Реферат: Министерство   сельского хозяйства                                           Утверждаю

 

     МИНИСТЕРСТВО

  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                                           Утверждаю

   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                                       Заместитель руководителя

 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                                     Департамента ветеринарии

(Минсельхозпрод России)                                   В.В.Селиверстов


07.10.99г.   № 13-4-2/1755


МЕТОДИЧЕКИЕ УКАЗАНИЯ

по диагностике алиментарных токсикозов у рыб


^ 1. Общие положения

Алиментарные токсикозы рыб вызываются веществами различной природы, которые 

попадают в комбикорма с сырьем или образуются в процессе неправильного хранения корма. 

Токсический эффект проявляется как в гибели рыб, так и в различных патологических отклонениях в 

их физиологическом состоянии.


Диагностика алиментарных токсикозов состоит из трех этапов: 1 -обследование рыбы (с 

целью выявления глубины токсикоза), 2 - исследование корма и определение степени его 

токсичности, 3 - обнаружение и количественное определение токсического агента.


^ 2. Обследование рыбы

Алиментарные токсикозы рыб проявляются, в зависимости от дозы и кратности поступления 

токсиканта, в острой и хронической формах. Высокие дозы токсиканта вызывают острые токсикозы, 

сопровождающиеся массовой гибелью рыб. При низких дозах интоксикация сопровождается по 

истечении определенного срока (около 30-40 дней) нарушением обменных процессов, замедлением 

роста, снижением резистентности и даже гибелью наиболее ослабленных экземпляров рыб.


^ 2.1. Острые токсикозы вызываются дозами, значительно превышающими МДУ (максимально 

допустимые уровни), и приводят к быстрой гибели рыб в течение 1-3 суток. В зависимости от вида 

токсиканта клинические признаки могут быть самыми разными, но, как правило, поражаются 

нервная, опорно-двигательная или кроветворная системы.


^ 2.2. Хронические токсикозы проявляются поэтапно. Их проявление сходно с симптомами, 

наблюдаемыми при неполноценном или несбалансированном кормлении. Болезнь имеет несколько 

стадий развития.


I стадия. Видимых клинических признаков заболевания не обнаруживается. Отмечают 

отклонение показателей обмена веществ от нормы, что проявляется в снижении темпа роста, а 

иногда в форме катарального воспаления кишечника.


^ II стадия. Длительное скармливание недоброкачественных кормов приводит к снижению 

естественной неспецифической резистентности рыб, изменению гематологических показателей, 

воспалению ануса, различных отделов кишечника и выделению слизистых тяжей вместе с 

экскрементами.


^ III стадия. При длительном потреблении слаботоксичных кормов болезнь приобретает 

хроническую форму. При внешнем осмотре рыб выявляют дряблость мышц, симптом "острой 

спины", изменение окраски тела и плавников, язвы и кровоизлияния различной локализации, 

опухоли. При патологоанатомическом вскрытии отмечают ожирение печени, гидремию почек, 

увеличение их объема, наличие опухолей, асцит, энтерит. Хронические токсикозы приводят к 

снижению воспроизводительной функции, появлению физиологически неполноценного потомства, 

снижению резистентности. В отдельных случаях рыбы могут сохранять нормальные показатели 

темпа роста.


^ 2.3. Для диагностики алиментарных токсикозов исследованию подвергают по 10 рыб из 

каждой группы. Рыбы исследуемой группы считаются больными, если выявлено не менее 20 % рыб 

с нарушением обмена веществ. Диагноз устанавливают по среднегрупповым значениям показателей 

в выборке, а по индивидуальным - с учетом симптоматики заболевших рыб.


^ 2.4. Для диагностики стадии течения токсикозов используют различные физиолого-

биохимические методы. Для выявления нарушений используют не менее 5-10 физиолого-

биохимических показателей (белок, остаточный азот, азот аминокислот, мочевина, липиды, 

холестерин, глюкоза, мочевая кислота, аспартатаминотрансфераза, холинэстераза сыворотки крови и 

др.). На этой стадии заболевание диагностируют гематологическими методами, подробно 

изложенными в "Методических указаниях по проведению гематологического обследования рыб", 

утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 02.02.99 г., № 13-4-2/1487. 

