Реферат: Основные виды хроматографии

СОДЕРЖАНИЕ:


стр.

Введение……………………………………………………………………..……..2

Основные виды хроматографии…………………………………………...……3

Теоретические основы и термины хроматографии…………………….…….5

Сорбенты хроматографического анализа………………………………….….7

Сорбенты гель-фильтрации……………………………………………….……8

Растворители……………………………………………………………………...9

Препаративная жидкостная хроматография……………………………...…11

Изменение формы пика с увеличением нагрузки…………………………...13

Масштабирование разделения………………………………………………....14

Препаративная гель-фильтрация……………………………………………..15

Оптимизация препаративной гель-фильтрации………………………….....16

Клещевой энцефалит…………………………………………………………….17

Практическая часть……………………………………………………………..19


ВВЕДЕНИЕ.


Метод хроматографического разделения возник в начале прошлого века, после опубликования работ русского учёного Цвета, который обнаружил разную сорбируемость пигментов хлорофилла на оксиде алюминия, и как следствие разную скорость продвижения по колонке, заполненной им. Изначально метод позволял анализировать только окрашенные вещества, что и дало название методу.

В настоящее время этот метод используют не только для анализа веществ, имеющих окраску. Благодаря оснащению колонок специальными регистрирующими устройствами можно подвергать анализу и разделению самые разные вещества и классы соединений. Кроме того возможность разделять вещества очень близкого строения, природные соединения, белки, нуклеиновые кислоты, и даже некоторые биологические объекты -,делают этот метод очень применимым и зачастую единственным в настоящее время. Особенно это касается белков и нуклеиновых кислот – их разделение хроматографическим методом очень точно позволяет выделять и анализировать белки очень сложного строения. Выше перечисленные факты делают хроматографию очень популярной в научно—исследовательских биологических лабораториях, при получении и выделении новых белковых препаратов:- сывороток и вакцин. Современная модификация метода—высокоэффективная жидкостная хроматография , позволяет провести анализ, идентификацию и разделение очень малых количеств веществ ( ~0.000001 г.) за очень короткое время –15—20 минут.

Следует также сказать ,что современные хроматографы оснащены компьютерами, что позволяет ускорить анализ веществ (за счет создания библиотеки веществ в памяти),сделать анализ более достоверным и точным, а также простым в выполнении Перечисленные факты делают метод хроматографического анализа одним из самых применимых в современных экспертных лабораториях, так как метод позволяет быстро и качественно разделить и проанализировать смеси близких по свойствам веществ, в частности лекарственных препаратов, веществ природного происхождения. Наша работа посвящена препаративному хроматографическому разделению веществ, но чтобы разработать наиболее выгодные условия для хроматографического разделения веществ нужно сперва подобрать оптимальные условия для мелкомасштабных , аналитических разделений, затем провести масштабирование и перейти к препаративному разделению. Вообще, препаративная хроматография возникла сравнительно недавно (1940-годы), появление её было обусловлено необходимость разделения веществ, которые нельзя было разделить обычными способами, так чтобы они сохранили свои первоначальные свойства( выделение белков, нуклеиновых кислот, различных лекарственных веществ природного происхождения). Также нужно добавить , что наряду с эффективностью и практически универсальностью разделения у препаративной хроматографии есть ещё и ряд недостатков:- прежде всего это сравнительно высокая стоимость разделения , а также ещё и то что трудно предсказать возможность разделения веществ на данной хроматографической колонке в данных условиях , то есть необходимо проводить ряд опытов в более мелких масштабах для установления условий разделения , это и есть оптимизация.


^ ВИДЫ ХРОМАТОГОРАФИИ.


Целью нашей работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита .Рассмотрим основные виды хроматографии, которые могут применяться для этих целей

Важнейшим вариантом жидкостной хроматографии является ионнообменная хроматография Этот метод позволяет проводить разделение не только в аналитических целях, но и разделять вещества в более крупных масштабах, например при промышленном разделении веществ. Особенностью метода является то, что сорбент(ионнообменник) способен ионизироваться, отдавая подвижные ионы (H, Na) в подвижную фазу,при этом сам ионнообменник приобретает заряд.

