Реферат: Физколлоидная и биологическая химия



Петрозаводский государственный университет

ФИЗКОЛЛОИДНАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ


Методические указания

к лабораторным работам и контрольные вопросы и задачи для студентов II курса сельскохозяйственного факультета специальности «зоотехния»


Петрозаводск 1999


Рассмотрены и рекомендованы к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и техники «биология» 25 мая 1999 г. Напечатаны по решению редакционно-издательского совета университета


Составители:

В. В. Осташкова, канд. биол. наук,

В. П. Андреев, канд. химич. наук,

М. Н. Яковлева, канд. биол. наук,

А. Г. .Анисимов, канд. биол. наук


ПРЕДИСЛОВИЕ

Настоящие методические указания содержат лабораторные работы по физколлоидной и биологической химии, выполняемые студентами II курса сельскохозяйственного факультета специальности «зоотехния» в процессе изучения предмета. На лабораторных занятиях студенты овладевают методами экспериментальных исследований, закрепляют теоретические знания, анализируют полученные на практических занятиях результаты. В каждой лабораторной работе излагаются цель и задачи, поставленные перед студентом, принцип используемого метода, ход работы, предлагается проанализировать результаты проведенных исследований и сделать выводы. Представленные в конце каждого раздела вопросы и задачи способствуют лучшему усвоению теоретического материала при самоподготовке.

^ ФИЗИЧЕСКАЯ И КОЛЛОИДНАЯ ХИМИЯ

Работа 1. Определение рН растворов

Величина рН = - lg[Н+] является характеристикой, показывающей концентрацию протонов в растворах:

в нейтральной среде [Н+] =10-7 моль/л ; рН =7,

в кислой среде [Н+]>10-7 моль/л ; рН <7,

в щелочной среде [Н+]<10-7 моль/л ; рН >7

Различают общую и активную кислотность. В разбавленных растворах сильных кислот, в которых степень диссоциации () равна единице, концентрация водородных ионов равна общей концентрации кислот.

В растворах слабых кислот концентрация ионов меньше общей концентрации вещества и по мере разбавления раствора приближается к ней. Поэтому

[Н+] =  Со,

где Со - общая концентрация кислоты.

Так как кислотные свойства обусловлены ионами водорода, в растворе слабой кислоты только та ее часть является активной, которая распалась на ионы. Таким образом, активная кислотность определяется активностью (концентрацией) водородных ионов и характеризуется величиной рН.
^ Опыт 1. Определение активной кислотности
Определите рН 0,01н растворов уксусной и соляной кислот с помощью универсального индикатора. Объясните полученные результаты.
^ Опыт 2. Определение общей кислотности
С помощью мерных пипеток внесите в одну колбочку 5 мл

0,01н раствора соляной кислоты, а в другую – 5 мл 0,01н раствора уксусной кислоты. Добавьте в обе колбочки по 1-2 капли раствора фенолфталеина и титруйте их содержимое 0,01н раствором NаОН до появления слабо-розовой окраски. Объясните полученные результаты.

Методы определения рН растворов и биологических жидкостей делятся на две группы:

1. Колориметрические, или непрямые, методы.

2. Электрометрические, или прямые, методы.

Из этих методов наиболее простыми и распространенными являются колориметрические методы определения рН, основанные на свойстве кислотных и основных индикаторов изменять свою окраску в зависимости от активности ионов водорода (рН) в растворе.

HInd  H+ + Ind- (или IndOH  Ind+ + OH-),

где HInd или IndOH - молекулярная форма индикатора;

Ind- или Ind+ - ионная форма индикатора.

Индикаторы бывают одноцветные (фенолфталеин - анион окрашен, молекула бесцветна) и двухцветные (лакмус, метилоранж - анион и молекула окрашены в разные цвета). Например, в нейтральном растворе фенолфталеина равновесие сдвинуто влево и бесцветная молекулярная форма преобладает над ионной:

HInd --- H+ + Ind-

бесцветная малиново-красная

форма форма


Добавление в раствор щелочи вызовет смещение равновесия вправо и появление окрашенной ионной формы. pH среды, при котором индикатор диссоциирован наполовину, называется точкой перехода окраски индикатора. В точке перехода индикатор имеет промежуточную окраску. Область между двумя значениями рН, в пределах которой происходит заметное на глаз изменение окраски индикатора, называется зоной перехода окраски индикатора.

