Реферат: Методические указания к лабораторным и практическим занятиям студентам аграрного института

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕССКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ


Кафедра технологии производства продуктов животноводства


МИКРОБИОЛОГИЯ


МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным и практическим занятиям студентам

аграрного института


Черкесск – 2010

Составлены на основе примерной и рабочей программ по курсу «Микробиология» в соответствии с Государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования по специальности 110305 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции» и 110201 «Агрономия» (2000 г.).


Обсуждены на заседании кафедры ТППЖ (протокол № 9 от 2.07.2009 г.)


Утверждены методической комиссией Аграрного института (протокол №6 от 05.05.2009 г.). Опубликованы по решению учебно-методического совета Карачаево-Черкесской государственной технологической академии (протокол № 2 от 18.02.2010г.)


Составители: кандидат биологических наук, доцент Меремкулова Р.Н., кандидат сельскохозяйственных наук, доцент ^ Саитова Ф.Н., ассистент Абалмасова О.В.


Рецензенты: Хубиева О.П. – кандидат биологических наук

доцент кафедры «Агрономия»


Пешков А.Д. – кандидат ветеринарных наук

доцент кафедры «ТППЖ»

Редактор: к. с.-х. наук, доцент Гочияев Х.Н.

Содержание

Введение……………………………………………………………………….. 6

Правила по технике безопасности……………………………………………. 6

Микроскопия……………………………………………………………….. 7

1.1.Светопольная микроскопия……………………………………………. .7

1.1.1. Устройство микроскопа……………………………………………… 7

Работа с микроорганизмами ………………………………………………. 8

2.1.Методы приготовления препаратов…………………………………..... 8

2.1.1.Техника взятия культуры для препаратов…………………………… 8

2.1.2. Исследование живых клеток микроорганизмов методом раз-

давленной капли……………………………………………………….. 8

2.1.3. Фиксированные препараты микроорганизмов……………………… 9

Исследование морфологии микроорганизмов………………………………….. 10

3.1.Форма клеток …………………………………………………………………10

3.1.1.Бактерии …………………………………………………………………….10

3.1.2.Актиномицеты ………………………………………………………………11

3.1.3. Дрожжи ……………………………………………………………………..11

Химические методы исследования ………………………………………...11

3.2.1.Окраска клеток микроорганизмов по Граму ………………………………..11

3.2.2.Окраска спор у бактерий …………………………………………………….12

Культивирование микроорганизмов…………………………………………........14

4.1.Питательные среды…………………………………………………………….14

4.1.1.Приготовление питательных сред……………………………………….........14

4.2. Методы стерилизации ………………………………………………………..15

4.2.1. Фламбирование, или прокаливание …………………………………………15

4.2.2. Стерилизация сухим жаром ………………………………………………...15

4.2.3. Стерилизация текучим паром ………………………………………………..15

4.2.4. Стерилизация насыщенным паром под давлением ………………………….16

4.2.5. Пастеризация …………………………………………………………………16

Учет численности и выделение чистой культуры микроорганизмов……………..17

5.1. Методы учета численности микроорганизмов ……………………………….17

5.1.1. Учет численности микроорганизмов ( КОЕ ) в почве методом пита-

тельных пластин в сочетании с методом последовательных разведений……...17

5.1.2. Учет численности КОЕ в воде и других жидкостях ………………………...19

5.2. Выделение чистой культуры бактерий ………………………………………...19

Превращение микроорганизмами безазотистых органических веществ……......... 20

6.1. Брожения ……………………………………………………………………… 20

6.1.1. Спиртовое брожение ……………………………………………………....... 20

6.1.2. Молочнокислое брожение ………………………………………………….. 22

Общий микробиологический анализ почвы…………………………………......... 25

7.1. Подготовка материала для анализа …………………………………………... 25

7.1.1. Взятие средней почвенной пробы и подготовка образца ………………….. 25

7.1.2. Приготовление почвенной суспензии и посев …………………………….... 25

7.2. Состав и приготовление питательных сред для разных групп микро-

организмов …………………………………………………………………… 27

7.2.1. Группы микроорганизмов, выделяемые на плотных средах ……………... 27

7.2.2. Группы микроорганизмов, выделяемые на жидких средах

( метод предельных разведений ) ………………………………………….. 28

7.3. Определение численности различных групп микроорганизмов……………. 28

7.3.1. Учет на плотных средах …………………………………………………… 28

7.3.2. Учет на жидких средах ……………………………………………………. 30

7.3.3. Определение общей численности микроорганизмов в почве методом

прямого счета под микроскопом …………………………………………..32



Эпифитные микроорганизмы зерна…………………………………………...........33

8.1. Общие сведения ………………………………………………………………33

8.1.1. Количественный учет КОЕ на зерне ………………………………………..34

Микробиологический анализ силоса……………………………………………….35

9.1. Общие сведения …………………………………………………………........35

9.1.1. Исследование качественного состава микрофлоры силоса …………...........35

9.1.2. Определение кислотности силоса …………………………………………36

