Реферат: Занять

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені Данила Галицького


КАФЕДРА БІОлогіЧНОЇ ХІМІЇ


МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ для практичних занять

З БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ

(для студентів медичного факультету)


Частина ІI



№ п/п

Тема занять

Кіл-сть годин

Кіл-сть балів

1.

Дослідження біохімічного складу і біосинтезу пуринових та піримідинових нуклеотидів. Біохімічні функції нуклеотидів та нуклеїнових кислот.

3

14

2.

Дослідження катаболізму пуринових нуклеотидів. Визначення кінцевих продуктів їх обміну. Спадкові порушення їх обміну

3

14

3.

Дослідження реплікації ДНК та транскрипції РНК. Аналіз механізмів мутацій, репарацій ДНК. Засвоєння принципів отримання рекомбінантних ДНК, трансгенних білків.

3

14

4.

Біосинтез білка у рибосомах. Дослідження процесів ініціації, елонгації та термінації в синтезі поліпептидного ланцюга. Інгібіторна дія антибіотиків. Засвоєння принципів генної інженерії та клонування генів, їх застосування в сучасній медицині.

3

14

5.

Дослідження молекулярно-клітинних механізмів дії гормонів білково-пептидної природи на клітини-мішені. Механізми дії гормонів – похідних амінокислот та біогенних амінів. Гормональна регуляція гомеостазу кальцію.

3

14

6.

Дослідження молекулярно – клітинних механізмів дії стероїдних та тиреоїдних гормонів на клітини-мішені.

3

14

7.

Дослідження нервової тканини. Патохімія психічних порушень.

3

14

8.

Дослідження процесів м’язового скорочення.

3

14




Індивідуальна самостійна робота студентів




8

9.
^ Підсумковий модульний контроль
3

80



Разом (годин, балів)
27

200
^ Модуль 4. Молекулярна біологія. Біохімія міжклітинних комунікацій


Тематичний план практичних занять з модуля 4


Завдання для самостійної роботи студентів (СРС)


№ п/п

Тема

Кількість годин

1.
^ Підготовка до практичних занять:



1.1

Набути практичні навики з молекулярної біології та генетики:

Малювати схеми послідовних етапів процесів реплікації, транскрипції та трансляції.

1

Пояснювати молекулярні механізми регуляції в реалізації генетичної інформації.

1

Оцінювати вроджені вади метаболізму (молекулярні хвороби) як наслідок генетичних пошкоджень та точкових мутацій.

1

1.2

^ Набути практичні навики з біохімії та молекулярної біології гормональної регуляції:

Писати структурні формули гормонів – похідних амінокислот та стероїдних гормонів.

1

Пояснювати молекулярно-клітинні механізми дії пептидних, стероїдних, тиреоїдних, амінних гормонів.

1

Оцінювати порушення метаболізму при недостатньому та надлишковому утворенні гормонів.

1

Оцінювати зміни гомеостазу кальцію при гормональному дисбалансі.

1

2.

Індивідуальна СРС за вибором (індивідуальне завдання) – за темами рефератів.

1

3.

Підготовка до підсумкового контролю засвоєння модуля 4.

2




Разом

10


При засвоєнні теми за традиційною системою студенту присвоюються бали: „5” – 14 балів, „4” – 10 балів, „3” – 5 балів, „2” – 0 балів.

Максимальна кількість балів за поточну навчальну діяльність студента – 120.

^ Студент допускається до підсумкового модульного контролю за умов виконання навчальної програми та у разі, якщо за поточну навчальну діяльність він набрав не менше 44 балів = (5 × 8 = 40) + 4 (мінімальна кількість балів за індивідуальну самостійну роботу) = 44 балів.

^ Підсумковий тестовий контроль зараховується студенту, якщо він демонструє володіння практичними навичками та набрав при виконанні тестового контролю теоретичної підготовки не менше 50 балів.


Змістовий модуль № 12. Основи молекулярної біології.


^ Тема № 1. Дослідження біохімічного складу і біосинтезу пуринових та піримідинових нуклеотидів. Біохімічні функції нуклеотидів та нуклеїнових кислот.


^ Мета заняття: Знати хімічну будову складових частин нуклеопротеїнів, будову і функціонування нуклеїнових кислот, їх роль у матричних синтезах. Уміти провести якісні реакції на складові частини нуклеопротеїнів.

^ Актуальність теми: Нуклеопротеїни – це складні білки, в яких небілкова частина представлена нуклеїновими кислотами (ДНК і РНК). ДНК, що локалізується в ядрі, зберігає генетичну інформацію про особливості будови всього організму. Різні види РНК відіграють важливу роль у біосинтезі білка.

