Реферат: Корекція екпериментального гіпотиреозу шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур

--PAGE_BREAK--Життєздатність культур визначали на останню добу культивування методом суправітального забарвлення трипановим синім клітинної суспензії, отриманої методом ферментативної дезагрегації. Кількість життєздатних клітин (ЖК, %) визначали шляхом підрахунку в гемоцитометрі (Адамс Р., 1983) і знаходили за формулою: ЖК = (∑незабарвл/∑заг) х 100, де ∑незабарвл – кількість живих (незабарвлених) клітин, ∑заг – загальна кількість клітин в полі зору.
Післяопераційний гіпотиреоз моделювали за допомогою ретроградної тиреоїдектомії (Легач Е.И., 2005) під комбінованим внутрішньочеревним наркозом (кетамін — 2,5 мг, ксилазин – 0,5 мг/100г маси тіла). З метою запобігання порушення кальцієвого обміну тваринам давали 0,2% розчин кальцію хлориду (Корлэтяну А.Н., 1987; Шкуматов Л.М., и др., 2001).
Трансплантаційний матеріал у дозі 30-35 мг вносили під капсулу нирки. У випадку комбінованої трансплантації з НЗ тваринам здійснювали лівосторонню адреналектомію.
Сакрифікацію тварин проводили на 30 добу після трансплантації під ефірним наркозом. Кров для аналізу брали за допомогою внутрішньосерцевої пункції.
Вміст загального рівня тироксину (Т4) в плазмі крові тварин-реципієнтів і середовищі культивування дослідних зразків ОКЩЗ визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів РИА – Т4 – СТ (Білорусь) (Прядко К.А. и др., 2000) и Т4 Immunotech (Чехія) згідно з інструкцією.
Показники концентрації Т4 в середовищі культивування ОКЩЗ нормували на білок, який вимірювали за методом Бредфорда (Bradford, 1976).Рівень ТТГ в плазмі крові щурів-реципієнтів визначали з використанням набору для РІА — ТТГ «Ирма» REF (Угорщина).
Тест толерантності до вуглеводів проводили шляхом внутрішньочеревного введення розчину глюкози (0,1 г глюкози на 100-150 г маси тіла тварини) за 40 хвилин до сакрифікації (Громакова І.А. и др., 2002). Рівень глюкози в крові вимірювали фотоколориметричним методом в модифікації Н.В. Клімкіної (Пушкина Н.Н., 1963) та експрес-методом за допомогою глюкометру “Глюкофот” та індикаторних пластин “Гемоглан” (Україна).
Рівень альбуміну в плазмі крові визначали фотоколориметричним методом за реакцією з бромкрезоловим зеленим стандартним тест-набором Альбумин “Филисит Диагностика” (Україна), рівень холестерину — набором Chol 150 “Lachema” (Чехія) згідно з інструкціями. Фотоколориметричні визначення проводили з використанням ФЕК (КФК-2-УХЛ42).
Підготовку матеріалу до гістологічних досліджень проводили в стандартних умовах. Нирку з трансплантатом або фрагменти культури фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, зневоджували етанолом і заливали у парафінові блоки. Зрізи товщиною 5-7 мкм виготовляли так, щоб гістологічна поверхня включала трансплантат і оточуючі тканини – паренхіму і капсулу нирки. Зразки забарвлювали гематоксиліном та еозином. Препарати досліджували під світлооптичним мікроскопом при збільшеннях об’єктиву х20, х40 і х60. Мікрофотографії отримували за допомогою мікроскопу Olimpus з цифровою камерою і пакетом прикладних програм для обробки зображення.
Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) — для непараметричних даних.
Результати досліджень та їх обговорення Морфофункціональні властивості органотипових культур щитоподібних залоз в умовах специфічної і неспецифічної стимуляції та комбінованого культивування. Одним із якісних параметрів оцінки функціонального стану культури є її здатністьвідповідати на стимуляцію змінами гормональної активності. Функціональним параметром життєздатної культури прийнято вважати її здатність виключати із клітин суправітальні барвники (розчин трипанового синього тощо). Дані, представлені в табл. 1 свідчать, що показник життєздатності клітин ОКЩЗ НП після комбінованого культивування з ОКНЗ був на 19,53% вищий за такий клітин монокультур ОКЩЗ НП.
Таблиця 1
Вплив комбінованого культивування двох видів ендокринних тканин на життєздатність клітин ОКЩЗ щурів і новонароджених поросят (М±m, n=7)
Експериментальні групи дослідних зразків
Життєздатність, %1
Ендокринні залози щурів
Ендокринні залози НП
ОКЩЗ (4 доба культивування)
43,28±1,27
52,68±0,72
Комбіновані культури ЩЗ із НЗ
62,81±0,61
68,25±0,021
Комбіновані культури ЩЗ із гіпофізом
56,92±0,084
64,36±0,016
Примітка.1 за 100%-в прийнято кількість життєздатних клітин інтактних ЩЗ.