Бактериологический анализ молока………………………………………...………37

10.1. Общие сведения ………………………………………………………………37

10.1.1. Проба на редуктазу …………………………………………………………38

10.1.2. Определение общего количества бактерий в молоке ………………………39

Микробиологический анализ мяса………………………………………...................40

11.1. Общие сведения ………………………………………………………………40

11.1.1. Приготовление препарата – отпечатка ……………………………………..41

11.1.2. Выявление анаэробов ………………………………………………………41

Микробиологический анализ воды…………………………………………………42

12.1. Общие сведения ………………………………………………………………42

12.1.1. Определение микробного числа ……………………………………………42

12.1.2. Определение коли-титра и коли-индекса ………………………………….43

Список использованной литературы……………………………………………………46


Введение

Практикум по микробиологии построен в соответствии с программой курса микробиологии для студентов, обучающихся сельскохозяйственным специальностям (агрономия, производство и переработка сельскохозяйственной продукции).

Каждая лабораторная работа содержит краткое обоснование исследования, описание техники и методики проведения опыта, анализа полученных результатов, а также перечень необходимых материалов и оборудования.

Данное практическое руководство охватывает основной курс учебного материала по микробиологии для сельскохозяйственных специальностей.


^ Правила по технике безопасности при работе в микробиологической лаборатории

Не входить в лабораторию в пальто, головном уборе, не вносить посторонние вещи.

Приступать к занятиям, только надев хлопчатобумаж­ный халат.

Строго соблюдать правила обращения с химическими реактивами и красителями.

С большой осторожностью пользоваться смесью спир­та с эфиром, не переносить ее на столы с горелками.

Поскольку некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами, не допускать их распы­ления — не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.

Перед тем как набирать ртом с помощью пипетки сус­пензии микроорганизмов или реактивы, убедиться в том, что пипетка закрыта с тупого конца ватой.

В лаборатории поддерживать порядок и чистоту. По окончании занятий протирать иммерсионный объектив микро­скопа мягкой тканью, накрывать микроскоп полиэтиленовым чехлом, приводить в порядок рабочее место, мыть руки.

Помнить о том, что студенты несут ответственность за используемые ими микроскопы, другое лабораторное оборудо­вание, чистоту рабочего места.

Перед уходом из лаборатории дежурному проверять, выключены ли газ, вода, электроприборы.



1. Микроскопия


1.1. Светопольная микроскопия


Изучение невидимых невооруженным глазом клеток микроорганизмов, размеры которых не превышают десятков и сотен микрометров (1мкм = 0,001мм) возможно только при помощи микроскопа. Световые микроскопы позволяют получать увеличенное в сотни раз изображение исследуемых объектов, а электронные микроскопы – в десятки - сотни тысяч раз.


^ 1.1.1. Устройство микроскопа



Микроскоп состоит из двух частей: механической и оптической.

Механическая часть микроскопа: штатив, предметный столик и тубус (труба).

Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель) в форме дуги. Для регуляции положения тубуса имеются макрометрический и микрометрический винты.

Макрометрический винт (макровинт) служит для предварительной ориентировочной установки изображения объекта.

Микрометрический винт (микровинт) служит для четкой установки на фокус.

При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается по направлению к препарату, при вращении против часовой стрелки – поднимается от препарата.

^ Предметный столик - служит для размещения на нем препарата с объектами исследования; он вращается и перемещается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. В центре столика находится круглое отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направляемыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима (клеммы) для закрепления препарата, а также препаратоводитель.

Тубус (труба) – оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней части тубуса прикрепляется револьвер (объективодержатель) с гнездами для объективов. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем.

^ Оптическая часть микроскопа состоит из основного оптического узла (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор).

Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтированным в прибор регулированным источником света.

Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая – вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с объективами малых увеличений. Конденсор состоит из 2-3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от зеркала и направляет их на объект. Конденсор необходим при работе с иммерсионными системами. В конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок.

