Реферат: Состав и структура белков

СОСТАВ И СТРУКТУРА БЕЛКОВ

Среди органических соединений, входящих в состав живой материи, важную роль играют белки.

Белки входят в состав всех клеток и тканей живых орга­низмов. Около 50% сухого веса клетки приходится на белки. Однако, не количественное содержание белка, а многообразие функций, которые выполняют белки, говорит о важности этого класса органических соединений в живом мире. Белки выполняют структурную, ферментативную, сократительную, защитную, гормональную, транспортную, питательную функции.

Это многообразие функций обеспечивается многообразием аминокислотных радикалов, входящих в состав белка, и, как следствие, способностью белковых молекул вступать в разнообразные физико-химические взаимодействия как между собой, так и с другими соединениями. Кроме того, гигантские молекулы белков отличаются неисчерпаемым разнообразием структуры при строгой ее специфичности у данного, конкретного белка.

Белки характеризуются определенным элементарным составом. Химический анализ показал наличие во всех белках углерода (50-55%), кислорода (21-24%), азота (15-18%), водорода (6-7%), серы (0,3-2,5%). В составе отдельных белков обнаружены также фосфор, йод, железо, медь и некоторые другие макро- и микроэлемен­ты, в различных, часто очень малых количествах.

По химическому составу белки представляют собой полимеры, построенные из остатков -аминокислот.

При изучении структуры белков было установлено, что все они построены по единому принципу и имеют четыре уровня организации: первичную, вторичную, третичную, а некоторые белки и четвертичную структуры.

^ Первичной структурой называют последовательность в расположении аминокислотных остатков в белковой молекуле. Остатки аминокислот в белках соеди­нены между собой пептидной связью, которая образуется между их амино- и карбоксильными группами.



По своей природе пептидная связь - это амидная связь, однако, «одинарная» CN-связь в пептидах примерно на 40% имеет характер двойной связи, а «двойная» СО-связь приблизительно на 40% является одинарной, поэтому пептидная связь является «полуторной». Это обстоятельство влечет за собой два важных следствия: 1) иминогруппа -NH-пептидной связи не обладает заметно выраженной способностью отщеплять или присоединять протон в интервале рН от 0 до 14; 2) свободное вращение вокруг CN-связи в пептидах отсутствует (т.е. связь планарна), и это ее свойство имеет важное значение для процесса формирования трехмерной структуры полипептидных цепей.

Зная первичную структуру белка, можно написать его химическую формулу. Именно первичная структура предопределяет образование вторичной, третичной и четвертичной структур, т.е. конформацию белковой молекулы.

Под вторичной структурой понимают пространственное расположение отдельных участков полипептидной цепи без учета типа и конформации боковых радикалов аминокислот. Она поддерживается водородными связями между карбонильной группой одной пептидной связи и группой –NH- другой пептидной связи соседних витков или участков полипептидных цепей. Различают несколько типов структуры белков: -спираль, -форму (структуру складчатого слоя) или неупорядоченную структуру.

-спираль возникает за счет внутрицепочечного образования водородных связей в разных участках одной и той же полипептидной цепи. Спираль является правозакрученной, поскольку все природные аминокислоты имеют L-конфигурацию. -спираль характерна для ферментов и всех глобулярных белков, однако, как правило, только часть полипептидной цепи спирализована (например, цепь миоглобина спирализована лишь на 75%).

-форма характерна для межцепочечного связывания. В -форме полипептидные цепи почти полностью вытянуты и расположены в виде слоев, изгибы которых похожи на складки ткани или бумаги. При этом водородные связи возникают между соседними участками одной или нескольких полипептидных цепей. Структура -складчатого слоя встречается в белках типа фиброина шелка или кератина волос.

^ Неупорядоченная структура характерна только для отдельных фрагментов цепи, которые чаще всего появляются между спирализованными и складчатыми участками белковой молекулы.

Под третичной структурой понимают характерное пространственное расположение полипептидной цепи в целом, которое возникает за счет типа и конформации боковых радикалов. Силами, стабилизирующими третичную структуру, являются: гидрофобное взаимодействие, которое возникает между неполярными радикалами аминокислот; водородные связи - между радикалами полярных аминокислот; дисульфидные мостики - между остатками цистеина; ионные взаимодействия - между радикалами основных и кислых аминокислот.

