Реферат: Національна Академія Наук України Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна реферат

Національна Академія Наук України

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна


Реферат


Епігенетичні основи і причини взаємозв’язку диференціації клітин, канцерогенезу та старіння


Галицький Володимир Адамович

кандидат біологічних наук,

науковий співробітник

відділу молекулярної імунології

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України


Київ – 2010

Реферат циклу праць

“Епігенетичні основи і причини взаємозв’язку

диференціації клітин, канцерогенезу та старіння”
^ Мета роботи
Метою дослідження було встановлення загальних принципів будови і функціонування генної мережі диференціації клітин, зокрема розкриття можливої участі мікроРНК у ній, з’ясування причин взаємозалежності порушень диференціації клітин, пухлинного росту та старіння.
^ Наукова новизна
1. Вперше запропоновано, що модулі генів (окремі елементарні функціональні одиниці, з яких повинна складатися генна мережа клітинної диференціації) керуються позитивним зворотнім зв’язком та відповідають кожен за свій окремий етап певного напрямку диференціації клітини за принципом “один етап диференціації – один модуль генів”, а еволюційною передумовою виникнення даної мережі було вбудовування сайтів транскрипційних факторів у регуляторні ділянки генів завдяки механізмам рекомбінації.

2.  Вперше виявлено, що в інтерферуючих РНК (RNAi), а саме коротких інтерферуючих РНК (siRNA) та мікроРНК (miRNA) кількість динуклеотидів 5’-CG-3’ та тринуклеотидів 5’-CNG-3’ набагато перевищує випадковий рівень, а частка інтерферуючих РНК, цілковито позбавлених даних сайтів, становить лише 15-20%. Ці дані підтвердили висунуту автором, також вперше, гіпотезу про метилювання ДНК de novo, обумовлене комплементарним зв’язуванням RNAi з ДНК, що повинне мати місце при транскрипційному сайленсингу та алельному виключенні.

3. Вперше отримано вказівки, що репресією гена мікроРНК miR-181 може визначатись перехід лімфоцитів на стадію зрілих В-клітин. Вперше показано, що інактивація рекомбіназ Rag1 та Rag2 у дозріваючих лімфоїдних клітин може бути обумовлена сайленсингом матричної РНК (мРНК) фактора Foxp1 через вплив мікроРНК miR-181 та miR-150.

4. Вперше запропоновано, що ініціатором алельного виключення генів виступає молекула miRNA, котра утворюється в ході процесингу некодуючого транскрипта алелів та зв’язується з комплементарною ділянкою їх ДНК, викликаючи нанесення епігенетичних маркерів репресії. Вперше запропоновано, що наявність miRNA необхідна для реставрації втраченої епігенетичної інформації та транскрипційного сайленсингу множинних копій мобільних елементів геному, задля чого у процесі еволюції і виникло явище алельного виключення.

5. Вперше висловлено ідею, що репресія генів окремих miRNA, будучи необхідною для диференціації клітин, в той же час веде до поступової втрати епігенетичних маркерів репресії ДНК і, з віком, до дерепресії дрімаючих транспозонів; внаслідок викликаної ними дестабілізації геному більшість клітин гине (що і обумовлює старіння як явище), при цьому окремі клітини зазнають злоякісної трансформації, тим самим пов’язуючи старіння і вікове зростання онкозахворюваності.

6. Вперше запропоновано, ухилення клітин від подальшої диференціації внаслідок неактивності відповідальної за неї групи генів – через відсутність цитокінів або несанкціоновану присутність комплементарної miRNA – є однією з необхідних умов успішного канцерогенезу.
^ Практична значимість
Отримані результати мають фундаментальне значення. Створено єдину картину будови і функціонування генної мережі клітинної диференціації, участі miRNA у ній, передумов і механізмів старіння та пухлинного росту, пояснено, яким чином здійснюється вибір напрямку спеціалізації дозріваючої клітини та якими молекулярними механізмами забезпечується стійкість обраної клітиною спеціалізації. Запропоновані гіпотези про опосередковані інтерферуючими РНК механізми транскрипційного сайленсингу, алельного виключення та реставрації епігенетичної інформації доповнюють сучасні уявлення про загальні принципи регуляції експресії генів, розкривають можливе еволюційне походження і первинну біологічну роль системи клітинних miRNA. Проаналізовано також імовірне еволюційне походження генної мережі диференціації клітин та роль у даному процесі мобільних елементів геному в контексті появи феномену багатоклітинності, що теж має загально-біологічне і, зрештою, світоглядне значення.

