Реферат: Методика изучения ориентировочно-исследовательского поведения мышей в «открытом поле» 71 5 Методика изучения условного рефлекса пассивного избегания (урпи) 71

Материалы предоставлены интернет - проектом www.diplomrus.ru®

Авторское выполнение научных работ любой сложности – грамотно и в срок



Содержание

ВВЕДЕНИЕ 6


ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13


1.1 .Современные представления о патогенезе мигрени 14 1.2.Состояние проблемы фармакотерапии больных


мигренью 39


ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 59


2.1. Методы оценки мозгового кровообращения 59 2.1.1 .Регистрация изометрического напряжения изолированных сегментов базилярной артерии кролика 60


2.1.2. Регистрация мозгового кровотока с помощью электромагнитного и ультразвукового флоуметров 62


2.1.3. Оценка состояния микроциркуляции с помощью


лазерного допплеровского флоуметра 63 2.1.4.Измерение локального мозгового кровотока с помощью


методики водородного клиренса 64


2.1.5. Регистрация тонуса сосудов мозга методом раздельной двухсторонней перфузии каротидных и позвоночных


артерий 65


2.1.6. Изучение диаметра пиальных артериол в бассейне средней мозговой артерии 66


2.2. Изучение нервной регуляции мозгового кровообращения 67


2.3. Определение напряжения углекислоты в артериальной


крови животных 68


2.4. Метод радиолигандного связывания 69


2.5. Методы изучения нейропсихотропных свойств 70 2.5.1. Изучение двигательной активности 70


2.5.2. Методика изучения ориентировочно-исследовательского поведения мышей в «открытом поле» 71


2.5.3. Методика изучения условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) 71


2.5.4. Изучение поведения мышей в условиях модифицированного плавательного теста по Porsolt 72


2.5.5. Методы изучения антигипоксических свойств 72


2.5.6. Методика изучения поведения крыс в условиях конфликтной ситуации с питьевой депривацией 73 2.6. Методы изучения анальгетической активности 73


2.6.1. Изучение болевого порога у мышей с помощью теста


tail flick- отдергивание хвоста 73


2.6.2. Изучение болевого порога у мышей с помощью теста


- hot plate -горячая пластинка 74


2.6.3. Изучение болевого порога у крыс при электрической стимуляции хвоста животного 74 ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА НА МОЗГОВОЕ КРОВООБРАЩЕНИЕ 75 3.1.Моделирование спазмов сосудов мозга с помощью серотонина 75


3.2. Влияние серотонина на вазомоторные и сомато-симпатические рефлексы 84


3.3. Неодинаковая чувствительность артериальных систем


мозга к серотонину 86


ЗАВлияние серотонина на микроциркуляцию интактного


и ишемизированного мозга 88


3.5 .Влияние серотонина на диаметр пиальных артериол 93


^ ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ АНТИСЕРОТОНИНОВЫХ СВОЙСТВ ПРОТИВОМИГРЕНЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ 96


4.1. Метисергид 96


4.2. Дигидроэрготамин 100


4.3. Ницерголин 103


4.4. Пропранолол 110 4.5.Толфенамовая кислота 112 ГЛАВА 5. СКРИНИНГ АНТАГОНИСТОВ СЕРОТОНИНА СРЕДИ ПРОИЗВОДНЫХ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ ОКСИМА ТРОПИНОНА 116 ГЛАВА 6. АНТИСЕРОТОНИНОВЫЕ И ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ТРОПОКСИНА


^ В СРАВНЕНИИ С ДРУГИМИ


ПРОТИВОМИГРЕНЕВЫМИ ПРЕПАРАТАМИ 121


6.1. Изучение антисеротониновых свойств тропоксина 121


6.2. Цереброваскулярные эффекты тропоксина 130


6.3. Изучение влияния тропоксина на частоту сердечных сокращений и дыхание у наркотизированных кошек 133 ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ НЕЙРОМЕДИАТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ТРОПОКСИНА 134 7.1. Кетансерин 134 7.2.Трописетрон 135 7.3 .Нейрохимический анализ антисеротонинового


действия тропоксина 138


7.4.Изучение адреноблокирующих и антигистаминных


свойств тропоксина 139


7.3 .Влияние тропоксина на реакцию артериального


давления, вызванную ацетилхолином 140


^ ГЛАВА 8. НЕИРОПСИХОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА 141 ТРОПОКСИНА