^ Конкретні завдання:

Знати хімічну будову складових частин нуклеопротеїнів, будову і функціонування нуклеїнових кислот, їх роль в процесах біосинтезу білка.

Вміти виділити нуклеопротеїни з тканин і провести якісні реакції на їх складові компоненти: а) біуретова проба на поліпептиди; б) реакція Тромера на пентози; в) срібна проба на пуринові основи; г) молібденова проба на фосфатну кислоту.


^ Теоретичні питання

Біохімічні функції нуклеїнових кислот та нуклеотидів. Роль нуклеотидів в утворенні молекул нуклеїнових кислот.

Компоненти нуклеотидів та нуклеозидів. Мінорні азотисті основи та нуклеотиди.

Вільні біологічно активні нуклеотиди та їх біохімічні функції: участь у метаболічних реакціях (АТФ, НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, ЦТФ, УТФ) та їх регуляції (циклічні нуклеотиди – 3’,5’-АМФ, 3’,5’-ГМФ).

Нуклеїнові кислоти: структура, властивості, історичні етапи вивчення. Первинна структура нуклеїнових кислот, полярність полінуклеотидів, особливості первинної структури ДНК та РНК.

Будова, властивості та біологічні функції ДНК. Експериментальне доведення генетичної ролі ДНК (феномен трансформації). Молекулярна маса, розміри та нуклеотидний склад молекул ДНК вірусів, прокаріотів та еукаріотів.

Вторинна структура ДНК, роль водневих зв’язків у її утворенні (правила Чаргафа, модель Уотсона-Кріка), антипаралельність ланцюгів.

Третинна структура ДНК. Фізико-хімічні властивості ДНК: взаємодія з катіонними лігандами; гіпохромний ефект; денатурація та ренатурація ДНК.

Будова, властивості й біологічні функції РНК. Типи РНК: мРНК, тРНК, рРНК; особливості структурної організацїї (вторинної та третинної) різних типів РНК.

Молекулярна організація ядерного хроматину та рибосом еукаріотичних клітин. Хроматин: нуклеосомна організація, гістони та негістонові білки. Рибосоми: субодинична структура, склад білків та РНК.
^ Практична робота Якісні реакції на складові частини нуклеопротеїнів
Принцип методу. Для вивчення хімічного складу нуклеопротеїнів зручно користуватися дріжджовими клітинами. Продукти гідролізу можна виявити в гідролізаті реакціями, специфічними для кожної речовини.

^ Матеріальне забезпечення: 500 мг пекарських дріжджів або 100 мг сухих дріжджів, 10% розчин H2SO4, пробірки, піпетки, фільтрувальний папір, водяна баня.

^ Хід роботи: У велику широку пробірку (15 x 1,5 см) кладуть 500 мг пекарських дріжджів або 100 мг сухих дріжджів, заливають 4 мл 10 % розчину H2SO4. Пробірку закривають корком, у який вставлена трубка довжиною 25-30 см, яка служить холодильником, збовтують і ставлять у киплячу водяну баню.

Через 1 – 1,5 год після початку кипіння рідину охолоджують і фільтрують. У фільтраті виявляють продукти гідролізу нуклеопротеїнів: поліпептиди, пуринові та піримідинові азотисті основи, рибозу, дезоксирибозу і фосфатну кислоту.


Дослід 1. Біуретова проба на поліпептиди.

Принцип методу. Біуретова реакція – характерна на сполуки, що містять у своєму складі не менше двох пептидних зв’язків. Такі речовини у лужному середовищі утворюють з СuSO4 комплекс рожево-фіолетового забарвлення. В утворенні цього комплексу беруть участь пептидні зв’язки поліпептидів і білків.

^ Матеріальне забезпечення: гідролізат дріжджів, 10 % розчин NaOH, 30 % розчин NaOH, 1% розчин CuSO4, пробірки, піпетки.

Хід роботи: До 5 крапель гідролізату додають 10 крапель 10 % розчину NaOH і 1 краплю 1 % розчину CuSO4. Рідина забарвлюється в рожево-фіолетовий колір.

У висновку пояснити, що в даній реакції виявляються пептидні зв’язки, якими амінокислоти сполучаються між собою.


Дослід 2. Срібна проба на пуринові основи.

Принцип методу. Пуринові основи з аміачним розчином аргентуму нітрату утворюють осад, що забарвлюється у світло-коричневий колір.

^ Матеріальне забезпечення: гідролізат дріжджів, конц. розчин NH4OH, 1% розчин AgNO3, пробірки, піпетки.

Хід роботи: 10 крапель гідролізату нейтралізують концентрованим аміаком і додають 5 крапель 1 % розчину AgNO3. При стоянні через 3-5 хв випадає невеликий пухкий осад світло-коричневого кольору срібних солей пуринових основ (аденіну, гуаніну). Реакція відбувається за рівнянням:

Зробити висновок.