Запропоновані ідеї отримали підтвердження при розгляді молекулярних основ диференціації лімфоїдних клітин, тому можна сподіватись, що вони також сприятимуть пошуку компонентів генних мереж, відповідальних за інші напрямки та етапи диференціації клітин організму. У більш віддаленій перспективі висловлені ідеї можуть бути використані при створенні методів управління напрямком та рівнем диференціації клітин, що дозволять керувати регенерацією уражених тканин і органів, викликати нормалізацію пухлинних клітин та запобігати старінню.


^ Загальна кількість публікацій – 77, з них статей – 13. Кількість публікацій за темою роботи – 56, з них статей – 11, в тому числі у міжнародних журналах, що містяться у базі даних SCOPUS – 5. Реферовано 5 основних статей, 1 тези.

Публікації були об’єднані у цикл, оскільки висловлені у них модульний та ієрархічний принципи будови генної мережі клітинної диференціації створювали єдину картину її структури і функціонування, що отримала підтвердження при подальшій реконструкції генної мережі лімфопоезу. Оскільки запропоновані ідеї прямо вказували на імовірний механізм старіння (як наслідок вікової дерепресії транспозонів, спричиненої репресією окремих miRNA при спеціалізації клітин) та формування пухлин (як наслідок ухилення клітин від продовження диференціації внаслідок неактивності відповідальних за нього груп генів), що ілюструвало передбачувальну силу запропонованої гіпотези про модульну архітектоніку генної мережі клітинної диференціації, детальний розгляд взаємовідносин диференціації клітин, старіння і канцерогенезу та участі у miRNA у них і еволюційних причин цієї участі був проведений у кількох взаємозв’язаних публікаціях, які і становлять цикл.

h-індекс (індекс Хірша) цитування праць становить 1, згідно баз даних SCOPUS та eLIBRARY.RU. Індикатор SJR становить 0,036 для журналу "Цитология", 0,029 для журналу "Вопросы онкологии", 0,029 для Українського біохімічного журналу та 0,039 для журналу "Cell and Tissue Biology", у яких опубліковані основні статті.
^ Основний зміст роботи Будова та принципи функціонування генної мережі диференціації клітин
Відповідно до запропонованої автором гіпотези про модульну будову генної мережі диференціації клітин, здійснення кожного окремого етапу певного напрямку клітинної диференціації відбувається внаслідок діяльності відповідної даному напрямку та етапу генної групи – модуля генів (рис. 1). Експресія всіх генів одного і того самого модуля узгоджено координується активністю одного з них – гена-активатора, білок якого є транскрипційним фактором, здатним підтримувати експресію власного гена за принципом позитивного зворотного зв’язку, а також експресію усіх інших генів модуля, таким чином визначаючи їх належність до даного, але не іншого генного угрупування [Галицький, 1998; Галицкий, 2001].






Рис. 1. Будова модуля генів та механізм вибору клітиною одного з можливих напрямків наступного етапу диференціації.


Поряд із геном-активатором, до складу окремого модуля повинні входити диференціюючі гени, білки яких забезпечують клітині реалізацію обраного напрямку диференціації і набуття відповідної спеціалізації, та контролюючі гени, покликані репресувати ключові гени модулів пройдених або альтернативних етапів диференціації клітини, а також нівелювати репресивний вплив окремих клітинних елементів, який останні (зокрема miRNA – див. далі) чинять на гени, що належать даному модулю. У ряді випадків, можливо, в якості контролюючих генів теж виступають гени miRNA. Завдяки метилюванню ДНК та ремоделюванню хроматину сайленсинг, ініційований впливом контролюючих генів, може підтримуватись тривалий час, не вимагаючи збереження їх активності на подальших етапах та стадіях дозрівання клітини.

Вибір напрямку подальшої диференціації клітини після завершення кожного чергового етапу визначається активацією відповідного модуля генів під впливом сигналу, що генерується рецепторами цитокінів. Гени згаданих рецепторів, а також гени компонентів сигнальних каскадів, відповідальних за перенесення у клітині сигналів даних рецепторів, повинні входити як звичайні диференціюючі гени до складу модуля, який діє в клітині (чим і обмежується коло вибору напрямків її подальшої диференціації). Кожний рецептор активується специфічним йому цитокіном, і через відповідну тільки йому сигнальну молекулу (або їх каскад) активує експресію того з генів-активаторів модулів наступного етапу спеціалізації клітини, котрий несе сайт зв’язування цієї сигнальної молекули (рис. 1).