В случае отрицательного заряда матрицы говорят об катионо-обменнике, в случае положительного об анионообменнике. Катионо- и анионо-обменники бывают сильными и слабыми. Сильные ионизированы во всем интервале pH , а слабые лишь в определенном интервале, зависящим от свойств конкретного ионобменника,точнее от природы ионогенных групп ионнообенника. Ионизацией слабых ионообменников можно управлять, меняя pH среды, что имеет большое значение в процессе разделения. Ионообменники представляют собой полимеры, модифицированные введением ионогенных групп. В случае катионообменников это –SO3-,-COO--,-CH2-SO3--,с соответствующими противоинами. К анионообмееным группам относят тетраалкиламмониевые группы с положительным зарядом. Особенностью ионообменной хроматографии является то ,что она позволяет отделять и разделять заряженные частицы. Разделение основано на электростатическом взаимодействии ионов подвижной фазы с неподвижными ионогенными группами ионообменника.К органическим веществам, способных образовывать ионы в растворе относят соединения четырех валентного азота, трех валентного кислорода, аминокислоты, белки, карбоновые кислоты. Из обилия перечисленных веществ видно как важен метод. Как уже было отмечено в основе разделения веществ лежит электростатическое взаимодействие ионов подвижной фазы и ионов матрицы. Однако это взаимодействие обратимо, на самом деле устанавливается равновесие между ионогенной группой, соединенной с органическим ионом и ионогенной группой, соединенной с неорганическим противоионом (H+ ,Cl-, OH-, Na+).Очевидно ,что чем больше неорганических ионов ,тем слабее будут связаны разделяемые вещества. Поэтому растворы неорганических солей можно использовать в качестве элюентов. Важной характеристикой ионнообменника явяется его кривая титрования , она позволяет сделать вывод о силе ионообменника. Для разеления ,например аминокислот также необходимо знать их кривые титрования, т.е. в какой области pH аминокислота находиться в форме аниона, а в какой в форме аниона. Сопоставляя кривые титрования аминокислот и ионообменника можно сделать вывод о возможности разделения данных аминокислот на данном ионообменнике при определенном значении pH.

Однако не только электростатическое взаимодействие влияет на разделение веществ, немаловажны и стерические факторы--такие как величина пор ионообменника, расстояние между соседними ионогенными группами. Особое значение это имеет при разделенни макромолекул, например белков, в данном случае электростатическое взаимодействие может лимитироваться стерическими факторами и диффузией макромолекул к ионогенным группам. Немаловажно в связи с этим отметить влияние структуры белка (первичная вторичная и т.д.) очевидно, что скорость диффузии будет для них неодинакова, -молекула в виде глобулы будет легче передвигаться, чем разветвленная молекула. Особенностью макромолекул является и то , что они могут нести несколько одноименных зарядов, в этом случае возможно взаимодействие одной молекудлы с несколькими ионогенными группами(как правило двумя),интересно отметить, что прочность связи при этом увеличивается более, чем вдвое. Это объясняется тем, что одна связь как бы страхует другую. -при разрыве одной связи молекула колеблется около положения равновесия, ясно , что в этом случае ей легче возобновить вторую связь. Однако возможность такой двое связанности скорее негативно влияет на процесс разделения, так как крепко закрепившиеся молекулы очень трудно отделить от ионообменника приходиться применять концентрированные растворы солей, что может нарушить структуру белка , что ведет к его денатурации, также резко снижается разделительная способность колонки. Также следует отметить , что при подобной сорбции белковая молекула может деформироваться под структуру матрицы , что также может вести к денатурации. Таким образом применительно к очистке белковых веществ можно сказать, что метод позволит отделить некоторые незаряженные молекулы от белковых молекул, которые как правило заряжены, а также можно провести разделение и от посторонних белков, только нужно знать кривые титрования белков и кривую титрования ионообменника.