Окрашенные препараты рассматривают при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные – при уменьшенном отверстии диафрагмы.

Объектив – многолинзовая система, от качества которой зависит изображение объекта. Наружная линза называется фронтальной, она обеспечивает увеличение. Остальные линзы выполняют функции коррекции оптических недостатков.

Объективы бывают сухие и погруженные (иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. При работе с иммерсионным объективом V=90х между покровным стеклом и линзами объектива находится кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла 1,515 и 1,52 соответственно. Объективы имеют увеличение 8х, 40х и 90х.

Окуляр служит непосредственным продолжением «линз» (хрусталиков) глаз человека.

Окуляр состоит из двух линз – верхней – глазной и нижней – собирательной, заключенных в металлическую оправу. Назначение окуляра – увеличение изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра выгравировано на его оправе. Рабочее увеличение окуляров в пределах от 4х до 15х.

Окуляры бывают разных типов, и выбор зависит от объектива. При длительной работе с микроскопом пользуются бинокулярной насадкой, так как она улучшает видимость объекта, снижает яркость изображения и тем самым сохраняет зрение.


Работа с микроорганизмами


^ 2.1. Методы приготовления препаратов


2.1.1. Техника взятия культуры для препаратов


Обожженной в пламени бакте­риологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы. Если культура жидкая, то лучше для этого пользоваться петлей, в других случаях – иглой.


^ 2.1.2. Исследование живых клеток микроорганизмов методом раздавленной капли

Исследуют живые клетки микроорганизмов методом раздавленной капли, предварительно проводят окрашивание объекта прижизнен­ными красителями — витальная окраска (красители: метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%).

Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зре­ния; конденсор немного опускают, поступление света регули­руют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением – объектив 8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х или иммерсионный (90х).

В случае использования метода раздавленной капли на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Избыток воды удаляют фильтровальной бумагой. При использовании иммерсионного объектива на предметное стекло наносят каплю кедрового масла и микроскопируют.


^ 2.1.3. Фиксированные препараты микроорганизмов


Фиксированные препараты предполагают та­кую обработку живых клеток, которая дает возможность бы­стро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохра­нив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микро­организмами (в целях безопасности).

^ Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предмет­ное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжи­ривания стекол используют смесь этилового спирта и серного эфира в соотношении 1:1. Прокаленной бактериологической иглой из пробир­ки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают пет­лей по стеклу на площади около 4 см2.

Если суспензия густая, ее сначала разводят во­дой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Сус­пензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной темпера­туре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажаю­щей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фикси­руют.

^ Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки или при помощи химических со­единений. В пер­вом случае препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки, во втором случае используют хромовые соединения: формалин, осмиевую кис­лоту, ацетон. Один из распространенных приемов фиксации – обра­ботка препарата 96%-ным спиртом или смесью равных объ­емов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова). Для этого препараты погружают на 10-30 мин в фиксирующую жидкость.

^ Окрашивание препарата. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьи­рует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин. По окончании окрашивания препарат промывают во­дой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски.

При простой окраске используют какой-либо один кра­ситель (метиленовый синий, фуксин, генциан фи­олетовый), прокрашивается вся клетка.

При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями (окраска по Граму, окраска спор).



Исследование морфологии микроорганизмов


^ 3.1. Форма клеток


3.1.1. Бактерии

По форме все бактерии делят на шаровидные (кокки), палочковидные и извитые.

Шаровидные бактерии – кокки.

Микрококки – одиночные шаровидные клетки (Micrococcus agilis).

Диплококки – шаровид­ные кокки, соединенные по двое. (Azotobacter chroococcum).

Тетракокки – шаровидные кокки, соединенные по четыре.

Стрептококки – шаровидные бактерии, соединенные в цепочки (в основном относятся патогенные, а также молочнокислые бактерии Lactococcus lactis).

5. Сарцины – шаровидные бактерии, группирующиеся по 8 клеток, возникают в результате деления клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Некоторые виды сарцин формируют большие кубообразные пакеты, в которых с каждой стороны находится по 4 сарцины. Типичный представитель Sarcina flava (сарцина желтая) — наиболее распространенный представитель микрофлоры воздуха.

Все шаровидные формы бактерий, за исключением ^ Streptoctococcus lactis, просматривают на фиксированных и окрашен­ных фуксином препаратах.

