Реферат: Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Российский государственный медицинский университет

 Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

 

 

 

 

 

 

Реферат

 

«Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Самойликов Павел Владимирович

интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2009 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

 

 

 

Введение.3

Иммуноферментный анализ.3

Классификация ИФА.5

Характеристика компонентов, используемых в ИФА.6

Варианты постановки ИФА.11

Общий принцип.11 

Непрямой ИФА… 13 

«Сэндвич» –  вариант ИФА для выявления антигенов.14 

Конкурентный ИФА.16 

Ингибиторный ИФА.16 

Метод иммуноферментных пятен (ELISPOT).18 

Системы усиления сигнала.19

Практическое применение ИФА.21

Список используемой литературы.23

 

Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике.

 

Введение. 

 

Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты  иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами.

Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы.

В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (enzymelinkedimmunosorbentassay).

В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ – метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной.

Иммуноферментный анализ.<span style=«font-size: 14pt; font-family: „Times New Roman“; font-weight: normal;»> 

 

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

/>

 

Рисунок 1. Основной принцып ИФА.

1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител.

 

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана  простой схемой:

[AT]+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

            Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

 

Классификация ИФА.<span style=«font-size: 12pt; line-height: 150%; font-family: „Times New Roman“; font-style: normal;»> 

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

            А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

            Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

Характеристика компонентов, используемых в ИФА.<span style=«font-size: 12pt; font-family: „Times New Roman“; font-style: normal;»> 

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

–  возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

 

Таблица 1.

Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.

 

Фрмент

Источник получения

М.М.(кДа)

Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм)

Конъюгирующий реагент

Пероксидаза хрена

Хрен (Armoracia rusticana)

40

О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм)

5-аминосалициловая кислота      (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин.

Глутаральдегид

Мета-периодат натрия

N-сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат

β-D-галак-тозидаза

E. Coli

540

О-нитрофенил-β-D-галактозид (420 нм)

Мета-малеимидобензол-N-гидроксисукцинимидный эфир

Щелочная фосфотаза

E. Coli, слизистая кишечника теленка

84-150

Р-нитрофенилфосфат (405 нм), 5-Бром-4-хлоро-3-индолил фосфат

Глутаральдегид

 

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образу­ют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Антигены и антитела.

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувст­вительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности ис­пользуемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или монокли­нальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чув­ствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.

Образование конъюгата

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Обра­зование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введе­ния ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою био­логическую активность: фермент — способность взаимодействовать с субстра­том, а антиген или антитело — антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позво­ляет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойст­вам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антиге­на с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками про­изводится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляет­ся иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы при­готовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом дос­тупных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реа­гентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 — 60 % от свобод­ного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фер­мента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фер­мента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 мо­лекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую фер­ментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких обра­зовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 — 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

— высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, умень­шить неспецифическое связывание;

—  достаточной специфичностью в рабочем разведении;

— преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные фор­мы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

— оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

— достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство опреде­ляется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различ­ные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещест­ва. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планше­ты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорб­ция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсор­бируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика.

Полисахариды и сильногликозилированные белки часто имеют низкую аффинность для полистирола. Необходимы другие методы для их иммобилиза­ции, например, ковалентное присоединение с помощью глутарового альдегида. Ковалентное присоединение эффективно, если в качестве твердой фазы исполь­зуются гидрофильные бусы (агароза) и полистироловые бусы.

Иммунохимические методы основываются на использовании предвари­тельно адсорбированных «ловушечных» антител для иммобилизации антигена или антител. Антиген, иммобилизованный иммунохимически, в 10 раз активнее, чем пассивно адсорбированный антиген. Могут использоваться лектины или иммуноглобулин-связывающие белки бактерий, которые легко адсорбируются на пластике или других гидрофобных поверхностях, например конканавалин А (Кон А) или стаффилококковый белок А. Кон А способен иммобилизовать gp 120 — белок вируса ВИЧ.

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорби­руемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвраще­ния неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу ос­новного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты — бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Варианты постановки ИФА.<span style=«font-size: 12pt; font-family: „Times New Roman“; font-style: normal;»> <span style=«font-size: 12pt; line-height: 150%; font-family: „Times New Roman“; font-weight: normal;»>Общий принцип.<span style=«font-size: 12pt; line-height: 150%; font-family: „Times New Roman“; font-weight: normal;»> 

В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмывани­ем.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лун­ках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверх­ности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся ком­поненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и свя­зывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фер­мента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа – процедура отмыв­ки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наибо­лее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может произ­водиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора – вошера или вручную, многоканальной пипеткой. Для проведения ИФА необходимы:

– полистироловый планшет или другие использующиеся варианты твердой фазы;

– отмывающий раствор;

– конъюгат (меченные ферментной меткой антигены или антитела);

– смесь используемых субстратов;

– останавливающий раствор (Стоп-реагент – раствор для останавливания ре­акции);

– образцы, использующиеся для положительного и/или отрицательного кон­троля;

– стандартный антиген (для построения калибровочной кривой);

– одно- и многоканальные пипетки;

– вошер (промыватель);

– оптический прибор для определения оптической плотности исследуемого раствора (ИФА-ридер, считыватель, который последовательно фотометрирует все лунки);

– 5-100 мкл исследуемого биологическою материала.

Прямой ИФА

1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый ма­териал). Выше отмечалось, что антигены существенно различаются по способ­ности адсорбироваться на разных видах пластика в зависимости от того, к како­му классу веществ (белкам, углеводам или липопротеинам) они принадлежат. Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены.

Контроль. В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положи­тельным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим ис­следуемого антигена. При наличии очищенного стандартного антигена реакцию проводят в нескольких разведениях, так чтобы можно было построить калибро­вочную кривую.

2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью БСА казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе).

3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После  инкубации с коньюгатом лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата.

4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают.

5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для бо­лее точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на ИФА