Аналогічна тенденція зберігалась і в комбінованих з НЗ ОКЩЗ щурів. Зафіксовано відносне збільшення життєздатних клітин в ОКЩЗ після комбінованого культивування з експлантатами гіпофізу (табл.1).
Вивчення гормональної активності ОКЩЗ щурів після культивування в присутності специфічних і неспецифічних стимуляторів гормонопоезу показало, що на 4 добу інкубації рівень базальної секреції Т4 ОКЩЗ в середовище культивування складав 50,59±0,6 нмоль/г білка (n=8, р<0,05). Це значення було прийнято за контрольне по відношенню до всіх експериментальних зразків, отриманих із ЩЗ щурів.
Із представлених на рис. 1 (А) даних видно, що сумісна інкубація ОКЩЗ з експлантатами гіпофізу супроводжувалась вірогідним збільшенням рівня секреції тироксину в середовище інкубації.
Активація Т4-гормонопоезу спостерігалась і у випадку застосування дб-цАМФ. Крім того, виявлено, що біологічно активні речовини НЗ стимулювали секрецію Т4 при комбінованому культивуванні ОКЩЗ із ОКНЗ. Рівень тироксину в середовищі за таких умов культивування складав 124,02±12,4 нмоль/г білка (n=6, р<0,05) в порівнянні з контрольним значенням — 50,59±0,6 нмоль/г білка (n=8, р<0,05). Однак, при інкубації тканин ЩЗ і НЗ в присутності дб-цАМФ отримано ефект відміни дії стимулятора (рис.1 (А)).
При спробі відокремити дію глюкокортикоїдів від загального впливу ОКНЗ встановлено, що залежність концентрації тироксину в середовищі культивування від концентрації кортикостерону мала лінійний характер (рис. 1 (Б)). Додавання 0,25 мкг/мл кортикостерону стимулюючим ефектом не супроводжувалось, а при збільшенні його концентрації до 0,5-1,0 мкг/мл зростав і рівень Т4. Слід зазначити, що концентрація кортикостерону в плазмі периферійної крові щурів значно нижча, ніж в плазмі венозної надниркової крові (Резников А.Г., 1980), тому, для більш коректної інтерпретації даного ефекту, за фізіологічне значення слід приймати концентрацію 0,5 мкг/мл.
Отримані дані свідчать про здатність ОКЩЗ щурів реагувати на дію стимуляторів шляхом ТТГ-рецепторної і неспецифічної внутрішньоклітинної відповіді. Процеси, що відбуваються в ОКЩЗ на клітинному рівні під дією дб-цАМФ полягають у здатності цАМФ і його аналогів запускати аденілатциклазний каскад і, тим самим, індукувати синтез і секрецію тиреоїдних гормонів (Steinfelder H.J. et al., 1991; Steinfelder H.J. et al., 1992; Weintraub B.D. et al., 1989). Оскільки кортикостерон також стимулював секрецію Т4 (в залежності від концентрації), припустимо, що з усього спектру біологічно активних речовин НЗ саме глюкокортикоїди стимулювали секрецію тироксину ОКЩЗ щурів в умовах сумісного культивування з ОКНЗ.
При культивуванні ОКЩЗ новонароджених поросят виявлено, що на 4 добу інкубації базальний рівень секреції Т4 в середовище культивування складав 36,29±1,79 нмоль/г білка (n=8, р<0,05) (рис. 2), дане значення було прийняте за контрольне по відношенню до зразків, отриманих із ендокринних залоз новонароджених поросят.
Представлена концентрація Т4 у середовищі культивування після інкубації ОКЩЗ НП в присутності модифікаторів гормонопоезу, звідки бачимо, що 2-годинна інкубація з концентрацією ТРГ 200 мкг/мл не супроводжувалась істотним збільшенням рівня Т4 в середовищі культивування в порівнянні з 12-годинною інкубацією в присутності 4,4 нг/мл ТРГ. Рівень тироксину в останньому випадку вірогідно зростав більш ніж в два рази порівняно з контрольними параметрами і складав 104,55± 4,67 нмоль/г білка (n=7, р<0,05). Інкубація ОКЩЗ НП протягом 2 годин в присутності ТРГ (200 мкг/мл) і експлантатів гіпофізу також не стимулювала секрецію тироксину, а 12-годинна інкубація зазначених тканин з 4,4 нг/мл ТРГ сприяла деякому зниженню рівня Т4 в середовищі культивування в порівнянні з його базальними значеннями, що може бути пов’язано з впливом ТРГ на гіперпродукцію ТТГ і супресію секреції Т4. 24-годинна інкубація ОКЩЗ НП з експлантатами гіпофізу супроводжувалась вірогідним збільшенням рівня Т4 в середовищі культивування. Дані ефекти підтверджують припущення щодо підтримання сигнальних регуляторних взаємовідносин в системі гіпоталамус-гіпофіз-ЩЗ, змодельованій in vitro.
