Реферат: Высоких Технологий "ХимРар"

НЕГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

Центр Высоких Технологий "ХимРар"
Закрытое акционерное общество «Исследовательский Институт Химического Разнообразия» УДК
№ гос.регистрации
Инв. № УТВЕРЖДАЮ
Директор ЗАО «ИИХР»,

д.х.н. Д.В. Кравченко


«____» ___________ 2011 г.

ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ

«Проведение качественных и количественных анализов образцов йодированных белков «Биойод» производства ООО «Техновита» и «Йодказеин» производства ООО «Медбиофарм»»

(промежуточный)


Руководитель НИР:

Нач. лаборатории контроля

качества субстанций, к.т.н. С.Г.Алексеев

«____»____________2011


Москва 2011 г.

^ СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

Руководитель НИР, С.Г. Алексеев

Нач.лаб., к.т.н.

«___»___________2011 г.

Ответственный исполнитель,
Научн. сотр., М.С. Дуля

«___»___________2011 г.

Исполнители темы:
Научн.сотр., Е.С. Федорова

«___»___________2011 г.


Научн.сотр., Н.Ю. Корнюхина

«___»___________2011 г.


Научн.сотр., С.М. Смирнов

«___»___________2011 г.

РЕФЕРАТ

Среди разнообразия свойств, проявляемых соединениями йода важное место занимает его биологическая активность. Однако при использовании йода возникает ряд проблем связанных с аллергизирующим действием, токсичностью, плохой всасываемостью и малой растворимостью в воде ряда соединений. Одним из перспективных способов снижения указанных недостатков стало создание препаратов йода в связанном с орагической матрицей виде - модифицированных йодированных белков.

Исторически [Мохнач В.О.] широкое распространение получили, так называемые, йодофоры — препараты, содержащие высокомолекулярное соединение (ВМС) или поверхностно-активное вещество (ПАВ), и в качестве основного действующего компонента — молекулярный йод.

Высокомолекулярный носитель замедляет выделение молекулярного «неорганического» йода и йодида из препарата и увеличивает время его взаимодействия с тканями организма, одновременно уменьшая раздражающее действие [1]. В медицинской практике с успехом используются препараты пролонгированного действия - комплексы молекулярного йода с поливиниловым спиртом («Йодинол»), с поливинилпирролидоном и йодидом калия («Йодопирон»), с неионогенным ПАВ («Йодонат»).

Йодофоры, однако, не способны ввиду своего фармакологического действия и клатратно-комплексной природы образования связи йода с матрицей активно участвовать в гормонально тиреоидной регуляции йодного обмена.

Проблема создания, внедрения и промышленного выпуска йодсодержащих препаратов тесно связана с разработкой документов, нормирующих состав, структуру лекарственного соединения, качество носителей и вспомогательных веществ, а также условия и сроки хранения готовых лекарственных форм. Возникает необходимость в разработке чувствительных методов анализа органических полигалогенидов на различных этапах получения, в готовых лекарственных формах, БАДах и биообъектах. При выборе методов, используемых при анализе лекарственных препаратов, необходимо учитывать их целесообразность для целей обеспечения качества фармацевтических препаратов и последние достижения в разработке аналитических средств. При этом, однако, нужно принимать в расчет различные технические и экономические ограничения и выбор рекомендованных методик основывать на оптимальном решении, что позволяет использовать одинаковые методики в лабораториях с различным приборным оснащением.

Учитывая все вышеизложенное, представляется весьма актуальной задачей физико-химическое изучение полигалогенидов органических катионов, а также разработка методик их контроля и стандартизации.

Настоящее исследование посвящено сравнительному анализу и изучению состава, структуры, физико-химических и аналитических характеристик йодированных белков «Йодказеин» и «Биойод», а также разработке комплекса методик идентификации и количественного определения полигалогенидных соединений.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение 8 1. Обзор литературы 10 1.1 Механизм йодирования белков и структура соединений, образующихся при йодировании. Методы йодирования белков 11 1.2 Выбор белковой матрицы и йодирующего агента 18 1.2.1 Белки молока. Биологические функции белков 22 1.2.2 Аминокислотный состав. Структура белков 26 1.2.3 Сравнение белковой матрицы казеина и сывороточного молочного белка для йодирования 30 1.3 Синтез и секреция тиреоидных гормонов 34 2. Основная часть 40 Экспериментальная оценка основных показателей. Сравнительный анализ физико-химических свойств йодированных молочных белков «Йодказеин» и «Биойод» 40 2.1. Органолептические показатели. Цвет и запах 42 2.2. Физико-химические показатели и свойства: 43 2.2.1 Содержание воды. Массовая доля влаги 43 2.2.2 Массовая доля золы 43
3. Содержание молекулярного йода, несвязанного

йодид-иона и ковалентно связанного органического йода 45

3.1. Методика определения свободного молекулярного йода

3.2. Методика определения йодид-ионов и

ковалентно связанного йода в пищевых продуктах и БАД 50

3.3 Валовое содержание йода. Метод

рентгенофлуоресцентного анализа (РФА) 59

4. Качественно-количественный состав:

