Лекция: Передача и клонирование генов

На втором этапе генноинженерных работ выделенные и син­тезированные гены с помощью рестриктаз вводят в кольцевые специализированные ДНК-векторы (лат. vector — несущий, ве­зущий) и сшивают (лигируют) их ДНК-лигазой в единую рекДНК, способную проникать в соответствующие клетки и благодаря наличию в векторах специфических ДНК-репликаторов, промоторов и терминаторов размножаться и из­бирательно накапливать генные продукты, что называют клони­рованием молекул ДНК. Выбор вектора определяется также его безвредностью для реципиентной клетки, а системы вектор — хо­зяин в целом — взаимным сродством.

В зависимости от того, в каких клетках реплицируются век­торы, их делят на векторы прокариот, эукариот и челночные, содержащие репликаторы генетически неродственных организ­мов. В генной инженерии их получают от естественных репликонов: плазмид, бактериофагов, фагоплазмид и вирусов.

Чаще всего из этих векторов используются плазмиды бакте­рий, особенно те, которые дают не 4-6 копий, как плазмида pSClOl кишечной палочки, в которую американский ученый С. Коэн впервые ввел фрагмент ДНК из ооцитов шпорцевой ля­гушки, контролирующий синтез рибосомных РНК, и участок ДНК морского ежа, детерминирующий синтез белков-гистонов, а многократно реплицирующиеся и образующие в одной клетке несколько тысяч копий. Примером такой плазмиды может слу­жить ColEl, контролирующая синтез колицина. К ней удалось присоединить R-плазмиды, умеренные фаги и даже гены био­синтеза триптофана, резко увеличив продукцию детерминируе­мых ими белков-ферментов. Удобными векторами для бактерий и других прокариот являются умеренные фаги. Так, in vitro в структуру фага лямбда включают бактериальные гены, ДНК других фагов, ДНК мухи-дрозофилы. В клетки животных гены вносят при помощи векторов, сконструированных на основе полиома-, папилома-, герпес-, адено-, ретровирусов и особенно ви­руса SV-40 и поксвируса осповакцины, в геном которого встраивают около 10% чужеродного генетического материала от его общей массы.

Для растительных клеток вектором могут служить плазмиды Ti Agrobacterium tumofaciens, вызывающие опухоли на корнях растений. В тех случаях, когда подобрать вектор невозможно, прибегают к безвекторной передаче генов путем трансформации. Правда, передать гены таким образом удается только бактериям включая их в питательную среду.

Частота трансформации бактерий прежде всего определяетеся степенью родства нуклеотидного состава ДНК донора и реципи­ента, на основе которого формируется трансформант, но зависш также от рН, ионного и белкового состава питательной среды, температуры культивирования и наличия особого фактора ком­петентности, имеющего структуру полипептида.

Компетентность бактерий, дрожжей, растительных клеток можно увеличить с помощью ферментов, разрушающих полисахаридный каркас оболочек и превращающих их в сферо- и про­топласты. Эффективность трансформации у бактерий возрастает при использовании хлорида кальция и теплового удара, а у эукариот — полиэтиленгликоля, литиевых солей, высоковольтных импульсных электроразрядов, парагриппозного вируса Сендай, содержащего белок слияния.

И, наконец, некоторые возможности передачи генов откры­вает микрохирургия, позволяющая вводить чужеродную ДНК в ядра клеток.

В результате интенсивного развития генной инженерии всего лишь за последнюю четверть XX в. получены клоны многих ге­нов пептидных гормонов, инсулина, интерферона человека, овальбумина, коллагена, глобина, транспортных и рибосомальных РНК, гистонов и некоторых других. Особый интерес для биологии и профилактической медицины представляют вакцины будущего на основе безвредных рекомбинантных вирусов, в геномы которых введены гены широко распространенных инфекционных вирусов, кодирующих один или несколько специфиче­ских антигенов. Все это явилось предпосылкой для создания «банков генов» про- и эукариот на основе эталонных штаммов эшерихий и винных дрожжей.