Дослід 3. Проба Тромера на рибозу і дезоксирибозу.

Принцип методу. Моно- і дисахариди, які мають у своєму складі вільний півацетальний гідроксил, здатні у лужному середовищі відновлювати метали (аргентум, купрум, вісмут та інші). Метали у цій реакції відновлюються з одночасним розривом вуглеводневого ланцюга цукрів та полімеризацією.

^ Матеріальне забезпечення: гідролізат дріжджів, 30 % розчин NaOH, 1% розчин CuSO4, 7 % розчин CuSO4, пробірки, піпетки.

Хід роботи: До 5 крапель гідролізату додають 10 крапель 30 % розчину NaOH і 5 – 10 крапель 7 % розчину CuSO4 до появи муті Cu(OH)2, яка не зникає. Рідину змішують і верхній її шар нагрівають до кипіння. Випадає червоний осад закису міді (внаслідок окиснення рибози і відновлення гідрату окису міді до закису).

У висновку звертається увага на те, що рибоза окислюється, а гідрат окису міді відновлюється до закису міді.


Дослід 4. Реакція на дезоксирибозу та рибозу з дифеніламіном.

Принцип методу. Дифеніламін реагує з пентозами з утворенням сполук синьо-зеленого кольору.

^ Матеріальне забезпечення: гідролізат дріжджів, 1 % розчин дифеніламіну, пробірки, піпетки, водяна баня.

Хід роботи: До 5 крапель гідролізату додають 20 крапель 1 % розчину дифеніламіну і кип’ятять на водяній бані 15 хв; при цьому утворюється сполука синьо-зеленого забарвлення, що вказує на присутність пентоз.

Зробити висновок.


Дослід 5. Молібденова проба на фосфатну кислоту.

Принцип методу. Фосфати у кислому середовищі утворюють з молібдатами забарвлені фосфатно-молібденові комплекси.

^ Матеріальне забезпечення: гідролізат дріжджів, молібденовий реактив,пробірки, піпетки.

Хід роботи: До 10 крапель молібденового реактиву (розчин молібденового амонію в нітратній кислоті) додають 5 крапель гідролізату і кип’ятять декілька хвилин на відкритому вогні. В присутності фосфатної кислоти рідина забарвлюється в лимонно-жовтий колір. При охолодженні випадає жовтий кристалічний осад комплексної сполуки амонію фосфатномолібденового. Молібденова проба на фосфатну кислоту:


H3PO4 + 12 (NH4)2MoO4 + 21 HNO3 (NH4)3PO4MoO2 + 21 NH4NO3 + 12 H2O


У висновку акцентується увага на утворенні комплексної сполуки амонію фосфатномолібденового.


Результати досліджень оформляють у вигляді таблиці:


Назва

реакції

Продукти гідролізу

нуклеопротеїнів

Компоненти нуклеопротеїнів











^ Клініко-діагностичне значення. Аналіз ДНК є стандартним дослідженням для діагностики спадкових захворювань. Він може бути використаний для генотипування фетальної тканини в пренатальній діагностиці, яку застосовують для виявлення потенційних батьків.

Похідні азотистих основ широко застосовуються у практичній медицині. Так, меркаптопурин має антилейкемічну активність, що зумовлена його біологічною активністю як антиметаболіта пуринів. Фторурацил і фторофур як структурні аналоги піримідинів мають протипухлинну активність, що пов’язана з перетворенням їх у 5-фтор-2-дезоксиуридин-5’монофосфат, який є конкурентним інгібітором тимідилатсинтази.


Контроль виконання лабораторної роботи


Що таке повний і неповний гідроліз нуклеопротеїнів?

Назвіть продукти гідролізу нуклеопротеїнів?

Які продукти гідролізу виявляються пробою Тромера?

Які продукти гідролізу дають біуретову реакцію?

Новонароджені в період вигодовування не отримують нуклеїнові кислоти з молоком, але вони інтенсивно ростуть, збільшується кількість клітин, безперервно відбувається гемопоез, синтез білків, тобто відбуваються процеси, що потребують iРНК, тРНК, рРНК, ДНК. За рахунок яких сполук підвищується вміст нуклеїнових кислот?

У двох препаратах ДНК вміст аденіну становить відповідно 25 і 12 % від загального вмісту азотистих основ. Обчисліть відносний вміст тиміну, цитозину і гуаніну в цих препаратах ДНК.
^ Приклади тестів „Крок-1” 1. РНК вірусу СНІДу проникла всередину лейкоцита і за допомогою ензима ревертази спричинила синтез у клітині вірусної ДНК. В основі цього процесу лежить... ^ А. Зворотня транскрипція
B. Дерепресія оперону

C. Репресія оперону

D. Конваріантна реплікація

E. Зворотня трансляція


2. Із нітратів, нітритів і нітрозамінів в організмі утворюється азотиста кислота, яка зумовлює окисне дезамінування азотистих основ нуклеотидів. Це може призвести до точкової мутації – заміни цитозину на..