4.1. Пробоподготовка: кислотный, ферментативный и щелочной гидролиз йодированных белков. 63

4.2. Элементный CHNS анализ 69

4.3. Ионный состав. Солевая нагрузка 74
^ 4.4. Термическая устойчивость йодированных белков 78 4.5. Переваримость «in vitro» 80
4.6. Аминокислотный хроматографический анализ 82

4.7 Количественное определение йодтирозинов в

гидролизатах йодированных белков методом ОФ ВЭЖХ 86
^ 5. Приложение 92 6. Заключение 99 7. Список использованных источников 102
Нормативные ссылки

В настоящем отчете о НИР использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 7.32-2001 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления

ГОСТ 7.54-88 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Представление численных данных о свойствах веществ и материалов в научно—технических документах. Общие требования

ГОСТ 7.12-93 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Библиографическая запись. Сокращение слов на русском языке. Общие требования и правила

ГОСТ 8.417-81 Государственная система обеспечения единства измерений. Единицы физических величин

ГОСТ 15.011-82 Система разработки и постановки продукции на производство. Порядок проведения патентных исследований

^ Определения, обозначения и сокращения

ИВА – метод инверсионной вольтамперометрии.

ЙДЗ- йод-дефицитные заболевания, т.е. различные патологические процессы, поражающие большие группы населения и возникающие там, где в окружающей среде содержится недостаточное количество йода.

МИТ-монойодтирозин (аминокислота, содержащая один атом йода в молекуле).

ДИТ-дийодтирозин (аминокислота, содержащая два атома йода в молекуле).

Йод-дефицитные заболевания (ЙДЗ) [2], т.е. различные патологические процессы, поражающие большие группы населения и возникающие там, где в окружающей среде содержится недостаточное количество йода, признаны актуальной проблемой здравохранения в 118 странах мира. В регионах йодной недостаточности проживает более полутора миллиарда человек, что придает этой проблеме особенно острый характер.

Основной причиной, приводящей к формированию йодного дефицита в организме и последующего развития ЙДЗ, является недостаточное поступление в организм йода из-за низкого содержания его в наиболее распространенных продуктах питания. Среди факторов, влияющих на рост ЙДЗ в настоящее время, следует отметить ухудшение экологической ситуации, радиационные техногенные катастрофы, высокие психоэмоциональные нагрузки вследствие урбанизации и интенсификации информационного потока. В России список этих факторов расширяется за счет негативных изменений структуры питания большей части населения в новых социально-экономических условиях, нарушения традиционных

межрегиональных связей, что привело к уменьшению снабжения продуктами, выращенными на почвах, богатых йодом. Наиболее эффективным методом борьбы с йод-дефицитными заболеваниями является массовая йодная профилактика, которая заключается в создании продуктов питания с заданным химическим составом и

свойствами или в обогащении йодом наиболее распространенных пищевых продуктов, в частности, соли, хлеба, воды, молока. К сожалению, таких продуктов в России, по сравнению со странами Европы и Северной Америки, выпускается еще мало и по количеству, и по ассортименту.

Йодсодержащие биологически активные добавки, включенные в реестр Госсанэпиднадзора Минздрава РФ и разрешенные к использованию в качестве дополнения к рациону, содержат либо неорганические соединения йода в виде его солей - йодида и йодата калия, либо молекулярный йод. В качестве источника йода используют также ламинарии - морские водоросли, содержащие йод в основном в неорганической форме. Основные трудности применения неорганических соединений йода для обогащения продуктов питания заключаются в их высокой летучести, возможности разрушения в процессе хранения и переработки, что значительно затрудняет их точное дозирование. Это касается и морских водорослей, так как содержание йода в них непостоянно и зависит от многих факторов (вида и возраста, места и условий произрастания, времени года, технологии переработки и хранения).

Проблема предупреждения йод-дефицитных состояний и связанных с ними заболеваний остается актуальной до настоящего времени и требует своего решения. Критически важным является выработка наиболее значимых критериев оценки качества йодированных белков - на основе натуральных белков молока, в которых йод связан химической ковалентной связью (по аминокислотным остаткам – тирозин, гистидин) и таким образом легко органифицируется и усваивается органами внутренней секреции (тиреоидной системой). Противоположным критерием качества

^ ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Проведение качественных и количественных анализов образцов йодированных белков «Биойод», производства ООО «Техновита» и «Йодказеин» производства ООО «Медбиофарм»»

1. ^ Обзор литературы. Предпосылки

Уровень снабжения организма поступающими с пищей биологически активными веществами оказывает выраженное влияние на его метаболический и физиологический статус. Существуют многочисленные доказательства важной роли микроэлементов в биосинтезе биологически активных веществ, и в их ряду общеизвестна роль йода как предшественника в синтезе тироксина и трийодтиронина и зависимость уровня образования этих гормонов щитовидной железы от снабжения организма йодом [4].

Многочисленные соединения йода, которые могут служить источником этого микроэлемента для организма, можно разделить на три группы:

- препараты, действующие свободным (молекулярным) йодом;

- вещества, диссоциирующие с образованием йодид- и йодат-ионов;

- органические соединения йода.