В настоящее время для приближенного определения рН растворов применяют универсальный индикатор (или универсальную индикаторную бумагу), который представляет собой смеси индикаторов с разными, но примыкающими друг к другу интервалами перехода окраски. Этот метод грубый (точность 0,5 рН), но довольно быстрый. Обычно зона перехода окраски индикатора лежит в пределах двух единиц рH, т.е. на единицу выше и на единицу ниже точки перехода:

рH = pKInd+  1,

где KInd - константа диссоциации индикатора.

Колориметрические методы определения рН делятся на две группы: буферные и безбуферные.
^ Буферный метод определения рН
Принцип. Одинаковый объем индикатора добавляют к исследуемой жидкости и к стандартным буферным растворам с различными значениями рН и находят, в каком из буферных растворов индикатор имеет такую же окраску, как и в исследуемой жидкости. Совпадение окраски исследуемой жидкости с одним из буферных растворов возможно только при одинаковой степени диссоциации индикатора в них, а следовательно, и при одинаковом значении рН.


^ Опыт 3. Определение рН прозрачных растворов

буферным методом

С помощью универсального индикатора и цветной шкалы ориентировочно устанавливают величину рН исследуемой жидкости. По таблице подбирают индикатор, в зоне перехода окраски которого находится найденное значение рН исследуемой жидкости.

Например, если приблизительное значение рН=7,0, его зона перехода равна 6,0-7,6.

^ Ход выполнения работы. В восемь пробирок одинакового цвета и диаметра вносят по 2 мл буферных растворов с различным значением рН и в девятую пробирку - такое же количество исследуемой жидкости. Затем во все пробирки прибавляют по 2-3 капли выбранного индикатора, перемешивают и среди буферных растворов находят такой, цвет которого совпадает с цветом исследуемой жидкости. Зная рН буферного раствора устанавливают рН жидкости, взятой для анализа.


Безбуферный метод определения pH с помощью набора

индикаторов. Метод Михаэлиса

Принцип. Значение pH определяют сравнением интенсивности окраски исследуемой жидкости, содержащей определенный объем одноцветного индикатора, с окраской эталонных образцов Михаэлиса, содержащих тот же индикатор равного объема.
^ Опыт 4. Определение pH прозрачных растворов безбуферным
методом

С помощью универсального индикатора и цветной шкалы ориентировочно устанавливают величину pH исследуемой жидкости. По таблице подбирают одноцветный индикатор (нитро- или динитрофенол), в зоне перехода окраски которого находится найденное значение pH исследуемой жидкости (см. опыт 3).

Затем в пробирку отмеряют 6 мл исследуемой жидкости и прибавляют 1 мл соответствующего индикатора. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и подбирают одинаковый по окраске эталон из ряда этого же индикатора. Значение pH на этикетке данного эталона соответствует pH исследуемого раствора.
^ Потенциометрический метод определения pH растворов
В настоящее время большое значение приобрел потенциометрический метод, который позволяет быстро и точно ( 0,1 pH) определять значения pH даже при исследовании мутных и окрашенных растворов. Этот метод определения концентрации ионов водорода (pH растворов) основан на измерении электродвижущей силы (ЭДС) гальванического элемента, для которого потенциал одного электрода известен (электрод сравнения). Второй электрод (индикаторный) выбирается таким образом, чтобы величина его потенциала зависела от pH данного раствора.

^ Опыт 5. Определение pH прозрачных и мутных растворов
с помощью pH-метра

Колориметрические методы определения pH недостаточно точны, а при наличии мутных систем совсем непригодны. Поэтому для этой цели лучше использовать pH-метры.

По стандартному буферному раствору калибруют pH-метр, промывают электроды дистиллированной водой, подсушивают фильтровальной бумагой или ополаскивают исследуемым раствором и определяют pH анализируемого раствора.

Сравните значения pH, полученные для одного и того же раствора с помощью универсального индикатора, буферного и безбуферного методов, pH-метра.