Степень патологических отклонений определяется гистологическими методами.


^ 2.5. Любой токсический агент, содержащийся в комбикормах, может вызывать 

неспецифическую реакцию организма рыб: повышение содержания глюкозы в крови, снижение 

содержания белка и гидремию, увеличение содержания гликогена в печени. Картина крови 

характеризуется микроцитарной базофильной или полихроматофильной анемией.


^ 2.6. Одновременно с неспецифической реакцией каждый из алиментарных факторов вызывает 

заболевание рыб, отражающееся в специфическом изменении обменных процессов. Характер 

изменений физиолого-биохимических показателей обмена веществ и клинические признаки у рыб 

при токсикозах, вызванных некоторыми  распространенными  алиментарными  факторами, 

приведен  в приложении 1.


^ 3 3. Исследование корма.

Качество кормов оценивают на общую токсичность по выживаемости тест-объектов. При 

выявлении их токсичности специальными методами определяют наличие в них окисленных жиров, 

микотоксинов, тяжелых металлов, пестицидов и других загрязнителей (Санитария кормов: 

справочник, 1991).


^ 3.1. Максимально допустимые уровни (МДУ) содержания патогенных факторов в 

комбикормах


3.1.1. Для карпа (от сеголетков до товарной рыбы) МДУ на продукты окисленных жиров 

разработаны для хозяйств с низкой естественной кормовой базой. Для всех возрастов карпа 

недопустимо превышение:

- кислотного числа: 50 мг КОН в 1 г жира;

- перекисного числа: 1,0 % йода;

- альдегидного числа: 1,0 Е г/100 мл/см (в единицах оптической плотности). МДУ 

микотоксинов:

- Т-2-токсин: 0,05 мг/кг корма,

- ДОН-токсин: 3,33 мг/кг корма.

Суммарное содержание продуктов микробиосинтеза: паприна (БВК, дрожжи на 

нефтепарафинах), гаприна (БВК, дрожжи на природном газе), гиприна (гидролизные, кормовые 

дрожжи) - 5 % массы корма,


^ 3.1.2. Для лососевых рыб

МДУ на афлатоксины не разработаны

- радужная форель наиболее чувствительна к афлатоксинам;

- афлатоксин B1 (0,03 - 0,06 мг/кг корма) вызывает массовую гибель мальков;

- концентрации 0,5-1,0 мг/кг корма вызывают образование опухоли печени;

- афлатоксины В2, G1 и G2 встречаются в кормах реже и в меньших

концентрациях, чем афлатоксин В1 они также уступают ему в токсичности и

канцерогенности;

^ МДУ на госсипол для рыб не разработаны

- доза 0,1 г/кг - вызывает изменения гематологических показателей и нарушает процесс 

синтеза белка;

доза 0,3 г госсипола на 1 кг корма подавляет рост рыб.


^ 3.2. Определение токсичности фуражного зерна, продуктов его переработки и комбикормов с 

использованием рыб-гуппи При санитарной оценке концентрированных кормов их необходимо 

исследовать на токсичность, которая может быть обусловлена за счет наличия в кормах химических 

соединений и микотоксинов. Для этой цели в соответствии с ГОСТ отбирают средние пробы кормов 

и отправляют в лабораторию на исследование, при котором определяют общую токсичность и 

присутствие микотоксинов.


^ 3.2.1. Определение общей токсичности.

Исследования проводят по Методике, утвержденной ГУВ МСХ СССР 04.06.1980г. Принцип 

методики основан на извлечении из фуражного зерна, продуктов его переработки, комбикормов 

ацетоном жиро- и водорастворимых фракций токсических веществ и  последующем воздействиэтих 

фракций на аквариумных рыб-гуппи.


Методика позволяет определить токсичность концентрированных кормов в течение суток без 

учета времени подготовки образцов для тестирования.