ГЛАВА 9. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ И


БЕЗОПАСНОСТИ ТРОПОКСИНА 155


ЗАКЛЮЧЕНИЕ 177


ВЫВОДЫ 192


^ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 194


ВВЕДЕНИЕ


Актуальность темы. Мигрень является одним из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний среди населения. Согласно данным, представленным на 7-м Международном конгрессе по головным болям, в развитых странах Европы и Америки мигренью страдает от 3 до 16% населения, а по некоторым данным и до 30%. Среди женщин мигренью болеют 18% , среди мужчин - 6% и среди детей - 4 % (Silberstein S.D. et al., 1998; Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Черняк З.В. и соавт, 2003). У женщин приступы мигренью возникают в 2 -3 раза чаще, чем у мужчин (Вейн А.М.и соавт., 1995; Rasmussen В.К., 1994; Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001). Наиболее часто мигренью болеют лица трудоспособного возраста - 35-40 лет. Эпидемиологические исследования последних лет выявили тенденцию к увеличению числа больных мигренью (Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001 Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Яхно Н.Н., Штульман Д.Р., 2003).


Многочисленные клинические и молекулярно-биологические исследования свидетельствуют о важной роли генетического фактора в возникновении мигрени (Вейн A.M. и соавт., 1995; Амелин А.В. и соавт., 2001). Мигрень считают заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера чаще в одной половине головы (Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997). Несмотря на значительный прогресс в изучении патогенеза приступа мигрени, многие аспекты этой проблемы остаются невыясненными (Pietrobon D., Stressing J. 2003). В настоящее время очевидно, что одну из существенных ролей в генезе этого заболевания играет нейромедиатор - серотонин. Важно отметить, что


серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов (Прусинский А., 1979). В литературе широко обсуждаются гипотезы формирования приступа мигрени. Так, в середине прошлого столетия Wolff H.G. и сотрудники (1963) предложили сосудистую гипотезу развития приступа мигрени, которая не потеряла актуальность и в настоящее время. Согласно этой гипотезе приступ мигрени сопровождается повышением тонуса мозговых сосудов с последующим их расслаблением. Далее Olesen J. В. и соавторы (1981) предложили нейрогенную гипотезу, основанную на обнаруженной ими корреляции изменений мозгового кровообращения с распространяющейся кортикальной депрессией Leao. В последние годы широко обсуждается значение тройничного нерва в механизмах формирования головной боли при мигрени. Эта гипотеза, получившая название тригеминоваскулярной, предложена Moskowitz M.A. (1984), согласно которой система тройничного нерва является ответственной за взаимодействие между центральной нервной системой и сосудами головного мозга во время приступа мигрени. Следует подчеркнуть, что, несмотря на различия в представлениях формирования приступа мигрени, представители всех гипотез признают, что серотонин и цереброваскулярный компонент являются существенными факторами в этом процессе. Открытым остается вопрос о первичности или вторичности реакции сосудов мозга, наблюдаемой во время приступа мигрени.


Для лечения больных мигренью используются лекарственные препараты, относящиеся к различным группам фармакологических веществ: адреноблокаторы, антидепрессанты, блокаторы кальциевых каналов, противосудорожные, ненаркотические анальгетики и другие. Среди них особое место занимают препараты, воздействующие на


серотониновые рецепторы - агонисты 5HTiB/m- и антагонисты 5НТ2-рецепторов. Имеющиеся в наличии у клиницистов лекарственные средства для лечения мигрени не всегда отличаются достаточной эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами. Поэтому поиск новых препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени является одной из наиболее актуальных задач современной фармакологии и медицины.


В соответствии с современными представлениями о патогенезе приступа мигрени необходимо совершенствовать методологию поиска новых средств для лечения этого заболевания. При этом следует учитывать как факторы, определяющие генез приступа мигрени, так и располагать сведениями о механизме действия известных препаратов, применяемых для лечения этого заболевания.


В соответствии с важной ролью цереброваскулярного компонента и серотонина в генезе приступа мигрени при поиске новых противомигреневых препаратов необходимо, чтобы вещество проявляло антисеротониновую активность по отношению к церебральным сосудам.


При выборе химического ряда наше внимание привлекли производные тропана, к которым относятся обладающий антисеротониновой активностью ос - адреноблокатор - тропафен (Машковский М.Д., Шварц Г.Я., 1979) и антагонист 5НТз типа рецепторов - трописетрон (Richardson B.P. et al., 1985).