Важным видом хроматографии является гель-фильтрация. Она позволяет разделять молекулы в зависимости от их молекулярных масс. Разделение в этом методе основано на различной скорости диффузии молекул с разной молекулярной массой (различными размерами). Сорбентом в данном методе служит гель , точнее мелкие частицы, внутри пронизанные нитями (фибриллами).Диффузия внутрь этих частиц лимитируется размерами ,а точнее подвижностью молекул которая зависит от их молекулярной массы. Чем меньше молекулы, тем легче они способны проникать вовнутрь гранул геля, соответственно более тяжелые частицы практически не проникают в гранулы, так как менее подвижны. Частицы попавшие внутрь гранул под действием диффузии движутся внутри и с равной вероятностью могут выйти наружу, но пространство внутри гранул геля пронизано нитями и молекулы претерпевают многочисленные столкновения с сетью фибрилл и способны надолго задерживаться внутри гранул. Таким образом мы видим ,что более легкие молекулы способны надолго задерживаться внутри гранул, и их скорость продвижения будет меньше скорости движения более тяжелых молекул.

Описанный метод очень эффективен для разделения белков и других высоко-молекулярных соединений. Варьируя характеристики частиц геля ,- такие как размер пор на поверхности гранул, характеристики внутреннего строения гранул ,- можно добиться разделения определенных веществ, т.е. того, что вещества с определенной молекулярной массой будут проходить ,остальные продвигаться с меньшей скоростью, особенно это важно при разделении белков на фракции по их молекулярным массам, а также при фракционировании полимеров по их молекулярным массам , для анализа качества образца, нахождения его молекулярно-массового распределения. Применительно к нашей теме следует сказать, что гель-фильтрация как нельзя лучше подходит для отделения белковой части вакцины от низкомолекулярных веществ, обессаливания препарата, и в некоторых случаев к концентрированию.

Одним из интереснейших методов жидкостной хроматографии является аффинная хроматография. Она позволяет разделять отдельные ферменты ,белки и даже вирусы и простейшие биологические объекты .Особенностью данного вида хроматографии является то , что разделение основано на разного вида специфических взаимодействиях частиц подвижной фазы с сорбентом. Сорбентом в данном виде хроматографии служит гель типа агарозы к которому ковалентно привязаны подходящие лиганды ,им может быть субстрат какого-либо фермента ,Когда через такой сорбент пропускают подвижную фазу , то из нее будет сорбироваться только соответствующий фермент, он будет прочно связан с сорбентом, но его оттуда можно смыть избытком растворителя, или можно использовать закрепленный фермент, для непрерывного превращения молекул субстрата из подвижной фазы При модификации сорбента соответствующими антителами можно удерживать заданные вирусы ,при модификации антигеном удерживать ген. Очевидно , что метод аффинной хроматографии очень высокоэффективен из-за селективности специфических взаимодействий и очень перспективен ,так как позволяет концентрировать биологические объекты , которые важны при производстве вакцин и сывороток.

^ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ ХРОМАТОГРАФИИ.

Основная кинетическая характеристика процесса – высота, эквивалентная теоретической тарелке (В.Э.Т.Т)-H.Она соответствует слою сорбента (высоте слоя) при прохождении через который акт сорбции-десорбции успевает совершиться в среднем один раз. H отражает качество сорбента , качество заполнения колонки и правильность выбора режима хроматографирования.

Зачастую удобнее использовать не Н ,а число теоретических тарелок в

колонке –N=L/H, где L-длина колонки.N служит мерой эффективности колонки ,ее рассчитывают как функцию времени удерживания и ширины пика на хромотограмме:


N = 5.54*(tR/W0.5)2 = 16*(tR/WS)2 = 4*(tR/W2S)2 , где

WS -- ширина пика у основания.

W0.5 –ширина пика на половине его высоты

W2S – ширина пика на 0.607 его высоты.

До сих пор мы лишь обсуждали методы хроматографии , обратимся теперь к некоторым теоретическим основам метода. Прежде всего нужно сказать ,что аналитическим сигналом в хроматографическом анализе хроматограмма. Она представляет собой кривую зависимости концентрации, выходящих с потоком подвижной фазы из колонки ,от времени с начала разделения. Однако ,следует заметить, что в детекторах , используемых в хроматографии редко измеряется непосредственно концентрация ,а часто это пропорциональная ей величина(коэффициент преломления, поглощения, и т.п.) .Хроматограмма состоит из базовой линии и пиков .Базовая линия соответствует тем моментам времени , когда из колонки вытекает чистый растворитель; пик соответствует появлению одного из разделяемых веществ в вытекающем растворителе. В идеале форма пика стремится к кривой Гауссовского распределения. Время появления максимума пика называется временем удерживания –tR.. При постоянных условиях работы и составе фаз tR является индивидуальным для каждого вещества. Иногда в начальной части хроматограммы появляется маленький пик ,он соответствует времени удерживания несорбированного вещества t0 и свободный объем системы. Своим появлением этот пик обязан кратковременному нарушению равновесия в колонке при вводе пробы .