Пробу фуражного зерна (ячмень, овес, пшеница, горох, кукуруза, просо) 50 г тщательно 

измельчают на лабораторной мельнице (отруби и комбикорма экстрагируют без измельчения), 

помещают в плоскодонную колбу с притертой пробкой, заливают 150 мл ацетона и экстрагируют 

при встряхивании на шуттель-аппарате в течение двух часов.


Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в фарфоровую чашу и выпаривают под тягой на 

водяной бане (Т 55-60°) досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона и переносят его в 

химический стакан (емкостью 700-800 мл, диаметром 11-15 см) с 500 мл воды из аквариума 

комнатной температуры (17-20°). Экстракты из комбикормов, кукурузы, гороха и проса после 

растворения в воде помещают в бытовой холодильник на 40-45 мин. при Т 6-7°С, по истечении срока 

экстракты фильтруют через небольшой слой ваты, подогревают до исходной температуры (17-20°). 

В воду с экстрактом помещают 5 рыб-гуппи независимо от пола, возраста, за которыми ведут 

наблюдение, отмечая их гибель через 24 часа (гуппи, вышедшие из опыта, выбраковываются),

Примечание. Если фуражное зерно, продукты его переработки и комбикорм окажутся 

токсичными, такие партии кормов немедленно исключаются из рациона и проводят дополнительные 

дифференциальные исследования  на хлор-  и фосфорорганические соединения, препараты ртути, 

алкалоиды (по ранее разработанным методикам) и микотоксины.


^ 3.2.2. Определение микотоксинов.

Методика основана на извлечении микотоксинов из фуражного зерна, продуктов его 

переработки комбикормов, частичной очистки экстракта гексаном от липидов и некоторых 

неполярных хлор- и фосфорорганических соединений с последующей переэкстракцией 

микотоксинов хлороформом и исследованием на рыбах-гуппи. Методика позволяет определить 

токсичность в течение 24-30 часов.


Пробу фуражного зерна 50 г тщательно измельчают на лабораторной мельнице (отруби и 

комбикорма экстрагируют без измельчения), помещают в плоскодонную колбу с притертой пробкой, 

заливают 150 мл ацетона и экстрагируют при встряхивании на шуттель-аппарате в течение двух 

часов или в статическом состоянии - 20 часов. Экстракт фильтруют через бумажный обеззоленный 

фильтр в фарфоровую чашку и упаривают под тягой на водяной бане (55-60°) до объема 45-50 мл. 

^ Остаток переносят в делительную воронку, в которую добавляют 10 мл воды. Содержимое чашки 

смывают 5 мл ацетона, сливают в делительную воронку и встряхивают одну минуту. Затем в 

воронку вносят 50 мл гексана и встряхивают 1-2 минуты. После разделения слоев - нижний сливают 

в другую делительную воронку и дважды экстрагируют 40 мл хлороформа (в каждом случае 

встряхивают две минуты). Гексановую фракцию, при необходимости, исследуют на хлор и 

фосфорорганическое соединения. После разделения слоев хлороформные фракции (нижний слой) 

сливают в фарфоровую чашку и упаривают под тягой на водяной бане (55-60°) до исчезновения 

хлороформа (досуха). Сухой остаток растворяется 5 мл ацетона и переносят его в химический стакан 

с 500 мл воды (17-20°), взятой из аквариума. В раствор экстракта помещают пять гуппи независимо 

от пола и возраста, за которыми ведут наблюдение, отмечая их гибель через 24 часа. Для повышения 

биологической достоверности результатов численность тест-организмов необходимо увеличить до 

10 штук, то есть проводить биоанализ в двух повторностях.


^ 3.2.3. Результаты определения.

В зависимости от степени токсичности исследуемого корма гуппи погибают в сроки, 

указанные в таблице 1.


Таблица 1. 

Оценка степени токсичности исследуемого корма


________________________________________________________________________________

^ Степень токсичности     Количество погибших        Время гибели, 

       кормов               гуппи, экз.              (в часах)

    Нетоксичный             Не более 1            В течение 24 час.