На погляд автора, нові напрямки та етапи диференціації у процесі еволюції з’являлись із появою у клітині нових модулів генів внаслідок вбудовування сайтів транскрипційних факторів – при допомозі, ймовірно, транспозонів – у регуляторні області генів, що носило характер, аналогічний вбудовуванню ділянок ДНК, кодуючих окремі домени білків, у структурні області генів. Очевидно, природній відбір закріплював найбільш оптимальні комбінації генів у модулях, при цьому до складу окремого модуля могли з часом входити й інші гени, якщо вони отримували сайт зв’язування білка гена-активатора даного модуля. Взаємовиключний характер експресії модулів генів (модульне виключення) встановився, імовірно, у результаті вбудовування сайтів транскрипційних репресорів, гени котрих підконтрольні одним модулям, у регуляторні області ключових генів альтернативних їм модулів та закріплення цих змін відбором. Таким чином, модульний та ієрархічний принципи будови генної мережі диференціації клітин відображають її еволюційне минуле.

Дані ідеї була висловлені та опубліковані раніше, аніж висновок Hartwell et al., 1999, що генні мережі клітин складаються з функціональних модулів, та висновок Wolpert et al., 2002, що регуляція за принципом зворотного зв’язку є головним механізмом підтримання стабільності клітинної спеціалізації. До того ж, запропоновані ідеї відразу розкривали механізм поєднання окремих модулів генів у глобальну мережу, в той час як це питання у працях інших авторів залишається неясним дотепер; більше того, висловлена гіпотеза відразу ставила акцент на можливості виникнення пухлин внаслідок неактивності даного механізму.
^ Реконструкція генної мережі лімфопоезу
Як і очікувалось, генна мережа диференціації лімфоїдних клітин виявилась складеною з окремих модулів, експресія генів-активаторів яких самопідтримується завдяки наявності однієї чи кількох петель позитивного зворотного зв’язку. Наприклад, так забезпечується активність генів транскрипційних факторів T-bet та GATA-3, що координують, відповідно, експресію модулів Th1- та Th2-спеціалізації CD4+-клітин (рис. 2). Підтвердилась й ідея, що напрямок подальшого дозрівання визначається цитокіном, який, зв’язуючись з рецепторами клітини, викликає активізацію відповідального за даний напрямок модуля генів. Зокрема, сигналами, що ініціюють увімкнення Th1- або Th2-програми спеціалізації, є, відповідно, інтерферон- (IFN) або інтерлейкін-4 (IL-4). Їх взаємодія з рецепторами активує гени транскрипційних факторів T-bet або GATA-3 при допомозі сигнальних молекул STAT1 або STAT6, відповідно. Також модуль генів, що виявляється активованим, прямо репресує модуль, відповідальний за альтернативний напрямок спеціалізації, чим досягається запропонований принцип “один етап диференціації – один модуль генів” (рис. 2) [Галицький та співавт, 2007].

Завдяки позитивному зворотному зв’язку підтримується і експресія гена транскрипційного фактора EBF1, що контролює відрізок шляху диференціації від стадії пре/проВ-клітин до стадії зрілих B-клітин. Це дає підстави вважати вказаний відрізок єдиним етапом В-лімфопоезу; його початкова стадія (пре/проВ-клітин) здійснюється одноосібно модулем генів, відповідальним за даний етап загалом, а наступні – субмодулями, функціонування яких координується білком Pax5, та іншими залежними від нього транскрипційними факторами. Показово, що гени Pax5 та EBF1 підтримують експресію один одного [Галицький та співавт, 2007].