А. Тимін

В. Урацил

С. Аденін

D. Гуанін

E. Інозин


3. Нітрозаміни належать до дезамінуючих мутагенів. З якої азотистої основи в результаті їх дії утворюється урацил?

А. Цитозину

B. Аденіну

C. Гуаніну

D. Тиміну

E. Метилурацилу


Індивідуальна самостійна робота студентів

Структура, властивості та біологічне значення нуклеопротеїнів, фосфопротеїнів, ліпопротеїнів та глікопротеїнів.

Особливості синтезу та розпаду нуклеопротеїнів, глікопротеїнів і протеогліканів.



Література
Основна:

Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення / За ред. О.Я Склярова. – К.: Здоров’я, 2004. – 191 с.

Губський Ю.І.. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 41-56.

Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – С. 435-447.

Практикум з біологічної хімії. / За ред. О.Я.Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 47-50.

Додаткова:

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 96-113.

Вдовенко Н.В. Фізіологічна роль та фармакологічні властивості АТФ і її похідних // Вісн.пробл. біології і медицини. – 2004. – Вип. 1. – С. 3-8.

Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – С. 86-93.

Кордюм В., Похоленко Я., ДНК- вакцины – расширение возможностей // Вісн. фармакології та фармації. – 2004. – № 10. – С. 2-9.

Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – М.: Мир, 1993. – Т. 2. – С. 5-14.

Мещишен І.Ф., Пішак В.П., Григор’єва Н.П. Біомолекули: структура та функції. – Чернівці: Медик, 2000. – С. 52-57



Тема № 2. Дослідження катаболізму пуринових нуклеотидів. Визначення кінцевих продуктів їх обміну. Спадкові порушення їх обміну.


Мета заняття: Засвоїти особливості реакцій синтезу та розпаду пуринових і піримідинових нуклеотидів в нормі та за умов природжених ензимопатій цих процесів. Оволодіти методами визначення кількості сечової кислоти у біологічних рідинах та вміти інтерпретувати отримані дані.

^ Актуальність теми: Порушення процесів біосинтезу і катаболізму пуринових та піримідинових азотистих основ та нуклеотидів можуть приводити до розвитку таких захворювань як синдром Леша-Ніхана, подагра, оротацидурія. Знання основних метаболітів та ензимів цих процесів є необхідним для діагностики і контролю за лікуванням.

^ Конкретні завдання:

Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму пуринових нуклеотидів, порушення синтезу сечової кислоти і біохімічні основи розвитку подагри.

Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму піримідинових нуклеотидів.

Кількісно визначити сечову кислоту в біологічних рідинах, вміти інтерпретувати отримані результати.


^ Теоретичні питання

Біосинтез пуринових нуклеотидів; cхема реакцій синтезу ІМФ; утворення АМФ, ГМФ, АТФ, ГТФ. Регуляція біосинтезу пуринових нуклеотидів за принципом негативного зворотного зв’язку (ретроінгібування).

Біосинтез піримідинових нуклеотидів: реакції; регуляція.

Біосинтез дезоксирибонуклеотидів. Утворення тимідилових нуклеотидів; інгібітори біосинтезу дТМФ як протипухлинні засоби (структурні аналоги дТМФ, похідні птерину).

Катаболізм пуринових нуклеотидів; cпадкові порушення обміну сечової кислоти. Клініко-біохімічна характеристика гіперурикемії, подагри, синдрому Леша-Ніхана.
^ Практична робота
Дослід 1. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові.

Принцип методу. Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти у сироватці крові.

^ Матеріальне забезпечення: сироватка або плазма крові, 10 % розчин натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату, 10 % розчин натрію карбонату, 0,35 М розчин сульфатної кислоти, фосфатвольфраматний реактив (реактив Фоліна), 30 мкМ розчин сечової кислоти, піпетки, пробірки, центрифуга.

^ Хід роботи: У центрифугову пробірку вміщують 0,5 мл сироватки крові та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірки перемішують і додають 0,25 мл 0,35 М розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл 10% розчину натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату. Вміст пробірки перемішують і через 5 хв центрифугують протягом 10 хв за швидкості 3000 об/хв. Проводять визначення сечової кислоти за наступною схемою.