    ^ Слаботоксичный             2-4                     - " -

    Токсичный                   5                      - " -

________________________________________________________________________________


^ 3.3. Определение токсичности кормов с использованием инфузории Тетрахимена 

пириформис


Исследования проводят в соответствии с «Методическими рекомендациями по биологической 

оценке продуктов животноводства и кормов с использованием тест-объектов тетрахимена 

пириформис», М., ВАСХНИЛ, 1977 г. (М., Колос, 1978 г.). Работу проводят следующим образом. 

^ Взятые на анализ пробы кормов тщательно перемешивают и растирают в ступке. Берут ряд навесок 

(не меньше 3 - 5) в количествах, обратно пропорциональных предполагаемой токсичности, но не 

более 300 мг в наибольшей по массе навеске. Их вносят в пробирки или флаконы и заливают по 2 мл 

чистой кипяченой воды, закрывают резиновыми пробками с вырезкой для доступа воздуха, что 

предотвращает выбрасывание пробок при нагревании флаконов. Прогревают в водяной бане (или 

стерилизаторе) 15-20 мин. при температуре 80-90°С. После охлаждения до комнатной температуры 

во флаконы вносят по 0,05 мл культуры Тетрахимены пириформис, разведенной перед этим водой в 

^ 10 раз, и ставят в термостат при +25°С или в обычный шкаф в затемненное место при комнатной 

температуре на 1—4 суток.


Наличие роста, его степень контролируют каждые сутки под микроскопом (МБС - 

микробиологический стереоскопический) при увеличении 2х8. Это позволяет просматривать пробы 

прямо в пробирке или флакончике, не беря их пипеткой, что является предварительным контролем, 

за которым следует просмотр в капле под МБИ (увеличение 7х90). Каплю берут на предметное 

стекло пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой, просматривают весь объем, все слои. 

^ Контролем является водопроводная, дехлорированная путем кипячения вода, в которую 

одновременно с опытом также засевают культуру инфузорий.


^ Угнетение подвижности, наличие гибели, даже единичных особей или их деформации 

свидетельствует о токсичности или другой вредности исследуемого материала. Определенную 

вредность продукта характеризует замедление роста и размножения инфузорий. Для этого на 4-е 

сутки производят количественный учет выросших особей в счетной камере Фукс-Розенталя или 

^ Горяева, но чаще всего ограничиваются примерным учетом погибших особей путем просмотра 

капли среды в трехкратной повторности, наличием каких-либо отклонений в подвижности и 

внешним виде инфузорий. В совокупности эти наблюдения позволяют сделать вывод о степени 

токсичности исследуемого корма (продукта) и охарактеризовать ее в баллах:


                                                                              Таблица 2

Балл

Оценка токсичности

корма, продукта

Результаты наблюдений

рост

гибель клеток

другие 

изменения

1

Нетоксичный

Густой

Нет

Нет

2

Слаботоксичный

Несколько угнетен

Нет

Возможны

3

Умеренно токсичный

Сильно угнетен

Нет

Возможны

4

Токсичный

Очень сильно угнетен

Часть погибла

Возможны

5

Сильно токсичный

-

Полная гибель клеток

-

Целесообразно делать и подсчет выросших особей. Для этого во все флаконы вносят по 3 мл 

фиксирующего раствора, например, формалина, приготовленного по следующей прописи: 20 мл 

^ 33% формалина, 175 мг КН2Р04, 170 мг К2НР04 и 440 мл дистиллированной воды.


Количество инфузорий в каждом флаконе, соответствующем разведению (титру) корма, 

выражают в процентном отношении к контролю (засеянному на стандартную среду, разведенную 

водой в 10 раз) и выдержанному в то же самое время, что и опыт. На основании полученных цифр 

проводят соответствующие расчеты угнетения роста и гибели по правилам общей токсикологии. 

При необходимости используют и полулогарифмическую сетку пробит-анализа.


^ Кроме того, пробы, не показавшие гибели или других патологических изменений 

Тэтрахимены в течение 1-4 суток, оставляют на дальнейшую инкубацию до 7 суток для выявления 

возможной кумуляции, т.е. накопления токсического эффекта, характеризующегося замедлением 

развития, частичной гибелью и другими изменениями жизнедеятельности данного тест-объекта. Их 

наличие также выражают в баллах или в процентах от количества особей в опыте и по отношению к 

контролю.