^ Свободный объем системы (V0C) – объем подвижной фазы от устройства для ввода до детектора. Часть его находится внутри колонки (Vm)-свободный объем колонки. В идеале свободный объем системы не должен превышать свободный объем ,в этом случае t0 в первом приближении соответствует свободному объему колонки. Также важен объем объём неподвижной фазы – VS .Отношение VS к Vm – фазовое отношение колонки. Фазовое отношение позволяет связать хроматографический процесс с термодинамическими характеристиками системы. Если F- скорость подачи подвижной фазы в колонку (в первом приближении не влияет на распределение) ;удерживаемый объем выражают как : VR=tR*F.VR- постоянная величина для данного вещества на колонке данных размеров ,но на колонке с другими геометрическими характеристиками VR будет другим , однако пропорционально ему меняется и t0 ,и чтобы избавиться от зависимости от параметров системы вводят величину k` - коэффициент емкости

k`=(tR-t0)/t0. k` является величиной связанной с термодинамическими характеристиками сорбции -- G сорбции. Так как в выражение для к` входит фазовое отношение, которое в свою очередь зависит от объема сорбента , а следовательно и от плотности упаковки , то была предпринята попытка заменить к` на индекс удерживания , однако в В.Э.Ж.Х индексы удерживания широкого применения не нашли. Однако в реальных случаях разделения приходиться иметь дело с несколькими разделяемыми компонентами, поэтому вводят такую величину как селективность --ij=(tRi-t0)/(tRj-t0). Селективность является сравнительной термодинамической характеристикой двух разделяемых соединений.

Все рассмотренные величины характеризуют термодинамические процессы в системе , однако процессы в хроматографической колонке определяются еще и кинетическими факторами, как и любой другой химический процесс .Так если ij=1, (термодинамическая характеристика),то вещества не разделить при любом устройстве колонки. Однако неравенство селективности единицы не гарантирует разделения веществ. Для хорошего разделения колонка должна обладать еще и достаточно высокими характеристиками кинетического характера, а именно акты сорбции-десорбции должны совершаться с большой скоростью, чтобы реализовать термодинамическую возможность разделения.

Для оценки разделения веществ всегда нужно учитывать 2 фактора – термодинамический и кинетический. В качестве численной меры , учитывающей кинетику и термодинамику используют критерий разделения:

RS=2*(tRi – tRj)/(WSi--WSj) .

RS связан с основными характеристиками системы следующим образом:


RS=0.25*((-1)/)*((k`/(1+k`))*N1/2 ,

k` -- здесь средний коэффициент удерживания .

Как уже отмечалось выше для хроматографического анализа и особенно разделения важна форма зон (пиков) на хроматограмме в идеале требуется , чтобы они были как можно более узкими и высокими и более удалены друг от друга, в этом случае легче будет провести анализ и он будет более точным. Ширина пиков (их форма) зависит от высоты теоретической тарелке, чем выше Н, тем хуже это отражается на виде хроматограммы. Н ,в частности, зависит от разного рода диффузионных процессов ,протекающих внутри колонки.

Эти процессы , обусловлены:

вихревой диффузией, которая возникает из-за неоднородности твердой фазы- она пропорциональна размеру частиц сорбента;

продольной молекулярной диффузии в подвижной фазе появление этой диффузии связано с затрудненностью перемещения между гранулами сорбента, эта диффузия обратно пропорциональна скорости подвижной фазы;

продольной диффузии в неподвижной фазе – также обратно пропорциональна скорости потока , обычно вклад этого вида диффузии равен вкладу продольной диффузии в подвижной фазе;

вклад в диффузию кинетики массопередачи в подвижной фазе, пропорционален скорости потока;

вклад неравновестности процесса внутри застойных зон в частицах насадки ,также линейно зависит от скорости потока;

вклад кинетики массопередачи в неподвижной фазе.