^ Четвертичная структура характерна для белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей. Такие молекулы называют мультимерами, а составляющие их элементы – полипептидные цепи – протомерами или субъединицами. Под четвертичной структурой подразумевают способ расположения в пространстве взаимодействующих между собой полипептидных цепей мультимерного белка. Поддерживают эту структуру те же взаимодействия, что и при образовании третичной структуры, только возникают они в четвертичной структуре между субъединицами белковой молекулы.

^ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Размер белковых молекул лежит в пределах 1 мкм до 1 нм и, следовательно, они яв­ляются коллоидными частицами, которые в воде образуют коллоидные растворы. Эти растворы характеризуются высокой вязкостью, низким значением осмотического давления, способностью рассеивать лучи видимого света, не проходят сквозь полупроницаемые мембраны, образуют гели и способны к набуханию. Рассмотрим свойства белков более подробно.

^ Молекулярная масса белков.

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и тысячи аминокислот, поэтому они имеют большие значения молекулярной массы (от 6 000 до 1 000 000 и выше). Для определения молекулярной массы используют различные физико-химические методы: седиментационный, осмометрический, гель-фильтрационный, вискозометрический, ультрафильтрационный, электрофоретический, оптический.

^ Оптические свойства.

Белки являются оптически активными веществами, так как состоят из оптически активных аминокислот. Они способны вращать плоскость поляризации света, рассеивать световые лучи видимой части спектра и поглощать ультрафиолетовые лучи. Эти свойства используют при коли­чественном определении белков, определении их конформации, молекулярной массы.

Белки способны адсорбировать на своей поверхности низкомолекулярные органические соединения и ионы (витамины, ионы железа, меди и др.), а иногда и захватывать их внутрь молекулы. С этим свойством белков связана их транспортная функция в организме.

^ Амфотерность белков.

Белки, также как и аминокислоты, являются амфотерными электролитами благодаря одновременному присутствию -СООН и –NH2 групп. Диссоциация этих групп приводит к заряжению белковой молекулы. В зависимости от преобладания в молекуле белка моноаминодикарбоновых (глутаминовой, аспарагиновой) или диаминомонокарбоновых аминокислот (лизина, аргинина) белки в водных растворах обладают свойствами слабых кислот или слабых оснований, соответственно. Большинство природных белков имеют кислый характер (казеин, желатина, альбумины и др.) и в водном растворе несут отрицательный заряд, основные белки (гистоны, протамины) в водном растворе заряжены положительно. Свойство амфотерности лежит в основе буферных свойств белков и их участии в регуляции рН крови.

^ Подвижность в электрическом поле.

В связи с тем, что белки являются заряженными частицами, они двигаются в электрическом поле к катоду или аноду в зависимости от величины их суммарного заряда. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от величины рН среды. Изменяя значение рН среды, можно добиться такого состояния, когда количество положительно и отрицательно заряженных групп будет одинаково, заряд белка при этом равен нулю, и молекула белка не будет перемещаться в электрическом поле. Такое значение рН среды определяется как изоэлектрическая точка (рНИЭТ). Значение изоэлектрической точки зависит от аминокислотного состава и специфично для каждого белка, например, для казеина рНИЭТ= 4,7, для яичного альбумина – 4,8, яичного глобулина – 6,6, желатина – 4,9, зеина (кукурузного белка) – 6,2. Чем дальше будет отстоять значение рН среды от рНИЭТ, тем большим суммарным зарядом будут обладать молекулы белка и с большей скоростью двигаться в электрическом поле.

Это свойство положено в основу электрофоретического метода, используемого для идентификации и фракционирования белков, а также при исследовании физико-химических свойств белков.

^ Растворимость белков.

Белки сильно различаются по своей растворимости в водных системах. При растворении белков в воде вокруг их молекул образуется гидратная оболочка, которая наряду с зарядом белковых частиц является фактором устойчивости белковых растворов.

На растворимость белков существенное влияние оказывают следующие факторы: а) рН, б) ионная сила, в) диэлектрические свойства растворителя и г) температура.

а) Влияние рН раствора на растворимость белков.