Таблица индикаторов


Индикатор

Зона перехода

в единицах рН

Изменение цвета





Двухцветные




Метиловый желтый (парадиметиламино-

азобензол)

2,9 - 4,0

Красный - желтый

Конго красный

3,5 - 5,2

Сине-фиолетовый -

красный

Метиловый оранжевый

3,1 - 4,4

Малиновый - желтый

Ализариновый красный (1--й переход)

3,7 - 5,2

Желтый -

сиренево-розовый

Метиловый красный

4,4 - 6,2

Красный - желтый

Бромкрезоловый пурпурный

5,2 - 6,8

Желтый -

фиолетово-красный

Бромтимоловый синий

6,0 - 7,6

Желтый - синий

Нейтральный красный

6,8 - 8,0

Красный - желтый

Ализариновый красный (2-й переход)

10,0 - 12,0

Сиренево-розовый -

бледно-желтый



Одноцветные



-динитрофенол

2,3 - 4,5

Бесцветный - желтый

-динитрофенол

4,0 - 5,4

Бесцветный - желтый

-нитрофенол

5,2 - 7,0

Бесцветный - желтый

m-нитрофенол

6,8 - 8,4

Бесцветный - желтый

фенолфталеин

8,2 - 10,5

Бесцветный - малиновый



Работа 2. Буферные растворы

Буферными называются растворы, представляющие собой смесь слабой кислоты и ее соли с сильным основанием или слабого основания и его соли с сильной кислотой. Они способны сохранять постоянным рН при разведении и добавлении небольших количеств сильных кислот или оснований. Такая способность системы противодействовать изменению рН называется буферным действием и количественно характеризуется буферной емкостью.

Буферная емкость определяется количеством миллиграмм-эквивалентов сильной кислоты или щелочи, которое необходимо добавить к 1 литру буферного раствора, чтобы изменить рН на единицу. Буферные системы имеют большое значение для живых организмов, так как принимают участие в поддержании постоянства рН тканей и биологических жидкостей.
^ Опыт 1. Приготовление буферных растворов
В шесть пробирок с помощью мерных пипеток вносят 0,1 н раствор уксусной кислоты и 0,1н раствор ацетата натрия в количествах, указанных в таблице, добавляют по 3 капли универсального индикатора и определяют приблизительное значение рН по цветной шкале, которое записывают в таблицу.




проби-рок

0,1 н раствор СН3СООН

(мл)

0,1 н раствор СН3СООNa (мл)

Вычислите значения рН

Найденное в опыте значение рН

1













2













3













4













5













6













Содержимое пробирок № 4 и № 6 оставляют для опыта 2.

Сопоставляют значение рН, найденное в опыте, с вычисленным по формуле:

рН = рКа + lg [соль] / [кислота]

Константа диссоциации уксусной кислоты равна 1,8610-5, а степень диссоциации 0,1н раствора уксуснокислого натрия составляет 0,79.
^ Опыт 2. Влияние кислоты и щелочи на рН буферного раствора
В пробирку № 6 (опыт 1) прибавляют 4 капли 0,1н раствора соляной кислоты, а в пробирку № 1 - 4 капли 0,1н раствора едкого натра. Цвет растворов практически не изменяется. Следовательно, небольшие количества кислоты и щелочи почти не изменяют рН буферного раствора.
^ Опыт 3. Влияние разведения на рН буферного раствора В три пробирки вносят соответственно 6 мл, 3 мл и 2 мл буферного раствора с рН = 5. Во вторую пробирку добавляют 3 мл, а в третью - 4 мл воды. Во все пробирки прибавляют по 3 капли раствора индикатора метилового красного. Окраска всех растворов одинакова. Следовательно, разведение не изменяет значительно рН буферного раствора.
Опыт 4. Определение буферной емкости растворов

В колбу вносят 10 мл буферного раствора с рН=5 и, добавив 3 капли раствора метилового красного, титруют 0,1н раствором едкого натра до появления желтой окраски раствора (рН=6,0). Вычисляют буферную емкость ацетатной смеси, как указано ниже.

Пример расчета: если на титрование 10 мл буферной смеси пошло 4,8 мл щелочи, то на титрование 1 л смеси пойдет объем щелочи, равный V мл:

V = 4,81000/10 = 480 мл.

Буферная емкость или число миллиграмм-эквивалентов щелочи В, содержащееся в данном объеме, рассчитывается по формуле:

В = NV,

где N - нормальность щелочи, или ее количество (мгэкв) в 1 мл (в данном случае N = 0,1).

В = 0,1480 = 48.
^ Опыт 5. Влияние разведения на буферную емкость
В колбу вносят 1 мл буферного раствора (рН=5), 9 мл воды и 3 капли раствора метилового красного. Определяют буферную емкость этого раствора, как описано в опыте 4. Сравнивают ее значение с величиной буферной емкости неразбавленного буферного раствора и делают соответствующие выводы.