Как мы можем видеть многие составляющие диффузии (увеличивающие значение Н) линейно зависят от скорости потока, некоторые обратно пропорционально и в общем случае зависимость Н от скорости представляет собой гиперболу с некоторым минимальным значением Н и соответсвующему ему значению скорости Uопт. -- Оптимальная скорость потока. При более детальном анализе каждой составляющей диффузии можно видеть , что чем меньше частицы сорбента , тем меньше диффузия. Но уменьшение размеров частиц сорбента встречает ряд трудностей , и одна из них- необходимость создание высокого давления в системе , так как при уменьшении частиц сорбента сильно возрастает сопротивление потоку, и для сохранения прежней скорости потока необходимо повышать давление :

P=(r*u)/(d2*L); d-диаметр зерен ; видно ,что при уменьшении диаметра зерен в 2 раза ,нужно повысить давление в 4 раза для сохранения скорости разделения постоянной.

На практике для увеличения скорости разделения часто используют скорости потока , превышающие Uопт., при такой ситуации положительное влияние оказывает увеличение диффузии в подвижной фазе , и исходя из этого предпочитают брать подвижные фазы с возможно малым коэффициентом вязкости.

^ СОРБЕНТЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.

Сорбент является важнейшей частью хроматографической системы, именно от его характеристик и типа зависит возможность разделения веществ. Большое значение для кинетических характеристик имеют размеры частиц. В классической колоночной хроматографии используются сорбенты с размерами частиц 30-200 мкм ,при высоте колонке 1 м. Однако главный недостаток крупно зернистых сорбентов – большая длина диффузии внутри зерен , в этом случае приходится применять небольшие скорости движения потока . Основной путь улучшения кинетических характеристик сорбента – уменьшение толщины активного слоя .Достичь этого можно двумя путями .Первый из них заключается в том ,что на неактивное ядро (стеклянный шарик) диаметром порядка 30 мкм наносят тонкий слой сорбента 1-2 мкм – такие сорбенты получили название поверхностно-пористых сорбентов. Колонки ,заполненные такими сорбентами не оказывали большого сопротивления потоку, но однако обладали и таким недостатком как малая сорбционная емкость, так как в значительной степени состояли из неактивного материала.

Второй путь улучшения качества сорбента –уменьшение диаметра частиц вплоть до 3—10 мкм. такие сорбенты называют объемно-пористыми. Такие материалы уже создают значительное сопротивление, что приводит к необходимости применять давления порядка 400 атм. Однако при увеличении однородности частиц удается снизить рабочее давление до 50—150 атм. Несомненным достоинством объемно-пористых сорбентов является их большая емкость , что позволяет их использовать не только в аналитических целях, но и для препаративного разделения веществ.

В качестве материалов сорбентов используют самые разные вещества природного происхождения и синтетические – органические и неорганические полимеры. Прежде всего это сорбенты на основе целлюлозы, агарозы, окиси алюминия, силикагели. При химической модификации сорбента ,введением каких—либо функциональных групп можно получить сорбент с требуемыми свойствами, сродством к определенным классам соединений. В частности так получают ионообменники, если функциональная группа ионогенна. К важнейшим характеристикам сорбента также можно отнести развитость поверхности , размер пор на его поверхности. Одним из самых распространенных сорбентов является силикагель, или его многочисленные модификации. Это определяется тем ,что силикагель можно легко модифицировать, можно легко получать частицы с заданным размером частиц, размером пор, разной удельной поверхностью и т.д., к тому же сорбенты на основе силикагеля механически прочны и химически стойки. Силикагель чаще других сорбентов используют в нормально—фазовой хроматографии, благодаря взаимодействию сорбатов с полярными силанольными Si—OH и силоксановыми группами Si—O—Si .Модифицируют силикагели с помощью органилгалогенсиланов – R3—Si—Cl ,R2—SiCl2,R—SiCl3 .

Модификация происходит за счет взаимодействия ОН—групп силикагеля с галогенсиланом, в результанте чего к силикагелю присоединяется остаток силана с органическими радикалами, который и придает сорбенту необходимые специфические свойства, например анионообменник SAX:

R=(CH2)3—NR3 .- сильный анионообменник, используемый для разделения кислот. В настоящее время существует широкий спектр сорбентов с самыми разными модификациями , как правило выбор модифицирующего лиганда зависит от свойств и строения разделяемых веществ. Так если R обладает хиральностью, то на сорбенте возможно будет разделять оптические изомеры. Однако следует иметь в виду, что сорбционные свойства материала могут меняться в зависимости от подвижной фазы (растворителя).