Комбіноване культивування ОКЩЗ НП з ОКНЗ НП вірогідно збільшувало рівень Т4 в середовищі культивування (рис. 2 (А)). Додавання в інкубаційне середовище дб-цАМФ також стимулювало Т4-гормонопоез, але при дії дб-цАМФ на комбіновані культури (ОКЩЗ НП із ОКНЗ НП) рівень секреції Т4 був нижчий в порівнянні з окремою дією стимулятора та вищий за контрольне значення. При інкубації ОКЩЗ НП із ОКНЗ НП і ТТГ (10 мкМО/мл) зафіксовано аналогічний ефект відміни стимулюючої дії модифікатора (рівень Т4 в середовищі інкубації не відрізнявся від контрольних значень).
Отримані результати дозволяють стверджувати, що комбіноване культивування в присутності стимуляторів не приводить до вірогідного збільшення рівня тироксину в середовищі культивування на відміну від вираженого стимулюючого впливу кожного модифікатора окремо.
Як видно з даних, представлених на рис. 2 (Б), кортикостерон вірогідно збільшував рівень секреції тироксину в середовище культивування ОКЩЗ НП по відношенню до контролю. При цьому фізіологічні концентрації зумовлювали максимальний стимуляторний ефект. Так, внесення 0,5 мкг/мл кортикостерону (фізіологічна норма плазми венозної надниркової крові щурів) сприяло вірогідному підвищенню рівня тироксину в середовищі культивування ОКЩЗ як щурів (рис. 1 (Б)), так і новонароджених поросят (рис. 2 (Б)), тоді як додавання в інкубаційне середовище 0,25 мкг/мл кортикостерону стимулювало секрецію Т4 тільки культурами ЩЗ новонароджених поросят.
Корекція експериментального гіпотиреозу і супутніх порушень метаболізму шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур щитоподібних і надниркових залоз. Комбінована трансплантація двох видів ендокринних тканин/клітин може бути як одним із способів імунопротекції основного графту (De Fazio S.R. et al., 1994), покращення його трофіки (Agrawal A.K. et al., 2004; Emerich D.F. et al., 2003), так і способом локального впливу на регуляторно-трофічні процеси в самому трансплантаті (Kukreja S.C. et al., 1979).
З метою оцінки ефекту комбінованої трансплантації тканин ЩЗ і НЗ на вміст тироксину і тиротропіну в плазмі крові гіпотироїдних щурів, а також на деякі показники метаболічних процесів і ступінь їх компенсації проводилась трансплантація монографтів і комбінованих ауто-, ало- и ксенографтів НФ і органотипових культур ЩЗ та культур ЩЗ і НЗ з попереднім сумісним культивуванням щурам з післяопераційним гіпотиреозом. Отримані показники порівнювали з відповідними в групах тиреоїдектомованих та інтактних тварин. На 30 добу після трансплантацій в плазмі крові експериментальних тварин вимірювали вміст Т4, ТТГ і деяких біохімічних показників – альбуміну, глюкози з вуглеводним навантаженням і холестерину та проводили гістологічні дослідження екстирпованих трансплантатів.
Вміст тироксину в плазмі крові контрольних тварин дорівнював 61,71±1,1 нмоль/л (n=7, р<0,05), у тиреоїдектомованих – 18,26±0,8 нмоль/л (n=7, р<0,05) (рис. 3), що свідчить про адекватність моделі післяопераційного гіпотиреозу.
Трансплантати НФ ЩЗ алогенного походження виявились більш ефективними в корекції гіпотиреоїдного стану (рис. 3 (А)), що зумовлювалось менш вираженими процесами відторгнення трансплантату завдяки видовій специфічності тканин донора і реципієнта.
Трансплантація нативних ксенографтів ЩЗ новонароджених поросят сумісно з фрагментами НЗ на 56,6% сприяла збільшенню рівня Т4 в порівнянні з тиреоїдектомованими тваринами (рис. 3 (Б)), а нативних фрагментів ЩЗ без НЗ – на 34,3% (рис. 3 (А)).
Після комбінованої алотрансплантації сумісно культивованих ОКЩЗ із ОКНЗ спостерігалося зростання рівня Т4 на 35,0% в порівнянні з тиреоїдектомованими тваринами і на 14,6% в порівнянні з комбінованою трансплантацією окремо культивованих відповідних тканин (рис. 3 (Б)). Комбіноване культивування також зумовило підвищення рівня тироксину в плазмі крові тварин-реципієнтів після сумісної ксенотрансплантації ОКЩЗ із ОКНЗ в порівнянні з ксенотрансплантацією окремо культивованих відповідних тканин.