При значении рН раствора, совпадающем с величиной рНИЭТ, белки будут обладают наименьшей растворимостью. Объясняется это тем, что в изоэлектрической точке суммарный заряд молекулы белка равен нулю, и, следовательно, между соседними молекулами белка отсутствует электростатическое отталкивание. При значениях рН, отличных от значений рНИЭТ, молекулы белка имеют суммарный заряд одного знака, вследствие чего они отталкиваются друг от друга. На этом свойстве основан метод изоэлектрического осаждения белков.

б) Влияние ионной силы на растворимость белков.

При добавлении к растворам белка солей небольших концентраций растворимость многих бел­ков повышается. Этот эффект зависит также от величины зарядов каждого из ионов, присутствующих в растворе: соли, содержащие двухзарядные ионы значительно эффективнее повы­шают растворимость белков, чем соли, содержащие однозарядные ионы.

При значительном повышении кон­центрации солей раство­римость белков начинает опять пони­жаться, и при очень высоких концентра­циях соли белок может полностью выпасть в осадок (если рН среды совпадает с рНИЭТ). Это явление называет­ся высаливанием.

Оба описанных эффекта, т.е. повы­шение растворимости белков при низких концентрациях соли и понижение при высоких концентрациях, широко исполь­зуются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.

в) Влияние растворителя на растворимость белков.

Добавление смешивающихся с во­дой нейтральных органических раство­рителей уменьшает растворимость большинства белков в воде до такой степени, что они могут выпадать в осадок (если при этом рН раствора совпадает с рНИЭТ). Например, этанол или ацетон, являясь водоотнимающими веществами, понижают степень гидра­тации белков и уменьшают их растворимость. Кроме того, растворимость белков зависит от диэлектрической постоянной среды (при постоянных значениях рН и ионной силы). С уменьшением диэлектрической постоянной растворителя силы притяжения между двумя молекулами белка возрастают, что способствует агре­гации белков, т.е. снижает их растворимость. Эти закономерности используют для разделения белковых молекул.

г) Влияние температуры на растворимость белков.

В сравнительно узком интервале температур, приблизительно от 0 до 40°С, растворимость большинства белков возрастает с повышением температуры. При температурах, превышающих 40—50°С, большинство белков утрачивает стабильность, начинается их денатурация, сопровождающаяся обычно резким снижением растворимости.

^ Денатурация белков.

В настоящее время установлено, что для каждого белка характерна только одна пространственная структура, в которой он стабилен и проявляет биологическую активность. Эта структура носит название нативной конформации белка. Изменение нативной конформации белка, сопровождающееся потерей характерных для него свойств: растворимости, биологической активности, электрофоретической подвижности и др., называется денатурацией. Денатурация, как правило, затрагивает четвертичную, третичную и частично вторичную структуры бел­ковой молекулы и не сопровождается какими-либо изменениями пер­вичной структуры. Денатурацию могут вызывать различные физические и химические факторы: высокая температура, механические воздействия, действие ионизирующих излучений, обработка ультразвуком, действие органическими растворителями, растворами кислот, щелочей, солей тяжелых металлов.

Примером тепловой денатурации может служить «свертывание» белка при варке яиц. Денатурация белков происходит в желудке, где имеется сильнокислая среда и это способствует расщеплению белков протеолитическими ферментами. По мере старения организма происходит постепенная, хотя и чрезвычайно медленная, денатурация белков и снижение их гидрофильности.

При опре­деленных условиях денатурированный белок можно частично или пол­ностью вернуть к исходному нативному состоянию. Такой процесс называют ренатурацией, а белок – ренатурированным. Этот процесс происходит самопроизвольно при значениях рН и температуры, обеспечивающих стабильность нативной формы, и не требует подвода энергии извне. Ренатурацию обычно проводят в мягких условиях, медленно снимая воздействие.

^ Цветные реакции на белки.

а) Качественная реакция на белок – биуретовая реакция, которая обусловлена наличием пептидных связей в белковых молекулах. В щелочной среде белки образуют с ионами меди растворимое комплексное соединение сине-фиолетового цвета.