Визначення сечової кислоти в сироватці крові




Контрольна проба, мл

Стандартна проба, мл

Дослідна проба, мл

Надосадова рідина

-

-

2

Стандартний розчин сечової кислоти

-

2

-

Вода дистильована

2

-

-

Розчин натрію карбонату

1

1

1

Фосфатвольфраматний реактив

0,5

0,5

0,5



Вміст пробірок перемішують. Через 30 хв визначають оптичну густину стандартної та дослідних проб за довжини хвилі 640 нм (590-700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі затовшки 10 мм. Забарвлення є стабільним протягом 30 хв.

Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:

Ао

С = × 30 × 10,

Ас

де: С – вміст сечової кислоти у дослідній пробі, мкмоль/л; Ао – оптична густина дослідної проби; Ас – оптична густина контрольної проби; 30 – вміст сечової кислоти у стандартному розчині, мкмоль/л; 10 – величина розведення сироватки.

У чоловіків вміст сечової кислоти у сироватці крові становить 240-500 мкмоль/л, у жінок – 160-400 мкмоль/л.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.
^ Дослід 2. Кількісне визначення сечової кислоти в сечі.
Принцип методу. Метод грунтується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфатвольфраматний реактив до фосфатвольфраматного синього, інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту сечової кислоти. Кількість фосфатвольфраматного синього визначають шляхом титрування червоною кров’яною сіллю. Остання окиснює фосфатвольфраматний синій і синє забарвлення зникає.

^ Матеріальне забезпечення: сеча, фосфатвольфраматний реактив Фоліна, 20% розчин натрію карбонату Na2CO3, 0,01н розчин калію фериціаніду K3[Fe(CN)6] (червона кров’яна сіль), стандартний розчин сечової кислоти (0,5 мг в 1 мл), мікробюретки, колбочки для титрування, піпетки, пробірки.

^ Хід роботи: Паралельно до 1,5 мл сечі та 1,5 мл стандартного розчину сечової кислоти додають по 1 мл 20% розчину натрію карбонату і по 1 мл фосфатвольфраматного реактиву Фолінa, змішують і титрують 0,01 н розчином калію фериціаніду до зникнення синього забарвлення.

Вміст сечової кислоти (в міліграмах) в добовій сечі вираховують за формулою:

0,75 × В × D

Х =

1,5 × С

де, 0,75 - кількість сечової кислоти у стандартній пробі, мг; B – кількість калію фериціаніду, що пішла на титрування дослідної проби сечі, мл; C – кількість калію фериціаніду, що пішла на титрування стандартної проби сечової кислоти, мл; D – добовий діурез, мл.

Коефіціент перерахунку в одиниці СІ (ммоль/добу) дорівнює 0,0059.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

^ Клініко-діагностичне значення. Утворена в результаті розпаду пуринових основ сечова кислота виділяється нирками. У нормі в людини з сечею виділяється 1,60-3,54 ммоль/добу (270-600 мг/добу) сечової кислоти. Нормальний вміст сечової кислоти в сироватці крові становить для чоловіків – 240 – 530 мкмоль/л (0,05-0,06 г/л), для жінок приблизно на 25 % менше – 185-440 мкмоль/л (0,04-0,05 г/л). Гіперурікемія – зростання концентрації сечової кислоти у крові, гіперурикурія (гіперуратурія) – збільшення вмісту сечової кислоти у сечі. Гіперурикемія викликає подагру, захворювання, що виникає за умов преципітації уратів у тканинах, у першу чергу, в суглобах. Сечова кислота та її солі надзвичайно погано розчиняються у воді, нормальні концентрації їх в рідинах організму наближені до межі розчинності. Для лікування подагри використовують препарати, що гальмують утворення сечової кислоти (алопуринол) або стимулюють виведення її нирками (антуран, цинхофен). У хворих на подагру значення концентрації сечової кислоти у крові майже завжди перевищує 0,075-0,080 г/л, а під час утворення у них подагричних ущільнень вміст її рідко буває нижчим ніж 0,08-0,09 г/л.


Контроль виконання лабораторної роботи

Яким методом можна визначити рівень сечової кислоти в сечі?

Який вміст сечової кислоти у крові і сечі здорової дорослої людини ?

Похідне уридину, фторурацил, перетворюється в клітині на фтордезоксіуридилат – сильний незворотній інгібітор тимідилатcинтази. Як пояснити факт пригнічення фторурацилом швидкого поділу ракових клітин у експериментальних тварин?

Тетрацикліни, антибіотики широкого спектру дії, є інгібіторами синтезу білків на 70S-рибосомах прокаріотів і не впливають на 80S-рибосоми еукаріотів. Рибосоми мітохондрій еукаріотів за структурою подібні до рибосом прокаріотів (70S). Використовуючи ці дані поясніть токсичний ефект дії тетрациклінів на організми еукаріотів.



