Реферат: В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных, на на­следственность

В настоящее время в результате успехов фундаментальных наук возникла возможность развития принципиально новых эффективных методов влияния на организм животных, на на­следственность.

Главные разделы биотехнологии — генная и клеточная ин­женерия. Методы генной инженерии наиболее детально разра­ботаны на микроорганизмах. Можно направленно изменять их генотип. В отличие от спонтанных мутаций эти изменения мож­но заранее планировать. Так, в микроорганизмы совершенно определенно встраивают гены, ответственные за синтез интер-ферона, соматотропина, некоторых незаменимых аминокислот. Возможности дальнейшего развития этого направления огром­ны. Широким фронтом ведутся исследования и разработки по выделению и клонированию определенных генов, их внедрению в геном. Если генная инженерия в микробиологии стала реаль­ностью и приобретает все большее практическое значение, то у животных применение этих методов только начинается, однако установлено, что в принципе можно выделить определенные гены из генома животных и встроить их в геном другой особи. Ген соматотропина (гормона роста) крысы встроен в геном мыши. В результате у некоторых трансгенных животных уве­личились скорость роста реципиента и конечная живая масса. Можно себе представить, какое огромное практическое значе­ние будет иметь использование этого приема на сельскохозяйст­венных животных. Представляется возможным по заранее на­меченному плану реконструировать геном домашних животных, придать ему заранее заданные свойства. Для достижения та­ких результатов традиционными методами потребовалась бы работа в течение многих поколений.

Возникает перспективная задача — использовать домашних животных как живые реакторы, ферментеры для производства ценнейших биологически активных веществ. Например, встроив ген интерферона с необходимыми регуляторными элементами в геном коровы, можно рассчитывать, что этот гормон будет экс-прессироваться и в молочной железе. А поскольку активность молочной железы высокая, то можно получать данное вещество с молоком в значительных количествах и, вероятно, при высокой экономической эффективности. Это же в принципе относится и к другим биологически активным веществам. В данном случае молочный скот — оптимальный объект для создания таких жи­вых реакторов. Ни одно другое сельскохозяйственное животное не имеет такого интенсивного синтеза самых разнообразных про­дуктов и выведения их из организма. Однако существующие методы введения в геном животных инородного генетического материала еще недостаточно совершенны и степень вероятности встраивания чужеродных генов и их экспрессии невелика и ис­числяется несколькими процентами и менее. Поэтому необходи­мо наличие большого числа яйцеклеток для успеха генно-инженерных манипуляций. Установлено, что оптимальной фазой вве­дения инородного генетического материала является стадия зи­готы до слияния пронуклеусов. Именно при введении генов в пронуклеус обеспечивается наибольшая вероятность успеха. Следовательно, необходимо иметь большое число яйцеклеток, и уметь их оплодотворять, чтобы уже на фазе зиготы подверг­нуть генно-инженерным манипуляциям. В принципе зиготы можно получать от предварительно стимулированных и оплодо­творенных животных оперативным путем. Но это очень сложный и трудоемкий способ, связанный с операциями на животных. Поэтому особое значение для развития генно-инженерных ра­бот в животноводстве приобретает отработка методов извлече­ния из яичников, культивирования, оплодотворения созревших овоцитов in vitro и последующего их раннего развития и транс­плантации. Сочетание этих двух методов создает оптимальные условия для широкого внедрения генной инженерии в практику селекционно-племенной работы в животноводстве. По всей ве­роятности, в ближайшей перспективе методами генной инжене­рии будут созданы новые формы сельскохозяйственных жи­вотных.

^ КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Наряду с развитием методов генной инженерии в животно­водстве перспективны способы клеточной инженерии. В расте­ниеводстве в селекции эти методы уже получили значительное развитие. Культивирование клеток растений in vitro обеспечи­вает возможность применять системы интенсивного отбора кле­ток, культивированных в строго контролируемых селективных условиях.

Присущие растительным клеткам свойства тотипотентности (свойство отдельных клеток развиваться в целостный организм) дают возможность плюс-варианты регенерировать в целые рас­тения и использовать в процессе селекционной работы.