^ Сорбенты гель-фильтрации.

Поскольку практическая часть нашей работы связана с гель-фильтрацией, остановимся кратко на материалах, с помощью которых происходит процесс разделения.

В гель-фильтрации используются в качестве сорбентов как материалы природного происхождения, модифицированные и обработанные соответствующим образом (основа как правило целлюлоза или агароза), так и разнообразные синтетические материалы (гели на основе поливинилацетата, полиакриламида). Также используют вещества неорганического происхождения- пористые стёкла и пористый силикагель. По отношению к растворителю гели разделяют на гидрофильные и гидрофобные. Гидрофильные гели активно взаимодействуют с водой , впитывая её, при этом они набухают. Гидрофильность им придают гидрофильные группы , находящиеся на поверхности гранул геля (например –OH ,-NH2 и некоторые другие). Гидрофобные гели не взаимодействуют с водой (не набухают) , зато могут хорошо набухать в органических растворителях. Гидрофильные гели могут быть превращены в гидрофобные, для этого их нужно обработать реагентом, который реагирует с поверхностными группами, меняя их природу. Также ещё гели делят на универсальные и специального назначения. Универсальные гели отличаются широким распределением пор по размеру , разделение на них может дать первичную, но очень ценную информацию. Также гели подразделяют на мягкие, полужёсткие и жёсткие ( все либо гидрофильные либо нет). Мягкие гели как правило органические вещества ,характеризуются высокой эффективностью, их фактор ёмкости (Vвн/Vсп ) равен 3. Полужёсткие гели получают полимеризацией , они обладают высокой проницаемостью , средней ёмкостью, мало увеличивают свой объём при набухании. Жёсткие- это как правило неорганические вещества, не способные набухать их фактор ёмкости в среднем 0.8-0.9. Теперь кратко рассмотрим наиболее распространённые гели.

Полидекстрановые гели.

Полидекстрановые гели типа сефадекс. Представляют собой довольно крупные молекулы пространственно разветвлённого декстрана. Хранится и перевозится в сухом виде. Окисление кислородом приводит к появлению новых карбоксильных групп, что в свою очередь становится причиной сорбции молекул вещества в неподвижной фазе. По ионообменному механизму ,это недопустимо при гель – фильтрации, поэтому водные элюенты следует деаэрировать. Сильные окислители разрушают необратимо сефадексы. Данный сорбент не растворяется в органических растворителях. Остатки борной кислоты могут образовывать комплексы с декстраном , что предполагает не использовать борную кислоту и её соли при хроматографическом процессе. Во влажном состоянии при нейтральном pH сефадексы можно стерилизовать при Т = 1100С. В сухом виде выдерживает Т = 1200С.

Сефадексы фирмы “Pharmacia” имеют маркировку G, номер означает пористость матрицы, то есть номер по сути своей описывает количество воды в мл. , которое связывает 10 грамм сухого геля,

По размерам сферических гранул различают следующие категории:

“Coarse” (100 – 300 mkm );

“Medium” (50 – 150 mkm );

“Fine” (20 – 80 mkm );

“Super fine” (10 – 40 mkm ).

В аналитическом варианте колоночной хроматографии использзуют – “Fine” и “Super fine”; “Medium” – для препаративных опытов; “Coarse” – для фракционирования свободным объемом. Аналогичные матрицы из сефадексы выпускает фирма “Reanal” (Г–10 - Г-200) и др. фирмы.

Сефакрилы представляют собой декстран, сшитый N,N – метиленбисакриламидом. Они поставляются уже набухшими, в виде густой водной суспензии. Главным её достоинством по сравнению с сефадексой – это более высокая жесткость частиц, что позволяет вести хроматографический процесс при более больших скоростях. Сефакрилы более химически стойки по сравнению с сефадексами. что даёт вести регенерацию колонок с этим сорбентом путём длительной промывки 0.2 Н NaOH. В других свойствах данный сорбент похож на сефадексу.