Рівень ТТГ в плазмі крові тварин-реципієнтів більшості експериментальних груп знаходився у зворотній залежності від рівня тироксину (рис. 3), що вказує на користь припущення про відновлення регуляторних взаємовідносин в системі гіпофіз-трансплантат щитоподібної залози.
Відомо, що механізм дії тиреоїдних гормонів обумовлює багатобічні прояви нетиреоїдної патології. За гіпотиреозу, як правило, спостерігається пригнічення синтезу альбумінів (Потемкин В.В., 1999). Нами встановлено, що рівень альбуміну в плазмі крові контрольних тварин був на 27,9 % вищий такого у тиреоїдектомованих щурів (рис. 4).
Значних коливань рівня білка зафіксовано не було, але спостерігалася тенденція до підвищення рівня альбуміну за умов комбінованої трансплантації з НЗ (рис. 4 (Б)) порівняно з тиреоїдектомованими щурами та групами тварин з трансплантацією монографтів ЩЗ (рис. 4 (А)).
Експериментальні дані свідчать, що тироксин має діабетогенну дію, яка обумовлює гіпоглікемічні стани та порушення толерантності до вуглеводів за умов дефіциту тироїдних гормонів (Hecht A., 1968; Shah J.H. et al., 1973; Shah J.H. et al., 1975). Нами встановлено, що базальний рівень глюкози у крові контрольних тварин із вуглеводним навантаженням та без навантаження не відрізнявся, що характеризує нормальну здатність тканин утилізувати глюкозу (рис. 5). У тиреоїдектомованих тварин після вуглеводного навантаження відзначалося підвищення рівня глюкози на 40,8% порівняно з контролем. Практично всі трансплантати виявились активними в нормалізації рівня глікемії після вуглеводного навантаження. В групах щурів із монотрансплантатами ЩЗ після екзогенного введення глюкози глікемічні показники закономірно нормалізувалася паралельно з компенсацією гіпотиреоїдного стану (рис. 5 (А)).
Недостатня здатність утилізувати глюкозу проявилася в групі тварин із комбінованою алотрансплантацією НФ ЩЗ і НЗ (рис. 5 (Б)).
Можливо, що гіпотиреоз-індуковане порушення вуглеводного обміну нівелює регуляторний вплив глюкокортикоїдів на гліконеогенез. Особливо слід зазначити групу щурів, яким проводилася комбінована алотрансплантація сумісно культивованих ОКЩЗ із ОКНЗ, де вміст глюкози дорівнював контрольним значенням порівняно з комбінованою трансплантацією окремо культивованих залоз (рис. 5 (Б)).
При визначенні рівня холестерину встановлено, що даний показник в плазмі крові тиреоїдектомованих тварин без трансплантацій був на 69,1% вищий від контролю і складав 8,8±0,29 ммоль/л (n=7, р<0,05) в порівнянні з 2,72±0,15 ммоль/л (n=7, р<0,05).
Трансплантація монографтів ЩЗ істотно не впливала на зниження рівня холестерину в плазмі крові експериментальних тварин, але простежувалась тенденція до поліпшення даного показника (рис. 6 (А)). В групах тварин, яким проводили комбіновану трансплантацію ЩЗ із НЗ, рівень холестерину дорівнював контролю (рис. 6 (Б)) та вірогідно відрізнявся від такого у тиреоїдектомованих щурів. Можливо, що механізм даного ефекту полягає, з одного боку, в нормалізації холестеринемії в результаті нормалізації тиреоїдного статусу, а з другого – в регуляторній дії гормонів НЗ на ліпідний обмін.
В цілому, трансплантація тканини ЩЗ окремо або в комбінації з тканиною НЗ призводила до підвищення рівня тироксину та сприяла нормалізації метаболічних показників за умов післяопераційного гіпотиреозу, а комбіноване культивуванні цих тканин на етапі передобробки матеріалу забезпечувало більшу гормональну активність трансплантату порівняно з окремо культивованими тканинами.
Комбінована трансплантація органотипових культур щитоподібних залоз із експлантатами гіпофізу. Актуальним залишається питання про вплив тканини аденогіпофізу на функціонування графту ЩЗ і можливість його роботи в межах гіпоталамо-гіпофізарно-тиреоїдної системи за умов трансплантації.
В даній серії експериментів тварин розподілено на три основні групи: 1) інтактні; 2) тиреоїдектомовані тварини без трансплантацій; 3) гіпотиреоїдні щури з ало- і ксенотрансплантацією окремих та комбінованих з експлантатами гіпофізу нативних фрагментів і органотипових культур щитоподібних залоз щурів та новонароджених поросят.
    продолжение
--PAGE_BREAK--