Методы клеточной инженерии перспективны и в животновод­стве. Уже накоплен большой опыт культивирования соматических клеток животных in vitro, разработаны оптимальные среды и режимы культивирования, отработаны способы длительного хранения клеток при низких температурах. Как уже было ска­зано, активные исследования проводятся и по культивированию генеративных клеток. Разработка этих методов создает прочную основу для развертывания теоретических и прикладных работ по клеточной инженерии сельскохозяйственных животных, ко­торые будут иметь все возрастающее народнохозяйственное зна­чение.

На первое место следует поставить уже достаточно хорошо разработанный метод разделения ранних эмбрионов. С развити­ем трансплантации в руках исследователей появилось достаточ­ное количество ранних эмбрионов, что дало мощный импульс работам по манипуляции с этими объектами. Первый успешный опыт по разделению эмбрионов на стадии 2—8 бластомеров был осуществлен Виллардом (Кембридж, Великобритания). Однако получение такого материала связано с большими трудностями и может быть осуществлено в научно-исследовательских учреж­дениях.

В результате исследователи начали манипулировать с эм­брионами в более поздних стадиях развития (морула, бласто-циста). Сущность метода заключается в том, что предваритель­но вскрывается прозрачная зона (pellucida), эмбрион разделя­ется на две части. При этом одна половина остается в прежней зоне, а другую переносят в заранее подготовленную зону и про­изводят обычную трансплантацию. Во многих опытах прижив-ляемость разделенных эмбрионов достигает 50—60%. Приклад­ной аспект этой методики заключается в увеличении числа те­лят, полученных от каждого донора. По данным американских исследователей, половинки эмбрионов, инкубировавшиеся без прозрачной оболочки, сохраняли жизнеспособность в культуре только в 15% случаев, а при наличии зоны пеллюцида — в 35% случаев. Наилучшие результаты были получены при нехирурги­ческом введении половинок эмбрионов — каждая в отдельной прозрачной оболочке в разные рога матки одного и того же ре­ципиента (55% стельности).

В другом опыте были достигнуты еще лучшие результаты при хирургическом введении каждой половинки эмбриона в рог матки на той стороне, где локализовалось желтое тело (65% стельности). Стало очевидным, что разделение эмбрионов — эф­фективный метод увеличения потомства коров-доноров.

В настоящее время эта методика начинает внедряться в практику племенного дела. Уже получены животные от транс­плантации половинок эмбрионов свиней (США, Р. У. Роунтри). По данным ряда исследователей, число потомков может быть увеличено на 30—35%. Однако этим не ограничивается значение клеточно-инженерной операции. Возможность массового получения идентичных двоен (генетических копий) очень важна. Эти животные имеют большую ценность для исследователей, зани­мающихся проблемой взаимодействия генотипа и среды. Ис­пользование идентичных двоен позволяет повысить точность исследований и достичь достоверных результатов при меньшем числе подопытных животных. Кроме того, наличие идентичных близнецов позволяет на одном из них проводить изучение при­знаков, требующих убоя животного (например, мясные качест­ва), и переносить эти данные на близнеца, что является мето­дически вполне обоснованным. Все это позволяет более точно и всесторонне оценить данный генотип. Кроме того, при трудо­емкой и длительной работе по оценке быков по качеству потом­ства эту работу можно проводить только с одним из двойневых идентичных быков. Оценка одного животного будет соответст­вовать оценке и другого идентичного животного. Имеется информация о том, что уже получено потомство при разделении бластоцисты на 4 части. Это еще в значительной мере увеличи­вает значение данного метода клеточной инженерии для повы­шения эффективности селекционно-племенной работы и исследований в области генетики сельскохозяйственных животных.

К важнейшим проблемам животноводства относится разра-ботка методов регулирования пола сельскохозяйственных жи­вотных. Непредсказуемость пола рождаемых животных может приобретать значительную важность, если экономическое зна­чение животных одного пола существенно выше экономического значения животных другого пола. Пока достигнут лишь незначительный прогресс в решении проблемы контролирования со­отношения полов и в разработке методов его регуляции. Иде­альным методом контролирования соотношения полов могло бы стать разделение спермиев, несущих Х- и У-хромосомы. Очевид­но, именно в этом направлении должны интенсивно развивать­ся исследования. Другим подходом для воздействия на соотно­шение полов является определение пола у ранних эмбрионов после извлечения из репродуктивного тракта самки и перед их трансплантацией.