Основным производителем сефакрила является фирма “Pharmacia”. Выпускают 5 её типов с маркой S ( от S-200 до S-1000 ) все категории “Super fine”.

^ Гели агарозы

Сефароза представляет собой гель агарозы. Поставляется в виде суспензии, которую нельзя подсушивать. Гели её довольно жесткие, но менее чем у сефакрил. Гранулы сефарозы очень хрупкие и её нельзя использовать при Т выше 400С. Рабочий диапазон pH = 4 – 9. Её разрушают детергенты и 6М раствор гуанидинхлорида. Стерилизацию колонок с сефарозой ведут диэтилпирокарбонатом. В присутствии солей даже умеренное подкисление приводит к сужению пор и увеличению поверхности сорбции.

Сефакрилы фирмы “Pharmasia” имеют тип В с номером, показывающим процентное содержание агарозы, Гель агарозы,сшитый дибромпропанолом, имеет тип GL, Аналогичные матрицы из сефарозы выпускает фирма “Bio-Rad Labs” ( биогели серии А), фирма “LKB” ( ультрогели серии А) и др. .

^ Полиакриловые гели:

Представляют собой акриламид, прошитый N,N – метиленбисакриламидом. Хранится и перевозится в сухом виде. Пористость геля определяется концентрацией полиакриламида. Рабочий диапазон pН = 3 – 8. Это нейтральный, гидрофильный гель для работы с водными растворителями. При кипячении в водных растворах буферов при рН около 7 уже происходит гидролиз амидов. Химически менее стоек, чем сефадекс. Колонки на его основе “медленнее”, чем соответственные из сефадексы. Выдерживает меньшее давление, чем сефадекс.

Основной производитель – фирма “Bio-Rad Labs” (биогели серии Р и категории “Fine” ). Аналогичные сорбенты выпускают фирмы “LKB” (ультрогели серии АсА ) и др. фирмы.


РАСТВОРИТЕЛИ.


Как уже было сказано подвижная фаза имеет большое значение в хроматографическом процессе. Она влияет как на кинетику процесса (В.Э.Т.Т.), так и на термодинамику процесса , например , изменяя состав подвижной фазы можно менять коэффициент удерживания в 1000-10000 раз. Однако на практике используют значения к` от 1 до 20. Влияние на кинетику и термодинамику связано с тем , что подвижная фаза играет двоякую функцию. С одной стороны подвижная фаза выполняет транспортную функцию, и здесь ее химические свойства роли не играют , имеют значения лишь физические (вязкость, летучесть и д.р.)—в этом плане растворитель влияет главным образом на кинетические характеристики разделения. С другой стороны молекулы растворителя участвуют в системе термодинамических равновесий –установлении сорбционного равновесия, они взаимодействуют с сорбатами , сорбентами , и здесь уже имеют значение химические свойства растворителя( кислотность ,основность), а также его физико-химические характеристики (дип. момент) .

Получается так, что взаимодействие сорбатов с растворителем не менее важно, чем взаимодействие с сорбентом. Таким образом природа растворителя может влиять на термодинамику процесса.(к`). Необходимо помнить о том , что в ряде случаев молекулы растворителя способны к прочной сорбции , что коренным образом отражается на свойствах сорбента. Также необходимо помнить о том ,что растворитель не должен содержать взвешенных примесей, оседая в колонке они могут резко нарушить пропускную способность колонки, создавая дополнительное сопротивление потоку, меняя свойства колонки, что ведёт к невоспроизводимым результатам, поэтому необходимо фильтровать растворители через фильтры с размером пор около 0.5 мкм. Также особо важно для метода В.Э.Ж.Х., чтобы растворитель был тщательно дегазирован, особенно это касается легко летучих растворителей, так как при перепадах давления могут возникнуть пузыри пара, что также не в лучшую сторону изменит ход процесса, и будет приводить к невоспроизводимым результатам. Образование пара заставляет применять более высококипящие жидкости (t больше 60), но они как правило более вязкие , что приводит к применению более высоких давлений. В качестве ориентира следует указать величину вязкости порядка 1,5 сП, тогда скорость движения подвижной фазы ~0.4 м/с, Р~200 атм. Если все—таки нужен растворитель с большей вязкостью, то можно термостатировать колонку при t~60. Необходимо также помнить о согласовании свойств растворителя и метода детектирования. Так если применяют УФ—детектор, то растворитель должен быть прозрачным для его света, это же относиться и к ИК—детекторам. Также нужно особо тщательно следить за химической чистотой растворителя. Применительно к рефрактометрическим детекторам следует нужно сказать , что лучше использовать растворитель с минимальным коэффициентом преломления, тогда разность показателей преломления будет наибольшей , что приведет к большей точности анализа

