклетку и связываютсяс гомологичнымантигеном.Конъюгированиеантител с ферментомосуществляетсярядом бифункциональныхагентов, средикоторых наиболеедоступнымявляется глутаровыйальдегид. Послетого как произошласвязь антителас соответствующимантигеном, локализацияфермента выявляетсяпосле контактаего с соответствующимсубстратом– бензидином, а-нафтолом, смесью а-нафтола, с р-ферментом.В присутствииперекиси водородаобразуетсяпродукт с болеевыраженнойрассеивающейспособностьюэлектроновпо сравнениюс окружающимиструктурами.