б) Реакции, которые обусловлены аминокислотным составом белков:

- универсальная (нингидриновая), которую дают все аминокислоты и, следовательно, белок любого состава;

- специфические, связанные с наличием определенных аминокислотных радикалов в белке (ксантопротеиновая, реакции Миллона, Адамкевича, Сакагучи, Паули, Фоля).

Цветные реакции используются для качественного и количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических анализах.

^ КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

Несмотря на то, что белки являются наиболее изученным классом биоорганических соединений, до сих пор не создано единой номенклатуры и классификации белков.

В зависимости от положенного в основу признака различают несколько видов классификации белков:

I. ^ Классификация, основанная на биологической функции белков.

II.Классификация, основанная на конформации белков. В зависимости от формы частиц белки делят на фибриллярные (волокнистые) и глобулярные (корпускулярные).

Фибриллярные белки - это устойчивые, нерастворимые в воде и в разбавленных солевых рас­творах вещества. Располагаясь параллельно друг другу вдоль одной оси, полипептидные цепи образуют длинные волокна (фибриллы) или слои с конформацией -структуры. Примеры фибриллярных белков: коллаген сухожилий и костной ткани, кератин волос, роговых образований, кожи, ногтей и перьев, эластин упругой соединитель­ной ткани.

Глобу­лярные белки – это соединения, полипептидные цепи которых плотно свернуты в компактные сферические или глобулярные структуры с конформацией -спирали. Большинство глобу­лярных белков растворимо в водных растворах и легко диффундирует. К ним относятся почти все известные в настоящее время ферменты, а также антитела, некоторые гормоны и многие белки, выполняющие транспортную функцию, например, сывороточный альбумин и гемо­глобин.

Некоторые белки принадлежат к промежуточному типу. Подобно фибриллярным белкам, они состоят из длинных, палочковидных структур, и в то же время они, как глобулярные белки, растворимы в водных солевых рас­творах. К таким белкам относятся: миозин - структурный элемент мышц, фибриноген - предшественник фибрина, участвующего в свертывании крови.

III. ^ Классификация, основанная на растворимости белков.

По отношению к растворимости белков в различных растворителях среди белков различают альбумины, глобулины, прола­мины, протеиноиды.

К альбуминам относят белки, хорошо растворяющиеся в воде и солевых растворах умеренных концентраций. При пере­ходе к концентрированным растворам, вплоть до полностью насыщенных, альбумины высаливаются. Примерами их могут служить: яичный альбумин, сывороточный альбумин, альбумин мышечной ткани, молочный альбумин.

К глобулинам принадлежат белки, не растворимые в воде и соле­вых растворах умеренных концентраций, но растворяющиеся в очень слабых растворах солей. Характерным признаком глобулинов считают их полное осаждение при полунасыщении раствора. Примеры глобулинов: фибриноген, яичный глобулин, сывороточный глобулин, глобулин мышечной ткани.

Проламины представляют группу белков, растворимых в 60-80%-ном водном растворе этилового спирта. Представителем этих белков может служить глиадин, составляющий главную часть клейковины; находятся они в зернах различных хлебных злаков.

К протеиноидам относят белки, не растворяющиеся в обычных растворителях белков: воде, солевых и водно-спиртовых смесях, однако, хорошо растворящиеся в специ­фических реагентах. Так, например, фиброин шелка растворяется в дихлоруксусной кислоте, безводной плавиковой кислоте, в концентрирован­ном водном растворе роданида лития или бромида калия. К протеиноидам относятся почти все фибриллярные белки.

IV. ^ В зависимости от состава белки разделяются на два основных класса: простые и сложные белки.

Простые белки или протеины состоят только из белковой части и гидролизуются до аминокислот. К ним относятся альбу­мины и глобулины, а также протамины и гистоны - белки основ­ного характера, которые содержат много лизина и аргинина.

^ Сложные белки или протеиды кроме белковой час­ти содержат небелковую группу, которую называют простетической.

Сложные белки в зависимости от химической природы их простетической группы классифицируются на нуклеопротеиды, гликопротеиды, липопротеиды, фосфопротеиды, хромопротеиды.

Небелковая часть нуклеопротеидов состоит из молекул нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК), белковая часть представлена гистонами и протаминами. Нуклеопротеиды участвуют в процессах деления клеток и передачи наследственных признаков, в процессах биосинтеза белка. Они входят в состав любой клетки, являются обязательными компонентами ядра, цитоплазмы. Также нуклеопротеидами по своей природе являются вирусы.