Привертають увагу виявлені автором in silico в 3’-нетрансльованій ділянці (3’-UTR) мРНК гена Foxp1 висококонсервативний сайт зв’язування мікроРНК miR-181 типу 7mer-m8 та консервативний сайт зв’язування miR-150, теж типу 7mer-m8. Експресія miR-181, як відомо, проявляється вже у недиференційованих клітинах у кістковому мозку і підвищується у В-клітинах (у зрілих В-лімфоцитах вона припиняється), а експресія miR-150 знаходиться на високому рівні у зрілих Т- та В-лімфоцитах. Оскільки активність генів рекомбіназ Rag1 та Rag2 залежить від наявності фактора Foxp1, це дозволяє автору припустити, що їх тимчасова інактивація на стадії преВІ-клітин обумовлена сайленсингом мРНК фактора Foxp1 через вплив miR-181 за відсутності активної експресії гена, викликаної тимчасовим зникненням сигналу від рецептора інтерлейкіну-7 (IL-7). Даний механізм може відігравати важливу роль у перенацілюванні активності рекомбіназ з локусів гена важкого імуноглобулінового ланцюга на локуси генів легкого ланцюга. Остаточна інактивація генів рекомбіназ у зрілих В-лімфоцитів обумовлена, на погляд автора, в т.ч. і сайленсингом мРНК фактора Foxp1 через вплив miR-150. [Галицький та с
півавт, 2009].


Рис. 2. Реконструкція генної мережі завершального етапу CD4+-спеціалізації (IL12-R – рецептор інтерлейкіну-12, IL18-R рецептор інтерлейкіну-18).


Загалом, наявні у незрілих клітинах miRNA відіграють роль інгібіторів диференціації, викликаючи, принаймні на посттранскрипційному рівні, сайленсинг генів, що забезпечують дозрівання клітин. Зокрема автором було виявлено у 3’-UTR-ділянці мРНК генів факторів Bcl6 та MITF, відповідальних за стадію зрілих В-лімфоцитів, висококонсервативний сайт зв’язування мікроРНК miR-181 типу 7mer-1A. Тому молекулярною основою переходу клітини на зазначену стадію є репресія гена даної miRNA, внаслідок якої стає можливою експресія генів Bcl6 та MITF. Було виявлено також висококонсервативний сайт miR-223 типу 7mer-m8 у 3’-UTR-ділянці мРНК гена prdm1, котрий кодує ключовий фактор етапу плазмоцитів – білок Blimp1 [Галицький та співавт, 2009].
^ Механізм RNAi-залежного метилювання ДНК de novo й алельного виключення
У результаті аналізу баз даних “siRNA Database and Resources for RNA Interference Studies”та miRBase було встановлено, що сайти 5’-CG-3’ та 5’-CNG-3’ у досліджених послідовностях siRNA та miRNA достовірно (p0,05) виявляються частіше, ніж повинні були б зустрічатися у випадковій послідовності, а також, що лише п’ята частина miRNA і менше шостої частини siRNA повністю позбавлені даних сайтів [Галицкий, 2008]. При цьому біологічне значення має власне 5’-3’-порядок розташування цитозину та гуаніну в утворених ними ди- і тринуклеотидах, а не сама по собі присутність згаданих нуклеотидів у складі інтерферуючих РНК (RNAi), оскільки частота зустріваності динуклеотидів 5’-GC-3’ достовірно не відрізняється від випадкового рівня.

С
айти 5’-CG-3’ та 5’-CNG-3’ у складі RNAi необхідні для ініціації метилювання залишків цитозину у комплементарних сайтах ДНК. Для цього RNAi повинні сканувати нуклеотидну послідовність ланцюгів молекули ДНК під час її розплітання РНК-полімеразою II при транскрипції. Виявивши комплементарну ділянку ДНК, siRNA або miRNA зв’язується з нею і рекрутує клітинну ДНК-метилтрансферазу DNMT3, котра і метилює у ДНК de novo цитозин динуклеотидів 5’-CG-3’ та тринуклеотидів 5’-CNG-3’, що виявилися спареними з аналогічними сайтами у складі RNAi (рис. 3) [Галицкий, 2008]. У підсумку, ген, розпізнаний RNAi, зазнає транскрипційного сайленсингу внаслідок мічення хроматину маркерами репресії на всьому своєму протязі (рис. 3).


Рис. 3. Молекулярний механізм RNAi-залежного транскрипційного сайленсингу (DNMT3 – ДНК-метилтрансфераза 3, HDAC – гістон-деацетилаза, HMT – гістон-метилтрансфераза, СН3 – метильна група, СН3СО – ацетильна група).