^ Культурная стандартная среда для тетрахимены пириформис: 2 г пептона 

бактериологического; 0,5 г глюкозы; 0,1 г дрожжевого экстракта; 0,1 г морской соли аптечной (или 

^ 0,1 г NaCI) на 100 мл дистиллированной воды. Среду подвергают автоклавированию при 0,5 атм. 30 

мин. или в кипящей водяной бане 1 час. Хранят в темном месте, т.к. на свету питательные 

компоненты разлагаются. Слой среды не должен превышать 1,5-2 см. Культуру поддерживают 

путем пересева каждые 7-10 суток на новую среду.


^ 3.4. Экспресс-метод определения общей токсичности фуражного зерна,

продуктов его переработки и комбикормов с использованием инфузорий

стилонихий.


Биологический экспресс-метод определения токсичности введен с 1 января 1993 г. в ГОСТ 

^ 13496.7-92 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения 

токсичности" и ГОСТ 29136-91 "Мука кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных и 

беспозвоночных. Методы определения токсичности".


Экспресс-метод основан на качественном и количественном определении реакции  инфузорий 

стилонихий на действие различных фракций токсических веществ (бактериальной, грибковой и 

химической природы), извлекаемых ацетоном из исследуемого продукта,   совместно с действием 

мелкодисперсной взвеси продукта, находящейся в его водно-ацетоновом растворе. Токсический 

эффект оценивается через 1 час, при этом одновременно проводятся качественный и 

количественный анализ. В первую очередь осуществляется качественный анализ. Визуально, с 

помощью микроскопа МБС-10 (увеличение 2х8), оценивается подвижность инфузорий во всех 

тестируемых пробах (комбикорма или их компоненты). При отсутствии токсичности инфузории 

подвижны. В токсичных пробах инфузории неподвижны. Далее проводят количественный анализ в 

пробах с неподвижными инфузориями. В этом случае токсический эффект оценивается по проценту 

гибели инфузорий,   который пропорционален степени токсичности продукта. Погибшие организмы 

полностью распадаются (лизируются), что облегчает количественный подсчет выживших 

организмов.


^ 3.4.1. Определение общей токсичности на инфузориях стилонихиях визуальным методом.

3.4.1.1. Необходимое оборудование и материал

Для осуществления метода экспрессного биотестирования требуется следующее оборудование:


^ 1.Микроскоп бинокулярный стереоскопический.          

2.Весы лабораторные 4 класса.

3.Мельница электрическая лабораторная.

4.Шкаф сушильный.

5.Планшетка с 50 лунками 1шт.

^ 6.Колбы конические для экстракции емкостью 100мл - 15шт. 7-Химические стаканы емкостью 

100мл - 15шт.

8.Шприц многоразовый с дел. на 0.5мл-1шт.

9.Пипетки мерные Мора на 25мл, 20мл и 15мл - по 1шт.

^ 10.Цилиндр мерный на 100 мл - 1 шт.

11.Часы песочные на 2 мин.- 1шт.

12.Пипетки для пересадки инфузорий - 50шт.

13.Чашки Петри - 30шт.

14.Дрожжи пекарские прессованные (ГОСТ 171-81) - 50г.

15.Бумага фильтровальная.

^ 16.Карандаш по стеклу.

17. Ацетон марки ЧДА, ОСЧ - 1,5л на 100 анализов

18.Спирт этиловый 1,75л на 100 анализов + 100мл на каждые 100 пересевов культуры.

19.Сито с ячеёй 0,5мм.


^ 3.4.1.2. Подготовка пробы к биотестированию

Пробу кормовой муки, сырья и комбикормов в количестве немногим более 10г (1 столовая 

ложка) измельчают на лабораторной электрической мельнице в течение 1-2х минут и просеивают 

через сито с ячеёй 0,5 мм. Навеску пробы (10г) помещают в стеклянную посуду для экстракции 

емкостью 100 мл с притертой пробкой (можно использовать баночки из-под детского питания на 

100 г с крышкой), заливают 15мл ацетона и экстрагируют при энергичном встряхивании в течении 

^ 2-х минут. Экстракту дают отстояться в течение 10 минут, после чего прозрачный надосадочный 

экстракт в количестве 0,5мл осторожно отбирают шприцем и переносят в химический стакан со 

средой для культивирования инфузорий, объем которой указан в таблице 3.