Палочковидные бактерии. К ним относят формы не образую­щие споры (роды Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillus и др.) и обра­зующие споры (роды Bacillus, Clostridium и др.).

Неспорообразующая палочка Pseudomonas stutzeri – цитоплазма ее прокрашивается равномерно.

Спорообразующие палочки ^ Bacillus mycoides и Bacillus mesentericus. Под микроскопом выглядят неравномерно окрашен­ными. Споры не окрашиваются, как более плотные структуры. Клетки Bacillus mycoides располагаются цепочками, это стрептобациллы.

Палочковидные бактерии просматривают на фиксиро­ванных и окрашенных препаратах.

Извитые формы

1. Вибрионы – слегка изогнутые клетки.

Спи­риллы могут иметь один завиток в виде русской буквы С, два завитка в виде латинской буквы S или несколько — в виде спирали.

3. Спирохеты — длинные и тонкие клетки с большим ко­личеством завитков; длина клеток превы­шает их толщину в 5-200 раз.

Вибрионы и спириллы удобно просматривать на фикси­рованном и окрашенном препарате, приготовлен­ном из навозной жижи, предварительно инкубированной в те­чение нескольких суток в термостате. Из множества микроорганизмов на таком препарате часто встречаются извитые формы.

Со спирохетами можно познакомиться на фиксированном окрашенном препарате зубного налета, особенно удачны препараты соскоба из кариесного зуба. Зуб­ные спирохеты очень тонкие, волосовидные, ко­роткие (всего 2-3 завитка).


3.1.2. Актиномицеты

Актиномицеты – лучистые грибы. Мицелий актиномицетов на питательных средах дифференцирован: одна часть его погружена в субстрат (субстратный мицелий), другая находится над субстратом (воздушный мицелий).

Многие представители актиномицетов продуцируют пиг­менты, поэтому их воздушный мицелий и особенно колонии окрашены в голубой, синий, фиолетовый, розовый, бурый, ко­ричневый или черный цвета. Актиномицеты окрашивают питательную среду в соответствующие цвета.

На предметное стекло наносят кусочек ко­лонии актиномицета вместе со средой. Вторым пред­метным стеклом плотно прижимают этот кусочек к стеклу, раздавливают и размазывают постеклу. Препарат сушат, фиксируют, красят, просматривают под микроскопом, где частично просматриваются мицелиальные одноклеточные нити.


3.1.3. Дрожжи

Дрожжи – одноклеточные микроскопические грибы разнообразные по форме: эллипсовидная, грушевидная, округлая, ци­линдрическая. Размножаются вегетативным и половым путем.

Для лабораторных занятий используют пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахарен­ную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стек­ло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кед­рового масла и просматривают препарат с иммерсионной сис­темой. Видны почкующиеся и делящиеся клетки.


^ 3.2. Химические методы исследования


3.2.1. Окраска клеток микроорганизмов по Граму

Этот метод дифференциации мик­робных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. В клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, а у других видов это соединение появляется временно и после обработки спир­том растворяется. Микроорганизмов первой группы называют грамположительными второй — грамотрицательными.

Техника окраски по Граму. На обезжиренное предметное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них — контрольные, с заведомо из­вестным отношением к окраске по Граму). Мазки высушива­ют на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашива­ют в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолето­вого (или кристаллического фиолетового), держа стекло в слегка наклонном положении. Затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на него на 1 мин раствор Люголя (до полного почернения мазка). Стекло держат в наклонном положении. Препа­рат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачи­вая, 96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Важно придерживаться времени обесцвечивания, так как при превы­шении указанного срока обесцвечиваются и грамположитель­ные клетки.

Промыв водой, препарат окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1 мин. Грамположитель­ные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются в цвет дополнитель­ной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культу­ры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры.

Хорошими объектами для окраски клеток микроорганиз­мов по Граму служат дрожжи, ^ Bacillus mesentericus или Bacillus subtilis (грамположительные) и кишечная палочка Escherichia coli (грамотрицательная).

Красители и реактивы для окраски по Граму.

1. Феноловый рас­твор генциана фиолетового: генциан фиолетовый — 1 г, спирт 96%-ный — 10 мл, фенол кристаллический — 2 г, вода дистил­лированная — 100 мл.

В некоторых случаях применяют спиртовой раствор генциана фиолетового: генциан фиолетовый (или кристаллический фи­олетовый) — 1 г, спирт 96%-ный (ректификат) — 100 мл, гли­церин — 5 мл. Смесь ставят в термостат на 24 ч, затем фильтруют.