Один из аспектов идентификации пола эмбрионов — цитоло­гический, с помощью которого определяют их тип (XX или XY) путем исследования половых хромосом или хроматина. Кроме того, иммуногенетические методы, используемые для идентифи­кации специфичных по полу антигенов эмбрионов, могут быть перспективны для разделения мужских и женских эмбрионов. Количественные различия в метаболической активности муж­ских и женских эмбрионов могут быть также использованы в качестве принципа для разделения эмбрионов по полу. Имеется сообщение, что с помощью колориметрического теста по опре­делению активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы можно идентифицировать пол. Перспективны методы, основанные на гибридизации ДНК для идентификации мужских эмбрионов. Каждый из указанных способов весьма перспективен. Однако в настоящее время наиболее разработаны и эффективны цито­логический и иммунологический методы.

^ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Важнейшая народнохозяйственная задача — интенсифика­ция животноводства. Поставлена задача резко увеличить уро­вень производства продуктов животноводства при экономном расходовании ресурсов. Главный биологический фактор интен­сификации — генетическое совершенствование животных, основ­ных орудий производства в этой отрасли; повышение их генети­ческого потенциала. В результате планомерной, многолетней работы исследователей и практиков животноводства достигну­ты значительные результаты в селекции сельскохозяйственных животных.

Генетические методы все в большей степени находят приме­нение в селекционно-племенной работе. Особую роль в повыше­нии эффективности селекционно-племенной работы сыграло внедрение методов популяционной генетики. Разработка и при­менение методов определения изменчивости, повторяемости, на­следуемости и генетической корреляции количественных хозяй­ственно ценных признаков позволили точно прогнозировать и планировать селекцию на них. Популяционная генетика стала теоретической основой системы крупномасштабной селекции, которая интегрировала самые новейшие достижения в этой от­расли генетики, методы искусственного осеменения и длитель­ного хранения гамет сельскохозяйственных животных, а также современные способы сбора, хранения и анализа генетической информации с использованием современных ЭВМ.

Широкое использование крупномасштабной селекции преж­де всего в молочном скотоводстве, а затем и в других подотрас­лях животноводства позволило резко ускорить темпы генети­ческого совершенствования разводимых в стране пород сельско­хозяйственных животных. Возможности этой системы далеко не использованы, и она будет все шире внедряться в практику пле­менного дела.

Вместе с тем у этой системы, основанной на методах гене­тики популяций, имеются и ограничения. Так, поиск быка-улучшателя основан на оценке по потомству большого числа произ­водителей. А это связано с большими затратами, поскольку быки-улучшатели — явление редкое, а выдающиеся — чрезвы­чайно редкое. Кроме того, ряд селекционных программ, на­правленных на выведение животных, невосприимчивых к неко­торым заболеваниям (лейкоз, мастит), пока не дают сущест­венных сдвигов. Поэтому селекционеры сельскохозяйственных животных все чаще обращают внимание на клеточную и генную инженерию. Один из методов клеточной инженерии — транс­плантация ранних эмбрионов, получение идентичных близнецов, химерных животных — уже широко внедряется в практику се­лекции сельскохозяйственных животных и ускоряет генетическое улучшение пород.

С 50-х годов до настоящего времени разработаны методы генетического манипулирования, которые сложились в четкую систему генной инженерии животных. К этим работам относится пересадка клеточных ядер у лягушек методом микроинъекции Бригса и Кинга. В настоящее время перенос ядра соматической клетки в энуклеированную зиготу успешно проведен на мышах.

Освоен метод переноса ядра путем слияния кариопластов. Разработана методика получения химер у млекопитающих.

Гарднер разработал методику инъекции бластомеров в бластоцисты реципиента. Эта методика освоена на мышах Бутлером. На ее основании получены химеры у овец. Указанные рабо­ты, связанные с клеточной инженерией животных, подготовили подходы к генной инженерии сельскохозяйственных животных. Один из методов получения трансгенных животных заключает­ся в переносе генов в культивируемые клетки, а затем их инъ-ецировании в бластоцисту. Разработаны различные методы вне­сения генов в генотип реципиентных клеток.