^ Приклади тестів “Крок-1” 1. У сечі місячної дитини виявлено підвищений вміст оротової кислоти. Дитина погано набирає масу тіла. Які речовини потрібно використати для нормалізації метаболізму?
А. Уридин

B. Аденозин

C. Гуанозин

D.Тимідин

E. Гістидин


2. Утворення тимідилових нуклеотидів, які використовуються для біосинтезу ДНК, відбувається з дУДФ, що спершу гідролізується до дУМФ, а далі метилюється. Яка сполука слугує донором метильних груп?

A. Лецитин

B. Холін

C. Метилентетрагідрофолат

D. Метіонін

E. Карнітин


3. У реакції перетворення рибози на дезоксирибозу під час утворення дезоксирибонуклеотидів, що використовуються для синтезу ДНК, бере участь низькомолекулярний білок тіоредоксин. Він містить дві SH-групи, що можуть переходити в окиснену форму. Який коензим використовується для відновлення тіоредоксину?

А. Коензим Q

B. ПАЛФ

C. НАДФН

D. НАДН

E. АМФ


4. Чоловіка віком 60 років прооперували з приводу раку простати. Через 2 місяці йому призначили курс хіміотерапії. До комплексу лікарських препаратів входив 5-фтордезоксіуридин – інгібітор тимідилатсинтази. Синтез насамперед якої речовини блокується під дією цього препарату?

А. іРНК

B. рРНК

C. тРНК

D. ДНК

E. Білка


Індивідуальна самостійна робота студентів

Особливості процесів синтезу та розпаду пуринових і піримідинових нуклеотидів в нормі та при патології.

Роль аденілових нуклеотидів в регуляції активності ферментів.



Література
Основна:

Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення /За ред. проф. Склярова О.Я.- Київ: Здоров’я, 2004.-191с.

Губський Ю.І.. Біологічна хімія. Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - С. 270-283.

Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини.-Тернопіль: Укрмедкнига, 2001.- С. 448-462.

Практикум з біологічної хімії. / За ред О.Я.Склярова .-К.: Здоров’я, 2002.-180-189 с.

Додаткова:

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина, 1998. – С. 469-508.

Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. - М.: Мир, 2000. - С. 188-193.

Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. - М.: Мир, 1993.- Т.2.- С.15-34.

Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Особливості обміну речовин у дітей. – Чернівці: БДМА, 2003. - С.18-25.

Робак Т. Застосування нових аналогів пуринів в лікуванні хронічної лейкемії. (Огляд).// Укр. Мед. часопис. – 1998. – №3 (5). – С. 33 – 38.



Тема № 3. Дослідження реплікації ДНК та транскрипції РНК. Аналіз механізмів мутацій, репарацій ДНК. Засвоєння принципів отримання рекомбінантних ДНК, трансгенних білків.


^ Мета заняття: Знати закономірності матричного синтезу нуклеїнових кислот, етапи цих процесів, механізми мутацій, репарацій та виникнення і розвитку спадкових захворювань. Засвоїти механізм дії антибіотиків та інших інгібіторів синтезу нуклеїнових кислот. Вміти кількісно визначити вміст ДНК у біологічному матеріалі.

^ Актуальність теми: В процесі біосинтезу нуклеїнових кислот можливі різноманітні порушення нуклеотидної послідовності під впливом фізичних (нагрівання, іонізуючі, корпускулярні опромінення), хімічних (мутагени) та біологічних (віруси) факторів. У медичній практиці широко використовуються фармацевтичні препарати, що інгібують біосинтез нуклеїнових кислот у прокаріотичних організмах та гальмують поділ клітин пухлин у онкологічних хворих.

^ Конкретні завдання:

Оволодіти методом кількісного визначення ДНК в біологічному матеріалі з метою оцінки інтенсивності реплікаційних та біосинтетичних процесів.

Трактувати молекулярно–біологічні закономірності збереження та передачі генетичної інформації, роль ферментних систем, що забезпечують напівконсервативний механізм реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

Пояснювати механізми функціонування ферментної системи транскрипції РНК.

Трактувати механізми регуляції експресії генів на рівні транскрипції оперонів, які включають структурні та регуляторні гени, промотор та оператор.

Трактувати біохімічні механізми генетичних рекомбінацій, ампліфікації генів, особливості регуляції експресії генів у еукаріотів.

Аналізувати наслідки геномних, хромосомних та генних мутацій, механізми дії найбільш поширених мутагенів, біологічне значення та механізми репарації ДНК (репарація УФ–індукованих генних мутацій).


^ Теоретичні питання


Біологічне значення реплікації ДНК. Сутність відкриття Дж. Уотсона та Фр. Кріка (1953). Напівконсервативний механізм реплікації; схема експерименту М.Мезелсона та Ф.Сталя.