Однако ,вернемся к рассмотрению свойств растворителя. Как уже было сказано растворитель участвует в установлении равновесия в колонке, константы взаимодействий с участием растворителя определяют определяют элюирующую способность данной подвижной фазы. Под элюирующей способностью понимают способность вымывания разделяемых веществ, сорбированных в колонке. Растворители с низкой элюирующей способностью не вымывают вещества из колонки ,или вымывают их через длительный интервал времени, растворители с высокой элюирующей способностью вымывают компоненты почти мгновенно и не разделяя. Подбор конкретного растворителя как правило производиться методом проб и ошибок, из-за отсутсвия четкой теории растворов. Понятно также ,что элюирующая способность может относиться только к какому-то конкретному веществу, - растворитель хорошо вымывающий одно вещество плохо вымывает другое, или элюирует его слишком быстро. Несмотря на отсутствие четкой теории растворов ,необходимый растворитель можно предсказать на основе его физико—химических констант, для этого существуют специальные таблицы, содержащие информацию о важнейших растворителях.

Как уже было сказано есть растворители, которые не вымывают веществ из колонки , такие растворители называют транспортными , если таким растворителем разбавить сильно активный растворитель, то его элюирующая способность снизиться. Последнее время все чаще используют не индивидуальные вещества ,а именно смеси, особенно при хроматографировании многокомпонентных систем. Однако есть правило ,согласно которому при разделении смеси из n компонентов используют смесь из n растворителей, при этом 1 из них является транспортным, а остальные n-1 активные элюенты. Использование смесей из большего числа компонентов не приводит к лучшим результатам. Зачастую к растворителям делают добавки в количестве 0.1-2% --модификаторы, они позволяют значительно улучшить хроматографический процесс. Можно найти много путей действия модификаторов в каждом конкретном случае, например, это может быть связывание наиболее активных центров на сорбенте, и как следствие стабилизации термодинамики процесса. Модификаторы могут также использоваться для создания определенного pH среды ,наиболее благоприятного для протекания разделения. В качестве модификаторов обычно используют неорганические соли, буферные добавки и т.п. , в случае гель-фильтрации вкачестве модификатора могут выступать соли (NaCl), которые подавляют ионообменную активность сорбента, которая в данном виде хроматографии является лишней, также при хроматографии белков солевые и буферные добавки создают условия для растворения белков.Особое внимание следует уделить градиентному элюированию, при котором состав подвижной фазы меняется со временем в процессе элюирования. Обычно это позволяет улучшить процесс, повысить разрешающую способность колонки, уменьшить ширину пиков, увеличить их высоту.

Как уже было сказано выбор растворителя- , задача не решаемая теоретически. Однако к настоящему времени получены некоторые практические наработки по выбору растворителя и вида хроматографии.

^ ПРЕПАРАТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

Целью нашей курсовой работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита от низкомолекулярных сопутствующих веществ. Очистка производится методом гель-фильтрации. Производство вакцины подразумевает большие объёмы веществ, много большие, чем те, с которыми приходится работать в лаборатории. Это накладывает на процесс определённые особенности, и обуславливает отделение препаративной хроматографии от аналитической. Одной из важных особенностей препаративной жидкостной хроматографии является работа со значительно большими количествами вещества - до 0.1г. на 1г. насадки, и количество очищенного материала в единицу времени может достигать 100г и выше. Надо также сказать, что выделение (очистка) веществ методом жидкостной хроматографии на сегоднейший день является сравнительно дорогой операцией. Поэтому при разработке методики важно учитывать такие факторы, как эффективность разделения, время проведения разделения (включая время подготовки процесса). Часто, стараясь сэкономить на одном (уменьшить время разделения , увеличивая количество образца), можно сильно проиграть на другом - качестве разделения, тогда конечный