Опыт 6. Определение буферной емкости плазмы крови

Буферная емкость плазмы крови обусловлена наличием бикарбонатной (H2CO3/NaHCO3), фосфатной (NaH2PO4/Na2HPO4) и белковой буферных систем.

В две колбочки вносят по 5 мл плазмы (рН=7,36). В одну колбочку добавляют 2 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,1н раствором едкого натра до появления слабо-розового окрашивания (рН=8,4). В другую колбочку добавляют 2 капли раствора индикатора бромкрезолового пурпурного и титруют 0,1н раствором соляной кислоты до появления синевато-фиолетовой окраски (рН=6,4). Вычисляют буферную емкость плазмы по отношению к щелочи и кислоте, как описано в опыте 4.

Обратите внимание на то, что буферная емкость плазмы крови по отношению к кислоте является более высокой, чем по отношению к щелочи.

Работа 3. Методы получения коллоидных систем

(гидрофобные и гидрофильные золи и эмульсии)

Системы, изучаемые физической химией, - это молекулярные (ионные) или истинные растворы, то есть гомогенные смеси нескольких веществ. Они состоят из сравнительно небольших частиц (ионов, атомов, молекул) с размерами 10-7 см.

Коллоидная химия - это наука о физико-химических свойствах гетерогенных высокодисперсных (10-7 - 10-5 см) систем и растворов высокомолекулярных соединений. Однако она изучает и грубодисперсные системы (10-5 - 10-2 см) - суспензии, пены, эмульсии, порошки. К ним, в частности, относятся многие продукты питания (творог, сыры, хлеб, мука, сливочное масло, соки), а также моющие средства, пасты, краски, строительные материалы (цемент, алебастр) и др.

Коллоидные растворы (золи) занимают промежуточное положение между грубодисперсными и молекулярными системами. Поэтому их можно получать двумя методами: либо дроблением крупных кусков вещества до требуемой дисперсности (диспергирование), либо объединением молекул или ионов в агрегаты коллоидных размеров (конденсация).
^ Диспергационные методы получения золей
Эти методы включают механическое, электрическое или ультразвуковое дробление и требуют затрат энергии. К ним также относится и метод пептизации - получение золей из рыхлых свежеприготовленных осадков. Например, при адсорбционной пептизации добавленные к осадку электролиты адсорбируются на поверхности частиц осадка, сообщают им заряд и таким образом способствуют переходу их во взвешенное состояние.

Следует отметить, что при пептизации степень дисперсности фактически не изменяется, так как частицы рыхлого осадка уже имеют коллоидные размеры.

^ Опыт 1. Получение золя гидрата окиси железа

методом адсорбционной пептизации

В пробирку наливают 2-3 мл 2%-го раствора FeCl3 и прибавляют 4-5 капель 10%-го раствора гидрата окиси алюминия. Образовавшийся осадок отфильтровывают и отмывают от хлористого аммония и избытка аммиака 3-4 раза дистиллированной водой (до исчезновения запаха). Воронку с промытым осадком переносят в чистую пробирку и добавляют 2-3 мл теплого раствора FeCl3 (пептизатор). Через фильтр проходит прозрачный красно-бурый золь гидрата окиси железа. Определите заряд золя (см. опыт 8).
^ Опыт 2. Получение эмульсии жира в воде Эмульсией называется дисперсная система, состоящая из взаимно нерастворимых жидких фаз. Вещества, образующие различные фазы, должны сильно отличаться по своей полярности. Как правило, эмульсии являются грубодисперсными системами, устойчивыми только в присутствии эмульгаторов (стабилизаторов).
В пробирку, заполненную наполовину дистиллированной водой, добавляют несколько капель растительного масла. Встряхивание ее содержимого приводит к образованию нестойкой (расслаивающейся) эмульсии. Добавьте в пробирку несколько капель раствора мыла. После взбалтывания смеси образуется стойкая (нерасслаивающаяся) эмульсия.

Стабилизирующее действие мыла вызывается тем, что его молекулы адсорбируются на поверхности капелек масла, ориентируясь группами СООNa к воде. В результате диссоциации капельки приобретают отрицательный заряд, что препятствует их слипанию.
^ Конденсационные методы получения золей
Диспергационными методами достичь высокой дисперсности обычно не удается. Системы с размерами частиц 10-6 - 10-7 см получают конденсационными методами, не требующими затраты внешней работы.