Загальна схема біосинтезу ДНК. Ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів. Молекулярні механізми реплікації ДНК: топологічні проблеми (топоізомерази, хелікази); значення антипаралельності ланцюгів ДНК; фрагменти Оказакі. Етапи синтезу дочірніх ланцюгів молекул ДНК.

Загальна схема транскрипції; кодуючі та некодуючі ланцюги ДНК. РНК–полімерази прокаріотів та еукаріотів. Етапи та ферменти синтезу РНК. Сигнали транскрипції: промоторні, ініціаторні, термінаторні ділянки генома.

Процесинг – посттранскрипційна модифікація РНК. Антибіотики – інгібітори транскрипції.

Регуляція експресії генів прокаріотів: схема регуляції за Ф. Жакобом та Ж. Моно. Будова Lac–оперону E.сoli: структурні та контрольні гени; промотор, оператор; регуляторний ген та утворення білкових репресорів. Принципи функціонування Lac–оперону: репресія, індукція.

Особливості будови та експресії геному еукаріотів. Молекулярна організація ДНК еукаріотів (екзони, інтрони; послідовності, що повторюються). Ядерний хроматин та хромосоми еукаріотів; каріотип людини.

Генетичні рекомбінації; транспозони. Рекомбінації геному прокаріотів (трансформація, трансдукція, кон’югація). Процеси рекомбінації у еукаріотів на прикладі утворення генів H– та L–ланцюгів молекул імуноглобулінів.

Ампліфікація генів (гени металотіонеїну, дигідрофолатредуктази).

Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні транскрипції; cистема транскрипційних сигналів – промоторні послідовності, енхансери, атенюатори, сайленсери. Ковалентна модифікація гістонів та НГБ як один з механізмів контролю експресії генів.

Фази клітинного циклу еукаріотів. Біохімічні механізми контролю вступу клітини до мітозу; сdс2–кіназа, циклін.

Мутації: геномні, хромосомні, генні (точкові); роль у виникненні ензимопатії та спадкових хвороб людини.

Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів – аналогів азотистих основ, дезамінуючих, алкілуючих агентів, ультрафіолетового та іонізуючого випромінювання.

Біологічне значення та механізми репарації ДНК. Репарація УФ-індукованих генних мутацій; пігментна ксеродерма.


^ Практична робота


Дослід 1. Визначення ДНК за фосфором.

Принцип методу. Метод грунтується на отриманні вільних нуклеїнових кислот із наступним визначенням кількості ДНК за фосфором, що утворюється у формі фосфату після мінералізації (спалювання) ДНК. Визначення фосфору проводять фотоколориметрично за реакцією з амонію молібдатом за присутності відновника (аскорбінова кислота). Інтенсивність забарвлення продукту реакції – молібденової сині – є пропорційною кількості фосфору у пробі.

^ Матеріальне забезпечення: Тканина печінки щурів, 1 н розчин натрію гідроксиду (NaOH), 30 % розчин натрію гідроксиду (NaOH), насичений розчин натрію хлориду (NaCl), 20 % розчин ацетатної кислоти (CH3COOH), етиловий спирт, 5 % розчин ТХАК, концентрована сульфатна кислота (H2SO4), 30 % розчин гідрогену пероксиду (Н2О2), стандартний розчин калію дигідрогенфосфату (КН2РО4) 0,01 мг/мл, 2,5 % розчин амонію молібдату ((NH4)2MoO4), 1 % розчин аскорбінової кислоти, центрифуга, ФЕК, пробірки центрифугові, скляні палички, колба К’єльдаля, конічна колба, льодяна баня, пісчана баня.

^ Хід роботи:

1. Оброблення тканин основою. Наважку тканини печінки масою 100 мг нагрівають з 1 мл 1 н розчину натрію гідроксиду у центрифужній пробірці протягом 15 хв на киплячій водяній бані. Періодично вміст пробірки перемішують скляною паличкою.

2. Послідовне осадження білків і ДНК. Пробу поступово охолоджують за кімнатної температури, а потім за температури 0°С (лід). До охолодженого гідролізату додають 0,5 мл насиченого розчину натрію хлориду у 20 % розчині ацетатної кислоти для осадження білків. Осаджений білок видаляють через 5 хв шляхом центрифугування протягом 5 хв за швидкості 5000 об/хв. Центрифугат зливають у центрифужну пробірку (під час охолодження на льоду), додають до нього 6 мл етилового спирту і витримують протягом 1 год на холоді для повного осадження ДНК. Ще раз центрифугують протягом 5 хв за швидкості 5000 об./хв. Осад ДНК відмивають 5 мл 5% розчину ТХАК.