^ Раствор Люголя (иодит калия — 2 г, иод кристаллический — 1 г, вода дистиллированная — 300 мл). Вначале готовят кон­центрированный раствор иодита калия в 5 мл воды, в нем рас­творяют иод, потом добавляют воду до 300 мл.

^ Спирт 96%-ный.

Фуксин Пфейфера (водный раствор карболового фуксина Циля): 1 мл карболового фуксина Циля и 9 мл дистил­лированной воды. Готовят его так: 1 г фуксина, 5 г фенола кристаллического, 96 % спирт – 10 мл, несколько капель глицерина, 100 мл дистиллированной воды, фуксин растворяют в этаноле, добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.


^ 3.2.2. Окраска спор у бактерий

Споры бактерий по сравнению с ве­гетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представ­ляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образова­ния. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной, ес­ли превышает, то в зависимости от расположения споры в центре или на конце клетки эту клетку называют соответ­ственно клостридиальной или плектридиальной. В бацилляр­ной клетке спора может размещаться в центре клетки — центральное положение, на конце — терминальное и ближе к одному из концов — субтерминальное положение.

При наблюдении за живыми спорообразующими бакте­риями их споры можно различить по более сильному прелом­лению световых лучей. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это боль­шой плотностью оболочки, низкой концентрацией в ней сво­бодной воды и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, спо­ры остаются бесцветными (негативная окраска).

Все способы окраски спор основаны на едином принципе: сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода, затем окра­шивают клетку со спорой при нагревании и, наконец, обесцве­чивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контраст­ным красителем.

^ Метод Циля-Нильсена в модификации Мюллера. До фиксации мазка бактерий на пламени препарат гото­вят обычным способом. Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5%-ный раствор хро­мовой кислоты. Через 5-10 мин ее смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно сма­чивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают пре­парат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краси­тель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются.

Далее обесцвечивают цитоплазму клеток (но не споры), обрабатывая 1%-ным раствором соляной или серной кислот в течение 15-30 с. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16-18 с (размеренно считая вслух от 21 до 37-40). При превышении этого времени могут обесцветиться и споры. Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин.

Окраска полу­чается контрастной и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.

^ Метод Пешкова. На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до ки­пения и кипятят 15—20 с, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. Еще раз промыва­ют, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной им­мерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или си­ний цвета, цитоплазма — в розовый.

Для исследования спор удобными объектами могут слу­жить Bacillus mesentericus или Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.

Реактивы для окрашивания спор бактерий. 1. Карболовый фуксин Циля (см. 3.2.1).

Метиленовый синий Леффлера (см. 3.2..1).

Насыщенный водный раствор метиленового синего. 2 г красите­ля и 100 мл дистиллированной воды.

Хромовая кислота, 5%-ный раствор.

Соляная (или серная) кислота, 1%-ный раствор.



^ 4. Культивирование микроорганизмов


4.1. Питательные среды


4.1.1. Приготовление питательных сред

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который полу­чают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса заливают в эмалирован­ной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55 °С. Мясо отжимают, экстракт процежива­ют через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертыва­ния коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз че­рез марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закры­вают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги).

Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления сред. Если их готовят сра­зу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.

Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавля­ют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для по­вышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для созда­ния осмотической активности. Среду нагревают до растворе­ния пептона, постоянно помешивая.

Устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na2C03 до посине­ния влажной красной лакмусовой бумажки. Для проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1-2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау — бутылочно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий.

После установления рН среду снова кипятят 5—10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, от­фильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульо­на или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешива­ют с охлажденным до 50°С бульоном. Смесь кипятят, поме­шивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

^ Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15-20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления — 100°С, затвердевания — 40°С), устанавлива­ют слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na2C03 и через воронку разливают в пробирки (приблизитель­но по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара — косяков).

При разливе агара края пробирок должны оставаться сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120°С 20 мин.


^ 4.2. Методы стерилизации

Стерилизация – это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Известно несколько методов стерилизации. Чаще применяют стерилизацию нагреванием.


^ 4.2.1. Фламбирование, или прокаливание

Прокаливать можно непосредственно перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т. д.


^ 4.2.2. Стерилизация сухим жаром

Ее применяют для обработки посуды и сухих материалов, на­пример крахмала, мела. При этом стерилизуемый объект вы­держивают при 170 °С в течение 2 ч (с момента, установления необходимой температуры) в электросушильных шкафах. Поднимать темпе­ратуру выше 170°С не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться.

Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ват­ными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пи­петки, вату, марлю заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых стерильная посуда мо­жет храниться после стерилизации.

По окончании стерилизации шкаф открывают только после того, как температура снизится до комнатной, иначе стекло может лопнуть.


^ 4.2.3. Стерилизация текучим паром


Текучим паром (100 °С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдержи­вающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко). Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 мин в течение 3 суток ежедневно. Такая стери­лизация называется дробной.

При однократном прогреве при температуре 100 °С в тече­ние 30 мин погибают вегетативные клетки, споры же многих микроорганизмов остаются жизнеспособными. После такого про­грева среду помещают на 24 ч в термостат при 28-30 °С. Споры, сохранившиеся при первом нагревании, успевают, за это время прорасти в вегетативные формы, которые погибают при после­дующем нагревании. Затем эту операцию повторяют еще 2 раза.


^ 4.2.4. Стерилизация насыщенным паром под давлением


Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые споры. С его помощью сте­рилизуют большинство питательных сред, посуду.

Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающемся толстостенном котле — автоклаве. На крышке или сбоку автоклава находятся кран для выхода пара, манометр и предохранительный клапан. Манометр пока­зывает, на сколько давление пара внутри котла выше нормаль­ного. Для предотвращения взрыва при превышении предель­ного давления срабатывает предохранительный клапан, давая вы­ход пару.

Показателю манометра в физических атмосферах соответ­ствует определенная температура.



Давление, атм

Температура, С0

0,5

115

1,0

120

1,5

127

2,0

133


Надежной стерилизации достигают нагреванием при 120 °С и давлении 1 атм в течение 20 мин.

Стерилизацию ведут следующим образом. Наливают воду в автоклав, помещают в него стерилизуемые предметы, завин­чивают крышку автоклава и начинают подогрев. Кран оставля­ют открытым до тех пор, пока весь воздух, находящийся в ав­токлаве, не будет вытеснен парами воды. Когда пар начнет вы­ходить из крана непрерывной струей, кран закрывают, доводят давление пара в автоклаве до 1 атм и поддерживают на этом уровне 20—30 мин. Затем нагрев прекращают, ждут, пока стрелка манометра опустится до 0, осторожно (понемногу) от­крывают кран и спускают пар. Только потом отвинчивают крышку автоклава. Если кран открыть раньше, чем упадет дав­ление, то жидкость в стерилизуемых сосудах закипит и вы­толкнет из них пробки.

Автоклав используют и для дробной стерилизации теку­чим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы обеспечить свободный выход пару.


4.2.5. Пастеризация

Пастеризация представляет собой неполную, или частичную, стерилизацию, что означает нагревание при 65-80°С в течение соответственно 30-10 мин с последующим быстрым охлажде­нием до 10-11°С. Пастеризуют молоко, пиво, вино и другие продукты.


^ Материалы и оборудование

МПБ, агар, лакмус красный, бромтимолблау, фарфоровые пластинки с лунками или чашки, стеклянные палочки, 20%-ный раствор Na2C03, пробирки в штативах (для разливки агара), воронки, вата, чашки Петри, пипетки Мора на 1 мл, бумага для обертывания чашек и пипеток, колбы емкостью 250 мл, суровые нитки.

^ 5. Учет численности и выделение чистой культуры микроорганизмов


5.1. Методы учета численности микроорганизмов


5.1.1. Учет численности микроорганизмов (КОЕ) в почве методом питательных пластин в сочетании с методом последовательных разведений

Почва — наиболее благоприятная среда для развития микроор­ганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого уча­стка берут среднюю почвенную пробу.

Сначала готовят суспензии (методом разведения), содер­жащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого на стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой берут из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку фламби-руют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. При взвешивании почвы часовое стекло накрывают другим сте­рильным часовым стеклом.

Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят в колбу на 250 мл с 99 мл стерильной воды. Смесь взбалтыва­ют 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10-2 г почвы, и переносят в про­бирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неод­нократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают таким же образом, как и в первом случае. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10-3 г, во второй колбе —10-4 г. Точ­но так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1 мл соответственно 10-5 и 10-6 г почвы.

Для определения численности микроорганизмов в каж­дом разведении методом питательных пластин проводят глубинный посев.

Для определения количества живых клеток, содержащих­ся в 1 мл суспензии каждо