Важнейшие физические методы получения дисперсных систем - конденсация из паров (например, образование тумана) и смена растворителя.

^ Опыт 3. Получение золя канифоли (или серы)

методом замены растворителя

В пробирку наливают 4-5 мл воды, добавляют 1-2 капли насыщенного раствора канифоли (или серы) и содержимое пробирки энергично перемешивают. Образуется прозрачный опалесцирующий золь. Канифоль и сера растворимы в спирте, но нерастворимы в воде. При замене спирта водой молекулы растворенного вещества соединяются в агрегаты коллоидных размеров.

Методы химической конденсации также основаны на выделении новой фазы из перенасыщенного раствора. Однако в отличие от физических методов вещество, образующее дисперсную фазу, появляется в результате химической реакции.

^ Опыт 4. Получение золя гидрата окиси железа

методом гидролиза

В пробирку с кипящей водой добавляют по каплям 2%-й раствор FeCl3 до образования прозрачного красно-бурого золя гидрата окиси железа.

Под действием высокой температуры равновесие реакции гидролиза хлорида железа (Ш) сдвигается в сторону образования гидроокиси железа.

FeCl3 + 3H2O  Fe(OH)3 + 3HCl

Продукты гидролиза взаимодействуют друг с другом по следующей схеме:

Fe(OH)3 + HCl = FeOCl + 2H2O

оксохлорид железа (III)

FeOCl = FeO+ + Cl-

Строение образовавшихся мицелл схематически можно изобразить следующей формулой:

{ m[Fe(OH)3] nFeO+ (n-х)Cl-}Х+ хCl-

Определите знак заряда золя (см. опыт 8).

^ Опыт 5. Получение золя йодистого серебра

реакцией двойного обмена

В пробирку вносят 3-4 мл 0,01н раствора азотнокислого серебра и перемешивают. Образуется желтоватый опалесцирующий золь йодистого серебра.

Строение мицеллы в этом случае выражается следующей формулой:

{ m[AgI] nI- (n-х)K+}Х- хK+

Определите знак заряда золя (см. опыт 8)

Если взять KI и AgNO3 в обратном соотношении, то получится положительный золь йодистого серебра.
^ Опыт 6. Получение золя берлинской лазури
В пробирку наливают 4-5 мл 0,1%-го железосинеродистого калия и прибавляют 1-2 капли 2%-го раствора хлорида железа (Ш). Образуется золь берлинской лазури синего цвета.

3K4[Fe(CN)6] + 4FeCl3  Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl.

Его мицеллы имеют следующее строение:

{m Fe4[Fe(CN)6]3 n[Fe(CN)6]4- (4n-х)K+}x- xK+.

Определите знак заряда золя (см. опыт 8).

Опыт 7. Получение золя железистосинеродистой меди [гексацианоферрат (П) меди] реакцией двойного обмена

К 10 мл 0,1%-го раствора K4[Fe(CN)6] приливают 1 мл 1%-го раствора CuSO4. Полученный золь имеет коричнево-красный цвет.

2CuSO4 + K4[Fe(CN)6]  Cu2[Fe(CN)6] + 2 K2SO4.

Определите знак заряда золя (см. опыт 8). Напишите формулу мицеллы, если в избытке CuSO4.
^ Опыт 8. Определение знака заряда частиц золей
В окрашенных золях знак заряда частиц можно определить методом капиллярного анализа. Он основан на том, что целлюлозные стенки капилляров фильтровальной бумаги заряжаются отрицательно, а пропитывающая бумагу вода - положительно.

Нанесите на листок фильтровальной бумаги каплю исследуемого золя. После всасывания капли золь с положительно заряженными частицами адсорбируется на бумаге и дает окрашенное в центре и бесцветное по краям пятно; золь с отрицательно заряженными частицами не адсорбируется бумагой и образует равномерно окрашенное пятно.
^ Опыт 9. Получение золя мыла
Налейте в пробирку 10 мл дистиллированной воды и, добавляя небольшие кусочки настроганного мыла, интенсивно взбалтывайте ее. В начале (при малых концентрациях мыла) образуется истинный прозрачный раствор со щелочной реакцией (рН>7). С увеличением концентрации часть молекул мыла и молекул высших карбоновых кислот (получающихся в процессе гидролиза) будет конденсироваться. Это заметно по опалесценции раствора. Определите рН раствора при растворении мыла. В дальнейшем система становится грубодисперсной, мутной.

^ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

РАЗДЕЛ 1

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ


РАБОТА 1. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОКРАШЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТВОРАХ. ПРИНЦИП И ТЕХНИКА КОЛОРИМЕТРИРОВАНИЯ. УСТРОЙСТВО И ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2

^ Цель работы: ознакомиться с одним из наиболее распространенных в биохимии методов количественного определения веществ в исследуемом растворе.

Задачи:

ознакомиться с основными принципами и правилами работы на КФК-2;

измерить оптическую плотность двух окрашенных растворов;

подобрать наиболее оптимальную длину волны и размер кюветы для определения оптической плотности предложенных растворов.


Изменение состояния светового потока различного характера, вызванное его взаимодействием с физическим телом (с растворами или мутными взвесями), называется фотоэффектом. В зависимости от характера возникающих изменений выделяется несколько видов фотометрии (колориметрия, нефелометрия, турбидиметрия, флуориметрия, рефрактометрия, поляриметрия и др.). Фотометрические методы анализа характеризуются высокой чувствительностью, достигающей 10-4-10-6% определяемого элемента в твердых образцах и 10-5-10-7% - в водных растворах. Колориметрический метод получил самое широкое распространение среди биохимических методов количественного определения веществ в биологических объектах.

^ Принцип метода

В основе этого метода лежит закон Ламберта – Меера - Бера (1852), согласно которому существует прямо пропорциональная зависимость между концентрацией вещества в окрашенном растворе и степенью поглощения лучей света данным раствором. Интенсивность поглощения света зависит не только от количества и природы растворенного вещества, но и от толщины слоя раствора, длины волны падающего света, температуры раствора.

Степень поглощения света окрашенным раствором выражается оптической плотностью (экстинцией), под которой понимают отношение интенсивности света, падающего на раствор, к интенсивности света, прошедшего через раствор. Величина оптической плотности обозначается буквой Е или D. Чем больше оптическая плотность, тем меньше света пропускает раствор, то есть между оптической плотностью и светопропусканием существует обратно пропорциональная зависимость. Для определения оптической плотности или светопропускания используют фотоэлектро-колориметры.


^ 1.Устройство фотоэлектроколориметра КФК-2

Колориметр фотоэлектрический концентрационный (КФК-2) предназначен для количественного определения веществ в окрашенных растворах по их оптической плотности или коэффициенту светопропускания в диапазоне волн 315-980 нм. КФК-2 состоит из оптического блока (передняя часть прибора), где находятся осветитель, светофильтр, оптика, кюветное отделение, фотометрическое устройство и регистрирующий прибор, и блока питания (задняя часть), где расположен стабилизатор напряжения с выпрямителем и силовой трансформатор.

Источником света в колориметре служит галогенная лампа. Приемниками излучения являются фотоэлемент Ф-26 для работы в диапазоне волн 315-540 нм и фотодиод ФД-24К для работы в специальном диапазоне 590-980 нм.

Световой поток лампы с помощью специальных устройств конденсируется, усиливается и проходит через светофильтр, кювету с исследуемым раствором и падает на приемник излучения. При этом световое излучение преобразуется в электрические сигналы, которые подаются на измерительный прибор. Показания микроамперметра пропорциональны световому потоку, проходящему через исследуемый раствор.


^ Выбор светофильтра

При проведении фотоэлектроколориметрии следует учитывать, что в данном методе используется монохроматический свет, причем различных длин волн. Для преобразования полихроматического света в монохроматический используются светофильтры. В КФК-2 имеется набор из 11 светофильтров. Использование конкретного светофильтра позволяет пропускать через раствор лучи определенной длины, поглощение которых наиболее характерно для исследуемого вещества. Обычно эффективная длина волны и цвет светофильтра указаны в применяемом методе. Если же такой ссылки нет, то выбрать нужный светофильтр можно с помощью таблицы.