Наибольшее распространение в последнее время получил метод инъецирования чужеродных генов в пронуклеус зиготы животных. Впервые инъецирование было проведено на ооцитах лягушек: в яйцеклетки вводили определенную ДНК, и были от­мечены интеграция и транскрипция.

В 1981 г. был инъецирован ген ^-глобина кролика в зиготу мыши. Ген, включенный в геном, имел вид длинного тандема организованных участков, которые корректно транскрибирова­лись только в том случае, если они не содержали плазмидных компонентов (Т. Е. Wagner и др.).

Проявление действия встроенных генов, введенных путем микроинъекции, изучали на мышах. На ряде генов установлено их тканеспецифическое действие в зависимости от регуляторных элементов того или иного гена.

В 1980 г. в пронуклеус зиготы мыши была инъецирована плазмида pBR322, содержащая вставку генов вирусов SK40 и HSV. У трех мышей (3,8%) из 78 найдена ДНК, что подтвер­дило хромосомную интеграцию, однако ДНК подверглась реор­ганизации.

При инъецировании гена -глобина человека в комплексе с геном ТК HSV в пронуклеусы зигот мыши установлена интегра­ция у пяти из 33 плодов (15,1%), извлеченных на 16—17-йдень.

Проведена микроинъекция в пронуклеус зиготы гена -гло­бина кролика, экспрессия наблюдалась у пяти мышей.

Бринстер и др. инъецировали в пронуклеусы зигот мышей комплекс, включающий металлотионеин мыши с геном тими-динкиназы с промотором, интеграция была отмечена у семи из 41 мыши (17%), экспрессия наблюдалась у четырех особей. Наиболее активная экспрессия отмечена в печени и почках.

Революционные достижения в биологии, особенно в генетике, позволили создать принципиально новые биотехнологии, генети­ческая инженерия стала признанной, перспективной техноло­гией.

В середине 70-х годов были открыты микробные ферменты, позволяющие разрезать молекулы ДНК в совершенно опреде­ленном месте, то есть выделять нужные ее участки, что позво­лило искусственно сливать гены или создавать рекомбинантную ДНК.

Стало возможным идентифицировать и клонировать опреде­ленные гены. Выбранный ген должен иметь какую-либо биоло­гическую функцию, которая может быть детектирована. Выделенный ген должен быть введен в ДНК-молекулу переносчика или вектора — посредника при переносе гена. Таким образом, ген может быть перенесен из организма донора в организм ре­ципиента, который впоследствии будет в состоянии реплициро­вать чужеродный ген. Следовательно, чужеродный ген в орга­низме реципиента будет не только действовать, но и реплици-роваться.

Генная инженерия в основном состоит из выделения из од­ного организма гена (ДНК), определяющего желательный при­знак, и переноса его в другой организм, который получает но­вый генетически наследуемый признак.

Современная биотехнология создает возможность передачи отдельного гена или блока генов, контролирующих определен­ный признак. Такой ген может быть перенесен из любого орга­низма в любой другой организм. При этом в новом организме он будет, вероятно, способен проявлять свойственную ему экс­прессию, то есть проявляться в фенотипе. При этом организмом-реципиентом может быть как растительная, так и животная форма.

^ Использование биотехнологии в селекции животных

Параллельно с генной инженерией разработан ряд других направлений биотехнологий. Одно из них — трансплантация оплодотворенных яйцеклеток и ранних эмбрионов. Этот метод успешно применяется в работе с крупным рогатым скотом на­чиная с 1951 г. Его используют для получения потомства от наиболее ценных животных.

Метод трансплантации эмбрионов стал одной из технологий генетической инженерии в работе с животными. Первым шагом в этом плане стала успешная трансплантация оплодотворенных яйцеклеток, в ядро которых был введен чужеродный ген путем микроинъекции.

Опыты на лабораторных животных быстро переросли в тех­нологии, практически применяемые уже на практике. Для полу­чения рекомбинантных продуктов используют бактерии, грибы и все чаще клетки животных. Это позволяет получать искусст­венным путем белки, которые в норме продуцируются только животными. Нужные гены были перенесены в соответствующие организмы, в которых и проявляли экспрессию .