Гликопротеиды представляют собой сложные белки, простетическая группа кото­рых представлена производными углеводов. Гликопротеиды входят в состав клеточных мембран, участвуют в транспорте различ­ных веществ, в процессах свертывания крови, являются составными частями слизи и секретов желудочно-кишечного тракта.

Липопротеиды являются сложными белками, простетическая группа которых образована липидами. Это сферические частицы небольшого размера (150-200 нм), наружная оболочка которых образована белками, а внут­ренняя часть - липидами и их производными. Основная функция липоротеидов - осуществлять транс­порт по крови липидов.

Фосфопротеиды имеют в качестве небелкового компонента фосфорную кислоту. Эти белки входят в состав костной и нервной ткани, выполняют питательную функцию. Представителями данных белков являются казеин молока, вителлин (белок желтков яиц), ихтулин (белок икры рыб).

Хромопротеиды являются сложными белками, простетическая группа которых представлена окрашенными соединениями. К хромопротеидам относятся гемоглобин, миоглобин, ряд ферментов (каталаза, пероксидазы, цитохромы), а также хлоро­филл.

^ ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ «БЕЛКИ»

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1.

ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ.


Присутствие белка в биологических объектах и водных растворах можно определить методами качественного анализа. Методы качественного анализа белков основаны на двух типах реакций:

1) по пептидным связям белковой молекулы;

2) по аминокислотным радикалам.

Примером реакции первого типа является качественная реакция на пептидную связь – биуретовая реакция, второго – многочисленные цветные реакции на аминокислоты (нингидриновая, ксантопротеиновая, реакции Миллона, Адамкевича, Сакагучи, Паули, Фоля).

1. Биуретовая реакция.

Биуретовая реакция обусловлена наличием пептидных связей, однако, эту реакцию способны давать вещества, содержащие не менее двух пептидных связей. При добавлении к сильно щелочному раствору белка или продукту его неполного гидролиза ионов меди (II), образуются комплексные соединения, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.

Интенсивность окраски зависит от количества пептидных связей, поэтому биуретовая реакция используется для количественного определения белка в биологических объектах.

Биуретовую реакцию дают также некоторые аминокислоты (гистидин, треонин, серин, аспарагин).

Комплексной медно-натриевой соли пептидов приписывают следующее строение:




Реактивы: водный раствор яичного белка, 10%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди (II).

^ Приготовление раствора белка.

Белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 15-ти кратном объеме дистиллированной воды. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3-4 слоя. Хранят в холодильнике.

Выполнение работы. К 5 каплям 1%-ного раствора белка прибавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 1%-ного раствора сульфата меди и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовый цвет. В случае избытка сульфата меди образуется синий осадок гидроксида меди (II), который маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

2. Реакции по аминокислотным радикалам - нингидриновая и ксантопротеиновая реакции, а также реакции Миллона, Фоля, Сакагучи, Адамкевича, Паули рассмотрены в методической разработке «Белковые аминокислоты».


Контрольные вопросы.

С помощью какой качественной реакции можно обнаружить пептидную связь в белках?

Охарактеризуйте цветные реакции по аминокислотным радикалам.

В чем заключается практическое значение цветных реакций на белки?

На чем основано разнообразие функций, выполняемых белками в живых организмах?


^ ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2.

РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ.


Большинство белков относятся к высокомолекулярным соединениям, которые хорошо растворяются в воде. Растворение белков в воде связано с гидратацией его молекул и образованием вокруг частиц белка гидратной оболочки.

Любые физические и химические факторы, нарушающие гидратацию молекул белка и нейтрализующие их заряд, приводят к понижению растворимости белка и способствуют выпадению его в осадок.

1. Осаждение белков при нагревании.

Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой нарушается вторичная, третичная и четвертичная структуры белка. Свертывание большинства белков начинается при температуре 50-550С. При кратковременном нагревании денатурация может и не произойти или проявится в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры ведет к быстрому свертыванию белка.