Таблица

Окраска исследуемого раствора

Цвет нужного светофильтра

Длина волны пропускаемого света, нм

желтая

синий

420 - 450

оранжевая

синий

430 – 460

красная

зеленый

460 - 500

пурпурная

зеленый

490 - 530

синяя

оранжевый

590

сине-зеленая

красный

600 - 650

голубая

красный

750

сине-фиолетовая

красный

750


Примечание. Выбор светофильтра по данной таблице весьма ориентировочный, так как некоторые растворы одинакового цвета могут избирательно поглощать лучи с различной длиной волны. Поэтому при подборе светофильтра желательно знать спектр поглощения исследуемого вещества, причем выбор его осуществляют таким образом, чтобы он пропускал лучи с длиной волны, максимально поглощаемой исследуемым раствором. Таким образом, при выборе светофильтра оптимальной длиной волны окажется та, при прохождении которой через исследуемый раствор оптическая плотность будет максимальной.


^ 3. Подбор кювет

Известно, что чем толще слой жидкости, через который проходит луч света, тем больше будет поглощение светового пучка и тем выше показание оптической плотности исследуемого раствора. К колориметру прилагается набор кювет, отличающихся расстоянием между рабочими гранями, через которые проходит световой поток. Это расстояние (в мм) указано на одной из рабочих граней. На боковой стенке кювет имеется метка, до которой необходимо наливать жидкость. При работе с летучими растворами кюветы закрывают специальными крышками.

К каждому прибору прилагается набор кювет с толщиной слоя исследуемого раствора от 1 до 50 мм. Подбор кювет осуществляется таким образом, чтобы оптическая плотность исследуемого раствора не была ниже величины 0,15 и выше 0,7. Именно в этих пределах наиболее точно выполняется закон Ламберта – Меера - Бера. Следовательно, при интенсивной окраске раствора необходимо взять кюветы с меньшим расстоянием между рабочими гранями, а при слабой окраске - с бльшим расстоянием.


^ 4. Общая схема прибора и обозначения


1  Рукоятка установки светофильтра (около рукоятки маркировка по длине волны).

2 - Ручка перемещения кювет в кюветном отделении.

3 - Ручка включения чувствительности фотоприемников (обозначена цифрами 1, 2 и 3 черного цвета при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм и красного цвета - в диапазоне от 590 до 980 нм).

4 - Микроамперметр, имеет две шкалы: по верхней измеряют коэффициент светопропускания (от 0 до 100%), а по нижней - оптическую плотность раствора (от 0 до 1,5).

5 - Ручка «грубой» настройки микроамперметра.

6 - Установка «точной» настройки микроамперметра.

7 - Крышка кюветного отделения.


5. Правила работы на КФК-2

I. Подготовка прибора к работе

Установить нужный светофильтр (рукоятка 1).

Рукоятку 3 (чувствительность фотоэлемента) установить на цифру 1 соответствующего цвета: при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм чувствительность обозначена цифрами черного цвета и в диапазоне от 590 до980 нм - красного цвета.

Проверить, выключен ли микроамперметр (рукоятки 5 и 6 должны быть повернуты до отказа влево).

Прибор включить (вилку в сеть; тумблер, расположенный на задней стенке в нижнем левом углу, переключить в положение «вкл»). При этом загорается лампочка накаливания.

Прибор прогреть в течение 15-20 минут.

^ II. Измерение оптической плотности раствора

Кювету с контролем или растворителем поставить в дальнее (от исследователя) гнездо кюветодержателя; кювету с исследуемым раствором (опытом) - в ближнее гнездо кюветодержателя.

Кювету с контролем (или растворителем) поместить в световой поток поворотом ручки 2 до отказа влево.

Закрыть крышку кюветного отделения (7).

Установить стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале поворотом ручки 5 («грубой» настройки). В случае необходимости воспользоваться ручкой 6 («точной» настройки).

Примечание. Если не удается вывести стрелку микроамперметра на 0, то необходимо повысить чувствительность фотоэлемента. Для этого необходимо:

а) микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево);

б) рукоятку переключения чувствительности фотоэлемента (3) поставить на цифру 2 соответствующего цвета;

в) вывести стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале (то есть повторить действия, указанные в пункте 4).

Если и в этом случае стрелка микроамперметра не выводится на 0, необходимо еще раз повысить чувствительность фотоэлемента, повторяя все действия, перечисленные в пунктах «а», «б» и «в», но установив рукоятку 3 на цифру 3 соответствующего цвета.

5. Заменить в световом потоке кювету с контролем на кювету с исследуемым раствором (опытом), поворачивая рукоятку 2 до отказа вправо.

Записать величину оптической плотности исследуемого раствора по нижней шкале микроамперметра.

Микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево).

III. Завершение работы на приборе

Реактивы из кювет вылить.