Этот метод широко используется в медицине и ветеринарии. В качестве примера можно привести ренин, используемый в сы­роварении. Широки возможности получения таким путем и фер­ментов, используемых для изготовления моющих средств и в приготовлении пищи.

В настоящее время исследования направлены на создание системы ферментов для получения глюкозы из целлюлозы. Гены, контролирующие выделение ферментов, которые обнаружены у медленнорастущих грибов, были клонированы и перенесены в быстрорастущие бактерии и дрожжи. Это позволило создать эффективную технологию получения из целлюлозы древесины легкопереваримых углеводов. Проводятся работы по получению ферментов, участвующих в гидролизе лигнина, что позволяет создать технологию его расщепления на более простые молеку­лы, а это в дальнейшем даст возможность получать биогаз или одноклеточный протеин. Это может стать основой технологии обработки грубых, целлюлозсодержащих кормов (биомасса и т. д.).

Развернуты работы по получению трансгенных животных. Установлено, что мышь из трансплантированной яйцеклетки мо­жет иметь одну копию гена гормона роста или несколько таких копий в своих хромосомах. Гормон роста программируется ге­ном, стимулирует рост организма и определяет конечный его размер.

Гены, контролирующие образование гормона роста (как крысы, так и человека), уже изучены при введении в организм мыши. Все это указывает на реальную возможность использо­вания методов генной инженерии при работе с высшими живот­ными. Такая технология разрабатывается. При этом в первую очередь следует использовать гены, контролирующие интенсив­ный рост животных и эффективную их продуктивность. Иссле­дователи этой проблемы нередко сталкиваются и с нежелатель­ными последствиями введения чужеродного гена, в частности с потерей фертинга.

Генная и клеточная инженерия широко используются в вете­ринарии. Большие потери при воспроизводстве скота и птицы вызываются различными заболеваниями. Особенно большой ущерб наносят инфекционные заболевания. Для борьбы с ря­дом болезней успешно применяют различные вакцины. Метода­ми генной инженерии можно получить такие вакцины, которые невозможно получить традиционными методами. Эти вакцины могут быть более безопасными, дешевыми и стабильными по сравнению с существующими.

Иммунная реакция — мощный защитный механизм у живот­ных. При попадании в организм чужеродного белка определен­ные клетки продуцируют антитела, призванные нейтрализовать его. Установлено, что определенная часть молекулы протеина является антигенной детерминантой. При помощи рентгеногра­фии и кристаллографии можно не только увидеть структуру белка, но и установить локализацию антигенной детерминанты.

Возможность наблюдать трехмерную структуру антигенного сайта уже позволяет синтезировать полипептидную структуру, которая может служить в качестве синтетических антигенов для использования в вакцинации.

Гены, контролирующие образование таких полипептидных антигенов, могут быть синтезированы и введены в клетки, кото­рые будут в массе продуцировать антигены.

Важнейшая биотехнология для ветеринарии — гибридомная. Путем инъекции антиген вводят мыши. Клетки костного мозга мыши, продуцирующие антитела, сливаются (смешиваются) с клетками, способными расти в культуре (миеломные клетки). В результате гибридные клетки продуцируют антитела. Эти клетки можно клонировать. Клеточную линию, продуцирующую желательные антитела, от­бирают, и в постоянной культуре она становится источником антител. Этот метод используют для идентификации антигенных белков, а также специфических антигенных сайтов, определяю­щих образование антител.

В настоящее время эти технологии получают все большее развитие.

^ Развитие методов биотехнологии животных
В отношении сложнообусловленных полигенных количест­венных признаков, к которым относятся большинство хозяйст­венно ценных показателей сельскохозяйственных животных,, в селекции применяются методы популяционной генетики.

Методы определения изменчивости, повторяемости, наследуе­мости количественных признаков, генетических корреляций между ними положены в основу современной крупномасштаб­ной селекции.

Все это дает возможность точно планировать селекционно-племенную работу по улучшению количественных признаков.