Автор запропонував, що алельного виключення зазнають гени, в яких транскрибується як матричний, так і антипаралельний ланцюг ДНК, причому транскрипт одного з них є попередником miRNA. Тоді під час зчитування РНК-полімеразою одного з ланцюгів ДНК зріла форма згаданої miRNA отримує можливість сканувати послідовність іншого ланцюга, і, виявивши комплементарну собі ділянку, зв’язуватися з нею. Оскільки РНК-полімераза, транскрибуючи той чи інший ланцюг ДНК, повинна відокремлювати чи розщеплювати зв’язані з ним молекули miRNA, внаслідок чого вони можуть не встигати ініціювати та/або підтримувати вищезазначені зміни епігенетичних маркерів, автор припускає, що кількості miRNA, зчитаної тільки з одного алеля, не достатньо для його репресії de novo. Алельне виключення настає внаслідок того, що у клітині, де функціонує двоє чи більше алелів гена, концентрація зчитаної з них miRNA рано чи пізно досягає рівня, при якому РНК-полімераза не встигає відокремити miRNA, спарену з транскрибованим ланцюгом, до того як вона залучить ДНК-метилтрансферазу та ініціює нанесення метильної мітки на зв’язану ділянку ДНК, модифікування прилеглих гістонів і подальше ремоделювання хроматину (рис. 4) [Галицкий, 2008].





Рис. 4.  miRNA-залежне алельне виключення локусу гена імуноглобулінового ланцюга (алель 1 готовий до рекомбінації, алель 2 зазнає репресії).


Репресованим виявляється той алель, який менш активно звільняється від приєднаної miRNA, тобто слабкіше транскрибується. Важливо, що ініціюючий репресію поріг концентрації miRNA для кожного з алелів не є якоюсь стандартною величиною, а гнучко налаштовується, стаючи тим вищим, чим активніше транскрибується алель та швидше відділяються гібридизовані з останнім miRNA (рис. 4), завдяки чому алельне виключення може встановлюватися при будь-яких рівнях експресії генів, що його зазнають.

Алельне виключення локусів імуноглобулінових генів теж здійснюється, на думку автора, у запропонований спосіб. Імовірно, некодуючий транскрипт V-області (а вона перед реаранжуванням зазнає активної смислової та антисмислової транскрипції) і є попередником miRNA (рис. 4). У результаті зв’язування з цією miRNA ДНК в одному з локусів зазнає метилювання, яке поширюється на рекомбінаційні сигнальні послідовності (RSS). У свою чергу, метилювання ДНК, як відомо на сьогодні, прямо перешкоджає діяльності рекомбіназ, через що реаранжування стає можливим лише в одному з алельних локусів, і лише у випадку його невдачі – в іншому локусі [Галицький та співавт, 2009].

Первинне біологічне завдання системи клітинних miRNA полягало, на погляд автора, у захисті стабільності клітинного геному шляхом транскрипційного сайленсингу транспозонів та інших мобільних елементів геному завдяки вищезапропонованому механізму встановлення епігенетичних маркерів репресії та їх реставрації навіть у випадку повної втрати цих маркерів тою чи іншою ділянкою ДНК. Очевидно, клітини могли специфічно знижувати активність множинних копій транспозонів до мінімально можливого рівня, допускаючи транскрипцію максимум однієї з них та застосовуючи РНК, зчитану з неї і процесовану при допомозі ендонуклеаз Drosha та Dicer, для мічення усіх інших копій мітками репресії, окремим випадком чого і є алельне виключення [Галицкий, 2008]. А оскільки утворення нових генів та реаранжування їх регуляторних ділянок відбувались за участю транспозонів, через що присутність послідовностей останніх у складі тих чи інших генів виглядає закономірною, автор висловлює ідею, що наявний у стовбурових клітинах набір miRNA репресує гени, відповідальні за подальші етапи дозрівання, через те, що вони містять послідовності, схожі з послідовностями мобільних елементів геному. Тому диференціація, починаючи від найбільш ранніх стадій, повинна потребувати репресії генів окремих miRNA з числа наявних у клітині, про що йшла мова вище. При цьому експресія miRNA не відновлюється після завершення етапів спеціалізації, котрим вони заважали.