На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и присутствие электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. В сильно кислых и в сильно щелочных растворах осаждение белков при кипячении практически не происходит, так как молекулы белка приобретают положительный или отрицательный заряды соответственно.

Реактивы: водный раствор яичного белка, 1 и 10%-ные растворы уксусной кислоты, 10%-ный раствор гидроксида натрия, насыщенный раствор хлорида натрия.

Выполнение работы. В пять пробирок наливают по 1 мл раствора белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения, при этом раствор мутнеет, но осадок не выпадает.

К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают, при этом выпадает хлопьевидный осадок белка.

К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения, при этом осадок не образуется.

В четвертую пробирку прибавляют 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 6 капель насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения - белок выпадает в осадок.

В пятую пробирку добавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения, при этом осадок не выпадает.

Объяснить наблюдаемые явления, если известно, что в состав яичного белка входят: яичный альбумин с рНИЭТ = 4,8 и яичный глобулин с рНИЭТ = 6,6.


2. Осаждение белков органическими растворителями.

Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) разрушают гидратную оболочку белка, что приводит к понижению его устойчивости и выпадению белка в осадок.

Осаждение белков этанолом обратимо при кратковременном воздействии реагента и без нагревания. Длительный контакт белка со спиртом приводит к необратимой денатурации.

Реактивы: раствор яичного белка, этиловый спирт, ацетон.

Выполнение работы. К 1 мл раствора белка прибавляют 2 мл этилового спирта и взбалтывают. Выпадает осадок белка, который вновь растворяется при разбавлении водой.

К 1 мл того же раствора белка прибавляют 2 мл ацетона и энергично встряхивают. Раствор белка мутнеет.

3. Осаждение белков минеральными кислотами.

Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом возможно образование комплексных соединений. Все это приводит к необратимой денатурации белка. Осадок белка, полученный под действием кислот, в избытке серной и соляной кислоты растворяется, но не растворяется в избытке азотной кислоты.

Реактивы: раствор яичного белка, концентрированные растворы соляной, серной и азотной кислот.

Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора кислот: в первую – соляной, во вторую - серной, в третью – азотной. Осторожно по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешивались, приливают равный объем раствора белка. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого кольца. Пробирки осторожно встряхивают, добавляют избыток кислот и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках.

4. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями свинца, ртути, серебра, меди и других тяжелых металлов. В этом случае денатурация белка вызывается адсорбцией ионов тяжелых металлов на поверхности белковых молекул с образованием нерастворимых комплексов.

Избыток некоторых солей (сульфата меди, ацетата свинца и других) ведет к растворению осадка (пептизации).

Реактивы: раствор яичного белка, 1%-ный раствор сульфата меди, 5%-ный раствор ацетата свинца, 1%-ный раствор нитрата серебра.

Выполнение работы. В три пробирки наливают по 1 мл раствора яичного белка и по каплям добавляют растворы солей: в первую – сульфата меди, во вторую – ацетата свинца, в третью – нитрата серебра до выпадения осадков. Затем прибавляют избыток солей и наблюдают растворение осадков в первых двух пробирках. Осадок, образованный нитратом серебра, не растворяется в избытке соли.

5. Осаждение белков нейтральными солями (высаливание).

Выпадение белков в осадок при действии на них растворов нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов называется высаливанием. Этот процесс основан на дегидратации белков и нейтрализации зарядов белковых частиц адсорбирующимися на них ионами соли. При этом белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются и выпадают в осадок.

Изменяя концентрации солей, можно выделить различные белковые фракции. Так, в случае высаливания хлоридом натрия, глобулины (pHИЭТ = 6.6) осаждаются насыщенным раствором соли, а для осаждения альбуминов (pHИЭТ = 4.8) необходимо добавить 1%-ный раствор уксусной кислоты для нейтрализации заряда белка.

Реактивы: раствор яичного белка с хлоридом натрия, кристаллический хлорид натрия (тонко растертый порошок в виде пудры), 1%-ный раствор уксусной кислоты, 1%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди.

^ Приготовление раствора белка (с добавлением хлористого натрия).

Белки трех куриных яиц отделяют от желтков, растворяют в 7 мл дистиллированной воды и приливают 3 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3-4 слоя. Хранят в холодильнике.