Широкое использование информатики и ЭВМ позволяет создать базу для оперативного анализа генетической информа­ции в огромных по численности популяциях сельскохозяйствен­ных животных. Все это значительно ускоряет темпы генетиче­ского улучшения разводимых в стране пород, активизирует про­цессы выведения новых линий, типов и пород животных.

Генная инженерия представляет собой логическое продол­жение развития и применения новейших генетических методов в селекции животных. Возможности генной инженерии увеличи­лись в связи с открытиями в области регулирования действия генов. Инъекция клонированного гена ростового гормона чело­века свиньям и овцам стала возможной в результате двух но­вых методов биотехнологии — микрохирургии на эмбрионах и рекомбинации ДНК. Микрохирургия на яйцеклетках и эмбрио­нах и рекомбинация ДНК в принципе открывают возможность более интенсивной селекции животных. Сочетание генетического манипулирования с уже широко распространенными методами / длительного хранения спермы и эмбрионов дает селекционеру/ невиданные возможности более эффективной селекции.

^ Основные методы генной инженерии животных

Успех генной инженерии на животных зависит от возможности вставок генов (представляющих интерес) в геном. Два ме­тода открывают большие возможности для вставки клониро­ванных генов в ядро клетки: перенос генов в пронуклеус и ви­русная трансфекция.

Перенос генов с ДНК- Установлено, что инфекционность ДНК аденовируса 5 в однослойной культуре клеток KB челове­ка может быть значительно повышена путем преципитации ви­русной ДНК с помощью фосфата кальция.

Метод оказался эффективным и для других ДНК. Исполь­зуя перенос генов с помощью ДНК, Виглер и другие смогли пе­ренести ДНК, включающую ген тимидинкиназы (ТК), выделен­ный из вируса герпеса (HSV-1) в культивированные клетки мыши, в которых тимидинкиназа отсутствует. Полученные в ре­зультате этого клоны, содержащие вирусную тимидинкиназу, стабильно поддерживались в течение ряда поколений. По­скольку эффективность трансфекции ДНК с фосфатом кальция невелика, то для отбора клонов клеток, трансформированных по тимидинкиназе, была использована среда HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, не прошедшие трансформа­цию, не имели ТК, поэтому после трансформации их можно было элиминировать (отбросить) и культивировать в среде, содержащей HAT. Выжили только клоны с функциональной ти-мидинкиназой. Для селекции можно использовать свойство ус­тойчивости к определенным веществам, например неомицину.

Вирусная инфекция. Вирусная инфекция — естественный путь введения генетической информации в клетки (животных). Кро­ме того, вирусы используются для трансформации клеток с ценными генами. Проведена работа по инъекции ДНК вируса 5V40 в бластоцель мышиных эмбрионов и пересадке трансфор­мированных эмбрионов в матку псевдобеременных мышей. Эта ДНК обнаружена у 25 из 29 мышей, полученных из 80 инъеци­рованных эмбрионов. Анализ на гибридную ДНК показал, что 10 мышей были носителями ДНК вируса SVO. Вирусная ДНК была неравномерно распределена по тканям, вероятно, в связи с неодинаковым уровнем инфицирования клеток внутренней клеточной массы или в результате гибели некоторых линий эмбриональных клеток, несущих вирус, в процессе развития.

Показано, что мыши, зараженные вирусом лейкемии Молони на стадии 4—8 клеток, стабильно содержали одну копию вируса в своем геноме. Вирус передавался потомству как менделевский доминантный признак. Мыши II поколения были заражены и поражались лейкемией. Проявление вируса у взрослых живот­ных варьировало: у некоторых линий мышей развивалась ран­няя лейкемия, а у других заболевание развивалось в более позднем возрасте.

Одно из возможных последствий внедрения гена с примене­нием любых способов — образование вставочных мутаций, то есть изменений в функции собственного гена в результате вста­вок чужого гена в него или около него. Одна линия мышей, трансформированных вирусом лейкемии Молони, не могла быть доведена до гомозиготности. В результате ранней эмбриональ­ной смертности гомозиготных эмбрионов продукт полного доми­нирования гена в процессе развития отсутствовал.

Получение мутантов путем вставок открывает огромные воз­можности для генетических исследований.