Внаслідок цього клітини повинні поволі втрачати маркери репресивного хроматину, що рано чи пізно це здатне привести до дерепресії певного числа дрімаючих транспозонів й інших мобільних елементів геному та лавиноподібного росту викликаних ними пошкоджень ДНК, що веде до активізації клітинних механізмів репарації ДНК, в т.ч. тих, які використовують процеси рекомбінації. На погляд автора, активність цих механізмів, а також, можливо, і транспозаз самих транспозонів, повинна викликати рекомбінації також і у структурах, що кепують теломери. При цьому має відбуватись замикання Т-петлі у кільце та, відповідно, вкорочення теломери на довжину втраченої ДНК. Зазначений процес може дуже швидко спричинити виснаження одної чи кількох найбільш доступних теломер. З віком все більше клітин долають поріг дерепресії транспозонів, і загибель більшості з них внаслідок ерозії теломер визначає старіння як явище, а виживання окремих клітин через спричинену нестабільністю геному трансформацію – взаємозв’язок старіння і вікового збільшення онкозахворюваності.

На відміну від взаємовиключних ідей про старіння як генетично запрограмований феномен, чи результат накопичення пошкоджень, запропонована гіпотеза включає в себе пояснення і здатності шкідливих факторів сприяти старінню (через активізацію механізмів репарації ДНК та викликані ними несанкціоновані рекомбінації у теломерах), і наявності певних генетично заданих рамок видової тривалості життя (у вигляді довжини теломер та механізмів, що викликають їх ерозію і впливають на її темп).
^ Ухилення дозріваючих клітин від диференціації як умова утворення пухлини
Згідно запропонованої автором чотирьохстадійної схеми канцерогенезу [Галицкий, 2003], поряд з появою у клітині несанкціонованих проліферативних і антиапоптозних сигналів в результаті трансформуючих змін клітинних онкогенів (перша стадія канцерогенезу – ініціація) та активізації онкогенів (друга стадія канцерогенезу – промоція) , повинне мати місце і ухилення трансформованої клітини від подальшої диференціації (третя стадія канцерогенезу). У подальшому трансформована клітина збільшує свій онкогенний потенціал, реактивуючи теломеразу, репресуючи антипроліферативні елементи сигнальних каскадів, протидіючи факторам імунобіологічного нагляду, набуваючи здатності синтезувати ангіогени і мотогени (четверта стадія канцерогенезу – пухлинна прогресія).

Однією з молекулярних основ ухилення клітин від спеціалізації є відносний чи абсолютний дефіцит цитокінів, необхідних для активізації модулів генів, відповідальних за подальші стадії дозрівання. Дефіцит цитокінів виникає внаслідок атрофічних процесів, в т.ч. старіння, при аномальній локалізації клітин, на границі двох різних тканин. Будь-який атрофічний і циротичний процес проявляє тенденцію до самопідсилення внаслідок утворення хибного кола наростання аномалій у поширенні та розподілі цитокінів в ураженій тканині та обумовлюваного цим апоптозу все нових нормальних клітин, залежних від даних цитокінів. У результаті ймовірність неотримання якою-небудь трансформованою клітиною даної тканини цитокінів, необхідних для продовження диференціації, з плином часу збільшується, що означає постійне зростання ризику виникнення пухлинного процесу [Галицкий, 2003].

Іншою причиною припинення дозрівання трансформованих клітин може бути несанкціонована активізація або збереження експресії однієї чи кількох miRNA з числа відповідальних за пригнічення спеціалізації клітин, імовірно, внаслідок рекомбінації їх генів з неналежними регуляторними послідовностями або інактивації механізмів, які в нормі повинні викликати репресію даних генів. У результаті продовження диференціації трансформованих клітин стає або ускладненим, потребуючи впливу високих концентрацій необхідних цитокінів, або взагалі неможливим.
Висновки
У результаті проведеної роботи вдалось вперше створити єдину картину діяльності механізмів диференціації клітин, наслідків їх неправильного функціонування, а також еволюції даних механізмів. Основні положення запропонованої гіпотези викладені у наступних висновках:

1. Генна мережа диференціації клітин складається з окремих елементарних функціональних одиниць – модулів генів, керованих позитивним зворотнім зв’язком і відповідальних кожен за свій окремий етап певного напрямку диференціації клітини за принципом “один етап диференціації – один модуль генів”. Еволюційною передумовою виникнення даної мережі було вбудовування сайтів транскрипційних факторів у регуляторні ділянки генів завдяки механізмам рекомбінації.