Приготовленные водные растворы ацетоновых экстрактов мясокостной и рыбной муки, 

дрожжей гидролизных, БВК, и жиросодержащих продуктов (кукуруза, шроты) перед проведением 

биотестирования необходимо профильтровать через слой фильтровальной бумаги.


                                                                 Таблица 3. 

      ^ Приготовление водного раствора ацетонового экстракта кормовой муки, 

                             сырья и комбикормов

№№

^ Вид продукта

Навеска 

пробы

г

Кол-во

ацетона

мл

Кол-во ацет.

экстракта

мл

Кол-во

воды

мл

1

Комбикорма для садкового

рыбоводства, карповые

10

15

0,5

50

2

Комбикорма для свиноводства

и птицеводства

.

15

.

40

3

Зернофураж и продукты

его переработки

.

15

.

40

4

Шроты

.

15

.

40

5

Мука травяная

.

20

.

40

6

Мука рыбная, крилевая,

мясокостная

.

15

.

80

7

Мука кровяная 

(альбумин)

.

15

.

50

8

Молоко сухое

.

15

.

80

9

Дрожжи гидролизные

.

15

.

45

10

Белотин

.

20

.

50

11

Контроль

.

0,5

.

50

^ 3.4.1.3. Подготовка тест-организмов для биотестирования.

В качестве тест-объекта используется инфузория стилонихия Infusoria stilonichia mytilus 

(Ehrenberg), относящаяся по систематике Догеля к классу Infusoria, подклассу Ciliata, отряду 

Spirotriha, подотряду Hipotricha.


^ Для биотестирования используется клонально-смешанная культура, которая постоянно 

поддерживается в   отделе МКЦП "Марикультура" Всероссийского научно-исследовательского 

института рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО).


Для биотестирования используют суточную культуру инфузорий. Для этого инфузорий за 

сутки до постановки опыта из нескольких резервных чашек Петри пересаживают в большом 

количестве (200-500 экз.) в чашку Петри с новой средой и культивируют при температуре 

24-26 °С с добавлением корма (на 25 мл среды 1 кусочек сухих пекарских дрожжей размером 

с маковое зернышко, т.е. весом около 0,003 г), при этом инфузории концентрируются 

вокруг корма.


^ 3.4.1.4. Проведение биотестирования

Испытания начинают с отбора пипеткой тест-организмов, сконцентрированных вокруг корма 

в чашке Петри, и внесения их в каждую лунку планшетки по одной капле, при этом в лунку 

попадает около 20 шт. инфузорий. Биотестирование проводят в лунках с рабочим объемом 0,4 мл, 

высверленных и отполированных в пластине из оргстекла (10 рядов по 5 шт. в каждом). Для 

тестирования одной пробы используют 5 повторностей (5 лунок). При пересадке инфузорий 

пользуются одной пипеткой (культуральной), а при внесении в лунки подготовленной для 

тестирования пробы пользуются другой пипеткой (для опыта). Регистрация тест-организмов 

осуществляется визуально с помощью микроскопа бинокулярного в лунках, которые полностью 

попадают в поле зрения микроскопа при увеличении 2х8.


Через 1 час после внесения пробы в случае токсичности комбикорма (сырья), происходит 

гибель инфузорий, величина которой зависит от степени токсичности комбикорма. Погибшие 

организмы полностью лизируются, в результате чего облегчается проведение количественного 

подсчета выживших инфузорий.