3. Визначення ДНК за фосфором. Осад ДНК кількісно переносять у колбу К’єльдаля, додають 1,5 мл сульфатної концентрованої кислотиі нагрівають (мінералізують) на пісчаній бані до повного освітлення розчину. Для прискорення мінералізації до розчину обережно додають декілька крапель 30 % розчину гідрогену пероксиду (по одній краплі). Після закінчення мінералізації рідину з колби К’єльдаля кількісно (вимірюючи об’єм) переносять у колбу Ерленмеєра. Розчин нейтралізують 30 % розчином натрію гідроксиду за допомогою універсального індикатора. Отриманий мінералізат переносять кількісно у мірну колбу на 50 мл і доводять до позначки дистильованою водою. З колби у пробірку відбирають 5 мл розчину, додають 0,5 мл 2,5 % розчину амонію молібдату, 0,5 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і 4 мл дистильованої води. Через 10 хв вимірюють оптичну густину розчину проти води за червоного світлофільтра (довжина хвилі 670 нм) у кюветах завтовшки 5 мм. Вміст фосфору визначають у мікрограмах за калібрувальною кривою.

Для побудови калібрувального графіка використовують стандартні розчини калію дигідрогенфосфату, які містять відповідно 1, 2, 3, 4 мкг фосфору в 1 мл проби. На осі абсцис відкладають значення концентрацій стандартних розчинів, а на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини. Вміст ДНК визначають у мг% за формулою:

С = а х 10, де

С– вміст ДНК ( мг%),

а – концентрація фосфору (мкг/мл),

10– коефіцієнт перерахунку.

Нормальний вміст ДНК у печінці щурів становить 25–35 мг на 100 г.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

^ Клініко–діагностичне та практичне значення. Визначення кількості ДНК у тканинах пухлини використовують для оцінки прогнозу онкологічних захворювань та можливої індивідуалізації наступного лікування. Крім того, виділюють ДНК з клінічних зразків ( біоптати тканин, крапля крові, сперма, слиз жіночих статевих органів, осад сечі, волосся людини, зішкреби епітеліальних клітин тощо) для ланцюгової полімеразної реакції в діагностиці вірусних та спадкових хвороб людини, ідентифікації особини ("ДНК–діагностика") тощо.

При доклінічному експериментальному дослідженні новостворених фармпрепаратів вивчають їх безпосередній вплив як на клітинні органели (ядро, мітохондрії тощо), так і їх компоненти. Тому, в разі отримання субклітинних фракцій клітин, необхідний суворий контроль за їх чистотою і гомогенністю. Однією з головних причин забруднення цитоплазматичних фракцій ядерним матеріалом (а саме, ДНК) є неякісна гомогенізація, що призводить до руйнування ядер. Для оцінки чистоти отриманих цитоплазматичних фракцій у них кількісно визначають ДНК.


^ Контроль виконання лабораторної роботи

1. З мінералізатом ДНК провели реакцію з розчином амонію молібдату і отримали позитивну реакцію – молібденову синь. Який складник ДНК дає позитивну реакцію?

А. Пуринові основи
^ В. Піримідинові основи С. Пуринові нуклеозиди D. Піримідинові нуклеозиди Е. Фосфатні залишки

2. На одному з етапів визначення ДНК за фосфором використовують 1 % розчин аскорбінової кислоти. В якій хімічній реакції вона бере участь?

А. Окиснення

В. Відновлення
^ С. Гідролізу D. Мінералізації Е. Комплексоутворення

3. Похідне уридину – фторурацил, який перетворюється в клітині в фтордезоксиуридилат – сильний незворотній інгібітор тимідилатсинтази. Як пояснити факт пригнічення фторурацилом швидкого поділу ракових клітин у експериментальних тварин?


4. У пацієнта діагностовано пігментну ксеродерму. Його шкіра є надзвичайно чутливою до пошкоджуючої дії сонячного світла. Поясніть причину виникнення цієї патології. Наслідком спадкового порушення синтезу якого УФ–специфічного ферменту є це захворювання?

На чому грунтується метод отримання ДНК?

В чому полягає суть мінералізації ДНК?

Який принцип визначення ДНК за фосфором?

Якими реактивами осаджують білки з охолодженого гідролізату?

Яким реактивом і при яких умовах відбувається повне осадження ДНК?

Як називається кінцевий продукт реакції, на якому базується визначення ДНК за фосфором?

Яке клініко–діагностичне значення визначення ДНК у біоптатах?


Приклади тестів „ Крок–1”

1. Із нітратів, нітритів і нітрозамінів в організмі утворюється азотиста кислота, яка зумовлює окисне дезамінування азотистих основ нуклеотидів. Це може призвести до точкової мутації – заміни цитозину на:

А. Тимін

В. Урацил

С. Аденін

D. Гуанін

E. Інозин


2. У пацієнта діагностовано СНІД. У його лейкоцити потрапила РНК вірусу СНІДу, де за участю ферменту реверта