Данные об использовании ретровируса для трансформации клеточных линий млекопитающих по функционально неселекти­руемому гену в литературе не встречаются. Однако Миллер и другие описали синтез поддающегося селекции ретровируса, содержащего миниген, контролирующий ростовой гормон кры­сы, который может инфицировать культивируемые клетки и обусловливать выработку большого количества ростового гор­мона. Вставка вирусов в клеточный геном происходит в одном месте без перестройки. Было установлено, что изменение харак­тера проявления действия гена обусловлено первоначальным ме­стом его встройки, а не последующей модификацией.

В настоящее время разработаны системы различных ретро-вирусных векторов, обеспечивающие надежные трансфекции чужеродных генов в организм птиц и млекопитающих.

Таким образом, с учетом сложности генома животных, а так­же наличия взаимодействия генов в ряде случаев эффект встав­ки гена будет проявляться не в чистом виде, а сопровождаться другим, иногда не контролируемым пока изменением генома.

По-видимому, огромную роль здесь может играть и так на­зываемый эффект положения гена, то есть воздействие внедрен­ного гена будет во многом зависеть от его локализации в гено­ме реципиента.

Имеются данные о том, что вирусы саркомы Молони у мы­шей могут быть использованы для инфицирования клеток эм­бриональной карциномы, которые способны к самостоятельно­му размножению, как и клетки эндодермы эмбрионов мышей» в результате чего вирус, находившийся в клетках в большом числе копий, не проявлял своего действия вследствие метилирования. Однако, если ДНК вводилась в дифференцированную , клетку, действие гена проявлялось.

Существуют и другие, не вирусные, элементы, которые мо­гут служить носителями при переносе генов. Это так называе­мые мобильные элементы. В 1983 г. была изолирована и описа­на ДНК мобильных Р-элементов из дрозофилы. Эти элементы иногда образуют вставки в геноме дрозофилы. Они могут быть вырезаны с большой точностью, после чего мутировавший в результате вставки ген снова начинает проявлять свое действие. При инъекции ДНК предполагаемого Р-элемента задней сторо­ны яиц мух типа М перед самым образованием полярных кле­ток отмечалась высокая степень мутабельности в отдельном локусе, который контролирует морфологию волосков и щетинок на кутикуле взрослых мух. Появление мутантных линий мож­но было демонстрировать гибридизацией in situ, при которой проявлялось включение ДНК Р-элемента. Включенные в геном Р-элементы не содержали ДНК дрозофилы, которая присутство­вала в оригинальном гибридном материале или в участке плазмиды-носителя pBR 322, что доказывает транспозицию элемен­та Р в геном. Затем Рубин и Спрадлинг осуществили соедине­ние гена, контролирующего ксантиндегидрогеназу, и инъециро­вали эту конструкцию в эмбрионы. Взрослые мухи передали своему потомству признак розовой окраски глаз, и таким обра­зом была доказана наследуемость гена. Ученые предложили две модификации ДНК элемента Р для того, чтобы сделать его бо­лее пригодным в качестве носителя: включение большого числа сайтов рестрикции в этот элемент и создание аномального Р-элемента, кодирующего транспозазу, но не включаемого в геном. Р-Элементы были использованы для вставки»различных генов в геном дрозофилы, в частности, допа-декарбоксилазы и спиртовой дегидрогеназы. Оба гена проявляли свое действие на соответствующих стадиях развития, причем в тех тканях, в ко­торых этот ген обычно проявляется.

Наиболее широко для введения генов используется микро­инъекция. Весьма совершенным методом, используемым в по­следнее время для изучения проявления действия генов, явля­ется микроинъецирование в пронуклеус зиготы. Впервые инъецирование было проведено на ооцитах лягушки Xenopus lae­vis, в которые вводили хорошо известную ДНК. В 1975 г. Кол-ман ввел в яйцеклетки и ооциты X. laevis ДНК клонированные гены и наблюдал проявление их действия, чтобы изучить, при­сутствует ли механизм переноса и в ооцитах, и в яйцеклетках. Установлено, что транскрипция рекомбинантной ДНК происхо­дила в обоих случаях. Было показано, что ооциты X. laevis мо­гут транскрибировать рекомбинантные ДНК вполне эффективно, если ДНК вводится в зародышевый пузырек. В 1981 г. осу­ществлено инъецирование гена -глобина кролика в оплодотворенные яйцеклетки X.Laevis.

