Реферат: ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Ферментативный анализ представляет собой один из основных ана­литических инструментов в международной и отечественной практике научных исследований, современного производственного и сертифика­ционного контроля качества продуктов питания, пищевого сырья и био­логических материалов.

Ферментативный анализ является составной частью энзимологии и аналитической химии и служит для специфического определения веществ с помощью высокоочищенных препаратов ферментов.

В основе ферментативного анализа лежат природные биохимические процессы обмена веществ, которые воспроизводятся in vitro: реакция фермента с субстратом, причем в качестве субстрата выступает анализи­руемое вещество пробы.

Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях, при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, иденти­фикации и установления фальсификации продуктов питания и пищево­го сырья являются:

1. Высокая специфичность и достоверность ре­зультатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарности пространственной конфигурации активного цен­тра и субстрата является гарантом достоверности и надежности фермен­тативного метода при исследовании отдельных соединений в многоком­понентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты. При разработке ферментативных мето­дов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наи­большей специфичностью действия, для которых подбираются оптималь-

ные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов продуктов питания обычно используют несколько ферментов, которые последовательно фун­кционируют в данной системе.

2. Простые способы подготовки проб, которые ис­-
ключают потерю исследуемых компонентов. Основная
задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы, — по воз-­
можности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент
без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых
случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подго­-
товки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуе-­
мому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов).
Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хоро­-
шо известные способы подготовки проб, такие как: разбавление, фильт-­
рация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция,
обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных слу­-
чаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при
определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крах­-
мал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.

3. Простая и быстрая процедура измерений, кото-­
рая исключает использование дорогостоящего обо-­
рудования. В большинстве ферментативных определений исполь­-
зуют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все
компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, кофер-
менты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в
фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плот­
ности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. В
конце реакции (через определенный промежуток времени) повторно из­
меряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптичес-­
ких плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Лам­-
берта—Бера рассчитывают концентрацию С (г/л) искомого соединения.

В большинстве ферментативных методов прямому фотометрическо­му контролю доступно измерение таких вспомогательных компонентов

тестовой системы, как коферментов НАД+/НАДН или НАДФ+/НАДФН. Количество восстановленных или окисленных коферментов прямопро-порционально количеству искомого соединения. Система конечных зна­чений с фотометрическим измерением результата настолько надежна, что

служит в качестве стандарта для оценки других методик. Для проведения ферментативного анализа используется стандартное оборудование, кото­рое имеется практически в любой производственной лаборатории: спек­трофотометры или фотометры с интервалом измерений от 325 до 800 нм; кюветы для фотометрических измерений, мерные пипетки и дозаторы, весы, центрифуга, рН-метр, водяной термостат, фильтры и т. п.

4. Высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения сле­довых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов (г/л): этанол — 0,001; ацетоальдегид — 0,001; лимонная кислота — 0,002; глицерин — 0,001; D-глюкоза — 0,002; D-сорбит — 0,001; лактоза — 0,005; нитраты — 0,001.

Кроме вышеперечисленных достоинств ферментативных методов анализа можно назвать и универсальность применения, высокую надеж­ность и устойчивость к мешающим факторам, низкие затраты на прове­дение анализа (время, оборудование, расходуемые материалы), а также использование безопасных реактивов.

Области применения ферментативного анализа на практике много­образны. Это и производственный контроль, и контроль качества гото­вой продукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого про­дукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.

В табл. 8.5 приведены некоторые группы продуктов питания, а также их компоненты, для анализа которых разработаны специфические фер­ментативные методы.

По словам одного из основоположников ферментативного анализа Г. Бергмана: « Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недо­статков и ошибок, т. к. он представляет систему для измерений, которую успешно использует живая клетка уже в течение миллионов лет».

Контрольные вопросы

1. Каковы химическая природа и особенности ферментов как биологических
катализаторов?

2. Что изучает кинетика ферментативных реакций?

3. Как влияет концентрация субстрата и фермента на скорость ферментатив­-
ной реакции?

4. Как определяются основные кинетические параметры ферментативной ре­-
акции: Vo; Vmax; Ks; Km? Почему именно Vo (начальная скорость) является ме­-
рой количества фермента?

5. Что такое ферментные препараты и каково их отличие от ферментов?

6. Какие ферменты наиболее широко применяются в пищевой промышленно-­
сти?

7. По каким критериям оцениваются ферментные препараты с точки зрения их
использования в той или иной пищевой технологии?

8. В чем заключаются особенности подхода при характеристике ферментов пи­-
щевого сырья и исследовании поведения ферментов (ферментных препара-­
тов) в режиме определенной пищевой технологии?

9. Что такое иммобилизованные ферменты?

10. Каковы основные области применения ферментативного анализа на практи­ке? Перечислите основные преимущества ферментативных методов иссле­дования пищевых продуктов.