Выполнение работы. В пробирку наливают 3 мл раствора яичного белка и добавляют до получения насыщенного раствора порошок хлорида натрия. Через 5-6 минут в пробирке наблюдается выпадение осадка глобулинов. Альбумины из нейтральных растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются. Содержимое пробирки отфильтровывают через бумажный фильтр.

В фильтрате остаются альбумины, для их осаждения раствор подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты. Появившийся осадок отфильтровывают, а в фильтрате с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.

Контрольные вопросы.

Дайте понятие нативного белка.

Какие факторы влияют на растворимость белков?

Что происходит при обратимом и необратимом осаждении белков?

Какими реактивами вызывается необратимое осаждение белков?

Какие органические растворители вызывают осаждение белков из растворов и почему?

Как влияет изоэлектрическое состояние на осаждение белков при нагревании?

Какие факторы вызывают денатурацию белков и почему?

Почему при тепловой денатурации яичного белка в сильно кислой или сильно щелочной среде белок не выпадает в осадок даже при нагревании?

На чем основано разделение альбуминов и глобулинов?

На чем основан метод высаливания белков?

Предложите способ осаждения белков: пепсина (рНИЭТ=1,1), уреазы (рНИЭТ=4,9), каталазы (рНИЭТ=6,7).

На чем основаны методы извлечения белков?


^ ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3.

ОЧИСТКА БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ ОТ ПРИМЕСЕЙ

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ДИАЛИЗА.


Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран.

Диализ широко используется для очистки белков от примесей низкомолекулярных соединений (соли, сахара и др.), которые легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Белковые молекулы, обладая большим молекулярным весом, не способны проникать через искусственные или естественные мембраны (коллодий, пергамент, целлофан и другие).

Прибор, в котором проводят диализ, называется диализатором. Простейший диализатор представляет собой мешочек из полупроницаемого материала, в который заливается диализируемая жидкость. Мешочек опускается в сосуд с водой. Белок, помещенный в мешочек, остается в нем, а низкомолекулярные вещества в результате процесса диффузии проходят через мембрану во внешний раствор. Необходимый градиент концентрации поддерживают путем смены воды во внешнем сосуде.

Диализ можно ускорить более частой или непрерывной сменой воды, нагреванием (для растворов белков не выше 400С), увеличением поверхности, через которую идет диализ, уменьшением слоя диализируемой жидкости.

Реактивы и оборудование: раствор яичного белка, насыщенный сульфатом аммония, 1%-ный раствор хлорида бария, 10%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди, пробирки: обыкновенные и мерная, химический стакан, целлофановый мешочек, штативы.

^ Приготовление раствора белка: белок одного куриного яйца отделить от желтка, смешать с 300 мл дистиллированной воды и 100 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отфильтровать через марлю, сложенную в 3 слоя.

Выполнение работы. В простейший диализатор с помощью воронки вливают 10 мл раствора яичного белка. Целлофановый мешочек погружают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы уровень жидкости в мешочке совпадал с уровнем воды во внешнем сосуде. Через каждые 10-15 минут меняют и анализируют воду из внешнего сосуда: в одной пробирке проводят биуретовую реакцию и убеждаются в том, что белки через мембрану не проходят, в другой пробирке проводят реакцию на ион SO42-для установления проникновения соли через поры мембраны. Для этого к 1 мл анализируемого раствора добавляют 6-10 капель 1%-ного раствора хлорида бария. Если диализ проводился правильно, то должен выпадать белый мутноватый осадок BaSO4.

Через 2 часа проба на сульфат-ионы становится отрицательной или очень слабой. Это свидетельствует о завершении диализа, т.е. о почти полной диффузии соли через целлофановую мембрану. В мешочке к этому времени прозрачный фильтрат мутнеет, вследствие выпадения в осадок глобулинов, нерастворимых в дистиллированной воде.

Контрольные вопросы.

Что называется диализом?

От каких факторов зависит скорость диализа? Как ее можно увеличить?

На чем основано отделение высокомолекулярных веществ от низкомолекулярных методом диализа?

Для чего используется диализ? В чем его достоинства и недостатки?


^ ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ ЖЕЛАТИНА.


В изоэлектрической точке раство