^ Генная инженерия и воспроизводство животных

К важнейшим хозяйственно ценным признакам сельскохозяйственных животных относятся воспроизводительная способ­ность, плодовитость.

Совершенно очевидно, что эти процессы находятся под стро­гим генетическим контролем, который осуществляет гормональ­ный статус организма, непосредственно влияющий на показа­тели воспроизводства. Установлено влияние ряда гормонов (ФСГ и ЛГ) на функцию воспроизводства.

Стало принципиально возможным методами генной инжене­рии организовать биотехнологическое производство этих гормо­нов для регуляции и стимуляции функций воспроизводства, осуществления работы по трансплантации ранних эмбрионов. В этой связи представляет интерес изучение гена овец по­роды бурула, который является геном, прямо влияющим на функцию яичника овцы.

Бурула — одна из небольшого числа мериносовых пород овец, с высокой генетической обусловленной способностью к высокой плодовитости. Порода представляет большую ценность в качестве генетического улучшателя (путем скрещивания) овец других мериносовых пород в отношении увеличения (40— 60%) их плодовитости. При традиционной внутрипородной се­лекции по этому признаку такой эффективности можно достичь примерно в течение 30 лет.

Плодовитость овец относится к полигенным признакам, на которые оказывают влияние многие гены.

Высокая плодовитость овец бурула — вероятно, следствие влияния одного гена (F), который воздействует на число овулируемых яйцеклеток из яичника за каждый цикл течки. Этот факт возродил интерес к изучению роли основных генов (оли-гогенов) в развитии количественных признаков животных и к развитию методов их распознавания и использования.

Животные — носители бурулагена — уже были использова­ны для генетического улучшения эффективности воспроизвод­ства овец. Ген F ввели в геном животных других пород овец путем скрещивания и разработали точные математические мо­дели для прогноза возможной эффективности этих программ. Технология рекомбинантной ДНК во многом может упростить этот процесс и сделать возможным пересадку гена F не толь­ко в геном овец, но и других видов сельскохозяйственных жи­вотных. Поэтому обзор данных о бурулагене представляет большой интерес для практической генной инженерии сельско­хозяйственных животных.

Изучение межлинейных кроссов показало, что повышение плодовитости — результат скрещивания бурула с другими ме­риносами, а также с различными другими породами овец. Од­нако не всегда повышение плодовитости можно отнести к эф­фекту только одного гена.

Из многих работ, посвященных оценке сравнительной про­дуктивности помесей бурула с овцами других пород, только п одной выявлен эффект F-гена на шерстную продуктивность и живую массу тела. В этой работе было показано, что ген не оказывает нежелательных плейотропных действий на настриг шерсти, толщину и длину волокна, массу новорожденных яг­нят, живую массу взрослых (15-месячных) овец. Эти данные подтверждают, что принципиальный эффект гена — влияние на плодовитость в результате воздействия на степень овуля­ции, в частности число потомков овец с генотипом FF, — был в 1,9 раза больше.

Исследования биологии размножения овец бурула подтвер­дили, что роль F-reiia направлена на контроль физиологии яич­ника овец. Установлено, что овцы бурула имеют одинаковое с контрольными мериносами число развивающихся фолликулов. У овец романовской породы в 2 раза больше развивающихся фолликулов, чем у овец других пород. В пределах популяции

бурула (степень овуляции от 3 до 9) не было корреляции между степенью овуляции в предшествующем цикле и числом антральных фолликулов.

Эти данные подтверждают, что яичник овцы бурула имеет отличие в фолликулярных характеристиках от других плодо­витых пород. Стало очевидно, что F-ген не влияет на увеличе­ние числа развивающихся в яичнике фолликулов. Степень ат-резии среди развивающихся фолликулов также влияет на сходство овец с -геном и не несущих его.

Однако овцы породы бурула характеризуются наличием фолликулов, которые имеют значительно меньшие размеры к моменту овуляции, а также тем, что они содержат только 50% числа гранулированных клеток в каждом развивающемся фол­ликуле; эти морфологи