2. Реконструйована автором структура генної мережі лімфопоезу відповідає структурі, очікуваній у рамках гіпотези про будову генної мережі диференціації клітин. Одним з перших регуляторних рівнів при диференціації клітин є зміна спектру наявних у них мікроРНК, внаслідок якої уможливлюється експресія генів, відповідальних за процеси спеціалізації. Зокрема, молекулярною основою переходу лімфоцитів на стадію незрілих/зрілих В-клітин є припинення експресії гена мікроРНК miR-181.

3. Кількість динуклеотидів 5’-CG-3’ та тринуклеотидів 5’-CNG-3’ у інтерферуючих РНК достовірно перевищує випадкову, а частка інтерферуючих РНК, цілковито позбавлених зазначених сайтів, становить лише 15-20%. Ці дані підтвердили висунуту автором гіпотезу про метилювання ДНК de novo, обумовлене комплементарним зв’язуванням інтерферуючих РНК з ДНК, що повинне мати місце при транскрипційному сайленсингу та алельному виключенні.

4. Алельне виключення генів досягається через мічення одного з алелів епігенетичними маркерами репресії, ініціатором чого виступає молекула мікроРНК, котра утворюється в результаті процесингу некодуючого транскрипта алелів та зв’язується з їх ДНК. Алельне виключення виникло в процесі еволюції з метою репресії множинних копій мобільних елементів геному. Реставрація втраченої епігенетичної інформації та необмежений за тривалістю сайленсинг транспозонів забезпечуються метилюванням ДНК de novo, що ініціюється набором наявних у недиференційованих клітинах інтерферуючих РНК.

5. Репресія генів окремих мікроРНК, будучи необхідною для диференціації клітин, в той же час може вести до поступової втрати епігенетичних маркерів репресії ДНК і, з віком, до дерепресії дрімаючих транспозонів. Внаслідок викликаної останніми дестабілізації геному більшість клітин гине, що і викликає старіння як явище, при цьому окремі клітини зазнають злоякісної трансформації, тим самим пов’язуючи старіння і вікове зростання онкозахворюваності – явищ, які, з іншої сторони, є побічним ефектом діяльності генної мережі диференціації клітин.

6. Ухилення дозріваючих клітин від подальшої диференціації внаслідок неактивності відповідальної за неї групи генів – через відсутність цитокінів або несанкціоновану присутність комплементарної мікроРНК – є однією з необхідних умов успішного канцерогенезу. Оскільки старіння супроводжується наростаючим дефіцитом цитокінів, цим обумовлюється ще одна причина взаємозв’язку старіння та вікового зростання онкозахворюваності.
^ Перелік основних публікацій циклу
Галицький В. Кластери генів як складові елементи фрактальної структури генної системи, що контролює процеси диференціації та детермінації клітин // Тези доповідей 2-го Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених.– Тернопіль: Укрмедкнига, 1998.– C.36-37. (Публікація, у якій вперше запропонована гіпотеза, що за кожен окремий етап диференціації клітини відповідає окрема група генів, керована позитивним зворотнім зв’язком).

Галицкий В.А. Детерминация и дифференцировка клеток: концепция кластеров генов // Цитология.– 2001.– Т.43, № 10.– С.913-925. (Гіпотеза про модульну будову генної мережі диференціації клітин була деталізована).

Галицкий В.А. Канцерогенез и механизмы внутриклеточной передачи сигналов // Вопросы онкологии.– 2003.– Т.49, № 3.– С.278-293. (Обгрунтована теорія чотирьохстадійного канцерогенезу).

Галицький В.А., Комісаренко С.В. Деякі механізми диференціації лімфоїдних клітин // Укр. біохім. журн.– 2007.– Т.79, №4.– С.5-17. (Реконструкція генної мережі Т-лімфопоезу).

Галицкий В.А. Гипотеза о механизме инициации малыми РНК метилирования ДНК de novo и аллельного исключения. // Цитология, 2008, Т.50, № 4.- С.277-286. (Запропоновано механізм RNAi-залежного метилювання ДНК і його участі у алельному виключенні та диференціації клітин).

Галицький В.А., Комісаренко С.В. Рекомбінація у локусах імуноглобулінових генів // Біополімери і клітина, 2009, Т.25, №1.– С.12-26. (Реконструкція генної мережі В-лімфопоезу; запропоновано пояснення механізму алельного виключення імуноглобулінових генів на основі ідеї про RNAi-залежне метилювання ДНК).



Наук. співр, к.б.н. В.А. Галицький