Цель исследования: разработка методологии поиска противомигреневых препаратов с учетом основных патогенетических факторов развития приступа мигрени, изыскание нового препарата с антисеротониновой цереброваскулярной активностью среди производных тропана, изучение механизма его действия и проведение расширенных доклинических испытаний.


Задачи исследования:


1. провести систематическое изучение влияния серотонина на тонус сосудов различных артериальных систем мозга, состояние микроциркуляции в коре головного мозга и разработать модель серотонинового спазма церебральных сосудов;


2. изучить роль серотонина в реализации цереброваскулярных эффектов известных противомигреневых препаратов: метисергида, дигидроэрготамина, ницерголина, пропранолола, толфенамовой кислоты;


3. провести скрининг среди производных тропана (в опытах in vitro, in vivo) с целью выявления соединения с наиболее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и наименьшей токсичностью и сопоставить его эффекты с эталонными препаратами;


4. провести анализ антисеротонинового эффекта нового соединения для определения типа серотониновых рецепторов-мишеней с использованием метода радиолигандного связывания;


5. провести нейромедиаторный анализ механизма действия наиболее активного соединения;


6. изучить влияние наиболее активного соединения на центральные и периферические механизмы регуляции сосудистого тонуса;


7. изучить нейротропные свойства наиболее активного соединения с использованием комплекса общепризнанных методик;


8. определить анальгетическую активность нового соединения;


9. изучить фармакокинетику и хроническую токсичность нового противомигреневого препарата.

Научная новизна работы. Разработана методология поиска новых противомигреневых препаратов на основе современных представлений о существенной роли серотонина и цереброваскулярного компонента в патогенезе приступа мигрени.


Установлена существенная роль серотонина в реализации констрикторных реакций сосудов каротидной артериальной системы мозга по сравнению с вертебробазилярной системой. Показано, что в условиях ишемического поражения мозга реакция микрососудов мозга на серотонин возрастает.


Систематическое изучение механизма действия


противомигреневых препаратов позволило установить


антисеротониновую цереброваскулярную активность у ницерголина, пропранолола и толфенамовой кислоты.


Скрининг среди производных оксима тропинона выявил новое оригинальное соединение, получившее название тропоксин, обладающее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и низкой токсичностью.


Тропоксин блокирует реакции сосудов мозга на серотонин как у интактных животных, так и в условиях локальной перманентной ишемии мозга. По силе антисеротониновой активности тропоксин превосходит метисергид, ницерголин, пропранолол, толфенамовую кислоту и не уступает дигидроэрготамину.


С использованием методики радиолигандного связывания выявлена способность тропоксина блокировать 5НТ2 - рецепторы коры головного мозга. Тропоксин не влияет на адрено- холино- и гистаминергические рецепторы.


Тропоксин обладает умеренно выраженным стимулирующим действием и не проявляет анальгетическую активность.

Установлено, что тропоксин преодолевает гемато-энцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации препарата в ткани мозга выше, чем в крови.


Тропоксин по данным изучения шестимесячной «хронической» токсичности не оказывает отрицательного влияния на строение внутренних органов, не вызывает изменений электрокардиограммы, поведенческих реакций, гематологических и клинико-биохимических параметров крови и мочи. Он не обладает местноанестезирующим, иммунотоксическим, тератогенным, мутагенным действием.


Научно-практическое значение работы. Предложенная методология скрининга противомигреневых препаратов, проведенный анализ роли серотонина в регуляции тонуса мозговых сосудов и в механизме действия известных средств для лечения мигрени, создают основу для направленного поиска потенциальных препаратов для лечения больных мигренью.


Научные положения, разработанные в настоящем исследовании, явились основой для составления изданных Фармакологическим государственным комитетом РФ «Методических указаний по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени», которые вошли в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» 2000 года.


Выявленное впервые среди производных тропана новое соединение с выраженной цереброваскулярной антсеротониновой активностью (патент РФ №1832683, 1994) позволяет считать целесообразным поиск потенциальных противомигреневых препаратов в указанном ряду химических соединений.

Полученные в результате настоящего исследования данные составили основу представленных в Фармакологический государственный комитет МЗ РФ материалов доклинического изучения препарата тропоксин, на который получено разрешение на проведение клинических испытаний препарата в качестве средства для лечения мигрени.


Результаты проведенного экспериментального изучения препарата тропоксин получили клиническое подтверждение на кафедре неврологии и нейрохирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова, где выявлена высокая эффективность тропоксина при межприступном лечении частых тяжелых приступов мигрени.

^ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ


Согласно международной классификации мигрень в настоящее время делится на две формы - мигрень с аурой или классическая мигрень и мигрень без ауры или простая мигрень.


Факторами, провоцирующими мигрень являются эмоциональный стресс, включение в рацион питания пищевых продуктов, содержащих тирамин (шоколад, сыр, копчености, цитрусовые, красные вина и др.), физическое перенапряжение, изменение метеорологических условий, прием оральных контрацептивов, нитратов и других периферических вазодилататоров, менопауза, менструации, черепно-мозговая травма, нарушение режима сна и отдыха.


Мигрень с аурой встречается в 25-30% случаев, а без ауры - в 75% случаев. Приступ мигрени с аурой состоит из пяти фаз. Первая фаза — продромальная, которая появляется за несколько часов до головной боли и характеризуется сменой настроения, чувством усталости, сонливости, задержкой жидкости в организме, раздражительностью, беспокойством, булемией или анорексией, повышением чувствительности к запахам, шуму, яркому свету. Вторая фаза - аура, характеризующаяся комплексом очаговых неврологических симптомов продолжительностью не более 60 минут. Третья фаза - болевая, которая продолжается от 4 до 72 часов и проявляется пульсирующей головной болью в лобно-глазнично-височной области, как правило, односторонней, умеренной или сильной интенсивности, усиливающейся при обычной физической нагрузке, сопровождается светобоязнью, тошнотой, рвотой, бледностью кожных покровов. В ряде случаев, головная боль носит ломящий, распирающий характер и может распространяться на другую сторону. Четвертая фаза - разрешение - характеризуется постепенным

уменьшением головной боли, прекращением рвоты и глубоким сном. Пятая фаза - восстановительная, длится несколько часов или дней.


Приступ мигрени без ауры состоит из трех фаз — продромальной, болевой и восстановительной. Однако наличие продромальной фазы не обязательно. Часто приступ начинается без всяких предвестников, сразу с головной боли. Клиническая картина фазы головной боли аналогична для мигрени с аурой. Для мигрени без ауры характерно наличие рефрактерных периодов, когда болезнь после приступа не проявляется довольно длительное время, и в этот период большинство больных считает себя практически здоровыми (Прусинский А., 1979; Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997; Амелин А.В. и соавт., 2001).


1.1. Современные представления о патогенезе мигрени


Этиология и патогенез мигрени окончательно не установлены, но существует несколько гипотез, касающихся механизмов действия приступа мигрени. Согласно сосудистой гипотезе, предложенной Wolff H.G. и соавторами (1963), приступ мигрени состоит из трех стадий. На первой стадии, которая соответствует фазе ауры или другим продромальным симптомам, имеет место спазм мозговых сосудов, что приводит к недостаточному кровообращению отдельных участков мозга. Вторая стадия сопровождается патологическим расширением сосудов, особенно внемозговых, а также атонией их стенок, что вызывает характерную пульсирующую боль. На третьей стадии, которая наступает не всегда, вследствие нарушений проницаемости наступает отек сосудистой стенки. Этой гипотезы придерживаются многие исследователи и она подтверждается клиническими наблюдениями. Heyck H. (1960) высказал мнение о том, что головная боль связана не с пульсацией сосудов, а с ишемической гипоксией мозговой ткани,

которая возникает в результате открытия артериовенозных шунтов и нарушения кровообращения в микроциркуляторном русле. Сброс крови в систему венозных сосудов приводит к их избыточному растяжению, что совпадает с ломящей давящей головной болью. Данная гипотеза рассматривается как одна из разновидностей сосудистой гипотезы.


Согласно другой гипотезе мигрень начинается с первичной нейрогенной церебральной дисфункции, а сосудистые изменения носят вторичный характер. Эта нейрогенная гипотеза происхождения мигрени была предложена Olesen J. и соавторами (1971). Они обнаружили, что во время приступа мигрени волна снижения кровотока начинается в затылочной области мозга и распространяется на полушария со скоростью 2-3 мм в минуту и соответствует скорости распространения кортикальной нейрональной депрессии, описанной Leao в 1944 году, (Olesen J., 1992). На основании полученных данных Olesen и соавторы сделали вывод, что сосудистые изменения носят вторичный характер и провоцируются нейрогенными механизмами. Неврологические симптомы, возникающие во время ауры приступа мигрени, позволяют предположить, что начало приступа мигрени связано с нарушениями в центральной нервной системе, которые также подтверждают нейрогенную гипотезу. Симптомы, предшествующие приступу головной боли, такие как жажда, булемия, сонливость, отражают дисфункцию гипоталамо-гипофизарных структур мозга.