Порядок проведения испытания следующий:

- инфузорий под бинокуляром в массе отбирают культуральной пипеткой из чашки Петри, 

где они сконцентрированы вокруг корма, и по одной капле помещают в каждую из пяти лунок 

планшетки, при этом в каждую каплю попадает примерно от 10 до 20 шт. инфузорий (это 

количество используют в опыте);

- просматривают под бинокуляром количество инфузорий в каждой лунке планшетки и, если 

их слишком много в одной и недостает в других, то инфузорий более-менее равномерно 

распределяют в лунки планшеток той же пипеткой;

- после распределения инфузорий для их обездвиживания в каждую лунку планшетки вносят 

другой пипеткой по 2 капли приготовленной для биотестирования пробы, удаляя жир с пипетки 

сухой ватой;

- через 5 минут подсчитывают инфузорий в каждой лунке планшетки и заносят их количество в 

журнал;

- после подсчета инфузорий в лунки планшетки (до 1/2 их объема) вносят этой же пипеткой 

приготовленную для биотестирования пробу, также вытирая пипетку от жира ватой, и регистрируют 

время в журнале;

- через 1 час экспозиции вторично подсчитывают количество инфузорий;

- рассчитывают численность инфузорий через 1час экспозиции в % от числа посаженных по 

формуле:


    N2 х 100%    ,  где 

N=---------------

       N1

N1 - общая численность посадки инфузорий 

N2 - общая численность инфузорий через 1 час экспозиции.


^ 3.4.1.5. Анализ результатов

Степень токсичности исследуемого корма оценивается через 1 час по количеству выживших 

инфузорий в % от численности их посадки в соответствии со шкалой, указанной в таблице 4. В 

качестве контроля используют однопроцентный водный раствор ацетона, в котором инфузории в 

течение 1 часа должны остаться живыми. Контроль ставится с целью определения качества ацетона 

и среды.


                                                                    Таблица 4 

                ^ Оценка степени токсичности исследуемого корма

_________________________________________________________________________

Степень токсичности         Выживаемость инфузорий в % от посадки через 1 

                                           час опыта ( N )

_________________________________________________________________________

^ Нетоксичный                                       100-81

Слаботоксичный                                     80-50

Токсичный                                          49-0

_________________________________________________________________________


^ 3.4.1.6. Культивирование инфузорий стилонихий

Культивируют стилонихий в закрытых чашках Петри на среде Лозина-Лозинского (см. ниже); 

в качестве корма используют сухие пекарские дрожжи, которые добавляют в среду во время 

пересева культуры. При проведении большого числа анализов (более 10 ежедневно), а также в 

зимний период (особенно в феврале -марте) необходимо одновременно культивировать не менее 8 

чашек с инфузориями, поддерживая оптимальную температуру 24-26° С. Помещение для работы с 

инфузориями должно быть изолировано от химической лаборатории,  воздух не должен содержать 

никаких вредных паров и химических примесей.


^ Недопустимо попадание прямых солнечных лучей на чашки Петри с культурой инфузорий.

Подготовка корма. Корм для инфузорий - сухие пекарские дрожжи, которые готовят 

следующим образом. Свежие прессованные дрожжи (брикет 100 г) измельчают и высушивают в 

течение 1 недели, закрывая от пыли бумагой, при комнатной температуре, после чего хранят в 

баночке с притертой крышкой. Срок хранения сухих дрожжей -12 месяцев.


Среда культивирования. Для культивирования инфузорий используют среду Лозина-

^ Лозинского, которую готовят на дистиллированной воде с добавлением следующих солей (г/л): 

NaCL -0,1; KCL - 0,01; NaHCO3 - 0,02; MgSO4 -0,01; CaCI2 -0,01.


Пересев культуры. Пересев культуры производят каждый раз за сутки до постановки опыта. 

^ Если экспериментальная работа не проводится, то культуру инфузорий пересаживают не менее 2-х 

раз в неделю в зависимости от температуры.


Перед добавлением корма пальцы рук и пинцет необходимо протереть спиртом.

^ Пересев культуры инфузорий из нескольких резервных чашек (обычно 4) в новую чашку Петри 

осуществляют пипеткой, при этом кончик пипетки должен быть полностью погружен в среду. После 

пересева чашку Петри ставят на место, где проводят культивирование и только после этого 

добавляют корм (на 25мл среды - 1 кусочек