Кюветы сполоснуть дистиллированной водой и поставить в чашку Петри вверх донышком (кюветы необходимо полоскать только после полного завершения работы или методики, в промежутках между отдельными измерениями этого делать не следует !).

Прибор выключить (тумблер, расположенный на задней стенке в левом углу, переключить в положение «выкл.»; вилку вынуть из розетки).

Крышку кюветного отделения закрыть.

Примечание. При работе на КФК-2 необходимо соблюдать следующие правила:

До включения прибора в сеть проверить заземление.

Не оставлять прибор включенным без надобности.

Следить за чистотой прибора, не проливать реактивы, не хлопать крышкой кюветного отделения.

Особенно осторожно обращаться с кюветами.

При смене светофильтра работу продолжать не ранее чем через 5 минут.

При переключении светофильтров и замене кювет в кюветодержателе микроамперметр должен быть выключен (рукоятки 5 и 6 должны находиться в крайнем левом положении!).


^ 6. Определение концентрации вещества в растворе

по оптической плотности

Определение концентрации вещества в окрашенном растворе по оптической плотности можно осуществить двумя способами - путем сравнения с оптической плотностью стандартного раствора (такой способ используется, например, в ортотолуидиновом методе определения глюкозы в крови) или, более точно, в результате построения калибровочной кривой. В этом случае готовят ряд растворов определяемого вещества с известными концентрациями (стандартные растворы), проделывают с ними необходимые химические реакции и измеряют на ФЭКе их оптическую плотность. Полученные результаты отражают графически, откладывая по оси абсцисс концентрацию вещества, а по оси ординат - соответствующую ей оптическую плотность. Определив оптическую плотность исследуемого раствора, находят по калибровочной кривой содержание в нем вещества.


^ Результаты проведенных исследований оформляют в виде таблицы:


Длина волны

Цвет светофильтра

Е голубого раствора

Е желтого раствора


















































Выводы:


РАЗДЕЛ 2

^ СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ

2. 1. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ

Анализ аминокислотного состава белков можно осуществлять несколькими способами. Присутствие тех или иных аминокислот может быть выявлено с помощью цветных реакций на белок, а также в результате кислотного его гидролиза и последующего разделения полученной смеси аминокислот методом хроматографии.


^ РАБОТА 2. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

Цель работы: ознакомиться с основными наиболее распространенными цветными реакциями на белки и доказать, что с их помощью можно выявить сходство и различия в аминокислотном составе исследуемых белков (яичный альбумин и желатин).

Задачи:

провести цветные реакции на белки с раствором яичного альбумина и желатина;

показать, что существуют универсальные цветные реакции, которые дают все белки, независимо от их аминокислотного состава, и специфические цветные реакции на определенные аминокислоты, позволяющие выявить различия в исследуемых белках;

сравнить результаты проведенных исследований и сделать выводы;

отметить, какие из проведенных реакций являются универсальными, а какие - специфическими.

Цветные реакции на белки являются качественными реакциями, обусловленными специфическими группами - радикалами. Некоторые из таких реакций широко используются в биохимической практике для изучения структуры и аминокислотного состава белков, их количественного определения.


^ 1. Биуретовая реакция (на обнаружение

пептидных связей в белках)

Принцип метода. Белки (пептиды) в щелочном растворе в присутствии солей меди (II) образуют комплексные ее соединения, окрашенные в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет.

Для пептидной (амидной) группы характерна лактам-лактимная таутомерия:


В щелочной среде преобладающая лактимная (енольная) форма полипептида взаимодействует с медью с образованием стабильного окрашенного комплекса:


^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка (желатина, яичного белка или сывороточного албумина) добавляют 1 мл 10%-го раствора щелочи (NaOH или KOH) и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание.

^ 2. Нингидриновая реакция (на аминогруппу,

находящуюся в -положении)

Принцип метода. Белки, полипептиды и свободные -аминокислоты при нагревании реагируют с нингидрином (трикетогидринден-гидратом) с образованием продукта конденсации, окрашенного в фиолетовый цвет:


а)


окисленный нингидрин восстановленный нингидрин


окисленный восстановленный продукт конденсации

нингидрин нингидрин (фиолетово-синего

цвета)

^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка прибавляют 0,5 мл 0,5%-го раствора нингидрина и нагревают до кипения. Появляется
еще рефераты
Еще работы по разное