В последнее время большое внимание уделяется роли тройничного нерва в патогенезе мигрени. Согласно тригеминоваскулярной гипотезе, предложенной Moskowitz M.A. (1984), основная роль в патогенезе мигрени принадлежит системе тройничного нерва, обеспечивающего взаимодействие между центральной нервной системой и интра- и экстракраниальными сосудами. Тройничный нерв является основным афферентным звеном передачи болевого импульса от

сосудистых областей головного мозга. Ветви тройничного нерва иннервируют кожные покровы, лежащие под ними мышцы лба, носа, передней поверхности скальпа, роговицу, конъюктиву и внутриглазные структуры, слизистую параназальных синусов, слизистую верхней и передней части перегородки носа, латеральной стенки носовой полости и слезный проток, а также твердую и мягкую мозговые оболочки, их артерии, крупные сосуды мозга и венозные синусы. Интракраниальные сосуды задней черепной ямки иннервируются спинномозговыми корешками из верхнего шейного (Ci-Сг) отдела спинного мозга (Лиманский Ю.П., 1987; Saito К. et al., 1996). Нервы, которые иннервируют краниальные сосуды, содержат большое количество тонких миелиновых и безмиелиновых волокон, которые участвуют в проведении ноцицептивной информации (Амелин А.В. и соавт., 2001). Растяжение крупной церебральной артерии приводит к появлению гомолатеральной боли в зоне иннервации первой ветви тройничного нерва (Nichols F.D. и соавт., 1990). Нейроны тройничного ганглия являются псевдо-униполярными. Одна ветвь аксона идет к сенсорному ядру тройничного комплекса, а другая - контактирует с сосудами твердой и мягкой мозговых оболочек. Нейроны второго порядка расположены в каудальной части продолговатого мозга и в Ci-C2 сегментах спинного мозга. От них ноцицептивная информация передается в таламус, а затем в кору головного мозга. Волокна тройничного нерва участвуют в формировании микроокружения стенки сосуда, а псевдо-униполярные нейроны тройничного ганглия участвуют в происхождении тканевого нейрогенного воспаления (Lembeck F.,1983). По данным Moskowitz M.A. (Moskowitz M.A., Macfarlane R., 1993) боль при мигрени обусловлена нейрогенным асептическим воспалением, а эффективность многих противомигреневых препаратов связана с их возможностью предупреждать или подавлять неирогенное воспаление в

твердой мозговой оболочке. Нейрогенное асептическое воспаление возникает в результате активации периваскулярных афферентных терминалей тройничного нерва, следствием которого является деполяризация нервных окончаний и выделение из них мощных вазодилятаторов (пептид, связанный с геном кальцитонина - CGRP, субстанция Р, нейрокинин А и вазоинтестинальный пептид-VIP) которые расширяют сосуды, увеличивают проницаемость сосудистой стенки, пропотевание белков плазмы, форменных элементов крови, вызывают отек сосудистой стенки и прилегающих участков твердой мозговой оболочки, дегрануляцию тучных клеток, агрегацию тромбоцитов, что все вместе вызывает боль, которая иррадиирует в лобно-глазнично-височную область и локализуется в правой или левой половине головы. В результате этих данных была разработана модель асептического нейрогенного воспаления твердой мозговой оболочки и было установлено, что на пресинаптических окончаниях тройничного нерва локализованы 5НТю-рецепторы. Высказывается мнение, что на окончаниях тройничного нерва локализованы гистаминовые, опиоидные и адренергические рецепторы (Matsubara T. et al., 1992) (рис.1).


В последнее время приступ мигрени рассматривают как совокупность сосудистых и нейрональных факторов. Пусковым механизмом считают изменения на уровне центральной нервной системы, в частности, в стволе мозга, который называют «генератором мигрени» (Weiller С. et al., 1995). Симптомы, наблюдаемые во время ауры и фазы головной боли, объясняют с точки зрения нейрососудистой гипотезы (Ferrari M.D., Saxena P.R., 1993; Saxena P.R., 1994). Полагают, что после запуска, так называемого «генератора мигрени», наблюдается уменьшение регионального кровотока, возможно следующего за распространяющейся кортикальной депрессией (Read S.G., Parsons A.A., 1999). У больных в период уменьшения мозгового кровотока до