Среди последних особое положение занимают йодсодержащие белки.

1.1 ^ Механизм йодирования белков и структура соединений, образующихся при йодировании

Теоретически реакции, происходящие при действии йодирующих агентов на белки или составляющие их аминокислоты, можно разделить на три типа [Томчани О.В.]:

• присоединения;

• замещения;

• окисления.

Прохождение реакций замещения и окисления сильно зависит от аминокислотного состава йодируемого белка и условий проведения реакции. Наиболее легко идет реакция сульфгидрильных групп с йодом.

Образующийся сульфонилиодид является неустойчивым соединением и быстро гидролизуется. Если пространственное расположение SН-групп допускает, то могут образовываться дисульфидные связи. Дисульфидная связь, в свою очередь, способна окисляться, основным продуктом окисления является цистиновая кислота.

Цистиновая кислота была обнаружена в гидролизатах йодированного казеина.

Йод, прореагировавший с SH-группами, уже не используется на йодирование остатков других аминокислот, и эффективность йодирования снижается.

Поэтому при йодировании белков, содержащих SH-группы, прибегают либо к мягкому ферментативному йодированию либо к их предварительному окислению, которое проводят при рН 4,5, когда гидроксильная группа основной йодирующейся аминокислоты - тирозина не ионизирована, а условия для окисления подходящие.

Действию йодирующих агентов подвергаются также гидроксиаминокислоты (серии, треонин). Продукты их окисления не изучались. Энергично реагирует йод и с триптофаном. Однако, природа продуктов взаимодействия недостаточно ясна. Более всего вероятно окисление индол-группы триптофана до оксииндола .

Основной аминокислотой белков, вступающей с йодом в реакцию замещения, является тирозин. Гидроксил тирозина, связанный с ароматическим кольцом, является сильнейшим орто-пара-ориентантом, особенно в щелочной среде. Валентные электроны атома кислорода оказываются частично рассредоточенными в орто- положения бензольного ядра и тем самым создаются условия для прохождения реакции электрофильного замещения. Результатом взаимодействия йодирующего агента с тирозином является образование как монойод-(MIT), так и дийодпроизводного (DIT). Реакционная способность остатков тирозина ограничивается стерическими факторами, для полного их йодирования белок должен быть денатурирован :





Остатки других аминокислот начинают йодироваться после замещения 70% положений 3 и 5 в остатках тирозина. Известно, что часть йода может реагировать с гистидином, при этом могут образовываться 2- йодгистидин, 2,5-дийодгистидин и 1,2,5-трийодгистидин. Количество йода, связывающегося с гистидином, сильно зависит от условий проведения реакции. Йодирование групп в нейтральной среде происходит в 30-100 раз медленнее, чем тирозиновых, из-за большой энергии связи протона в имидазольном кольце.

В щелочных растворах, при рН больше 8,0, когда становится возможной диссоциация протонов в имидазольном кольце, йод может взаимодействовать с гистидиновыми группами. Поэтому при нейтральных значениях рН среды йод считается группоспецифическим агентом на тирозиновые остатки.

Йод, связанный с азотом в имидазольном кольце гистидина легко удаляется бисульфитом, связь C-I более устойчивая.

Йодирование белков приводит к тому, что один или несколько атомов водорода в их молекулах замещаются атомами йода. После йодирования белки уменьшают свою способность к кристаллизации и становятся менее растворимыми.

Свойства йодированного белка зависят от метода йодирования, но они изменяются при любом методе йодирования, если в молекулу белка входит более 4 атомов йода.

Все вышеперечисленные изменения физико-химических свойств белков при йодировании отражаются на их структуре и соответственно на иммунологических свойствах. Наиболее значительные изменения структуры белковых молекул происходят в результате образования дийодтирозиновых групп. Введение двух атомов йода в одну тирозиновую группу вызывает появление отрицательного заряда в молекуле белка, в результате чего белок начинает агрегировать, изменяя свою вторичную и третичную структуру. Это в свою очередь может приводить к потере специфической активности, играющей важную роль в получении йодированных белков в качестве средства профилактики йод-дефицитных состояний.

^ Методы йодирования белков

Методы йодирования белков, описанные в литературе и применяющиеся на практике, можно разделить на две группы:

• прямые методы йодирования, состоящие из одной стадии, в которой белок реагирует с йодирующим агентом и йод в результате включается в основную структуру белка. Эти методы предполагают использование белков, содержащих аминокислотные остатки, способные включать йод в свою структуру;

• методы опосредованного введения йода или методы конъюгирования, в которых к белку присоединяется предварительно йодированный реагент. Эти методы более трудоемки и используются, как правило, для введения радиоактивной метки в белки, не содержащие остатков аминокислот, способных включать йод в свою структуру, или в белки, включение йода в основную структуру которых приводит к разрушению их биологической активности.

Эти методы являются неэффективными для получения йодированного белка с целью применения его в качестве профилактического средства и потому далее рассматриваться не будут.

В зависимости от используемого источника йода методы прямого йодирования можно разделить на:

• метод с использованием молекулярного йода в качестве йодирующего агента;

• методы окисления, в которых источником йода для йодирования служат иодиды;

• метод с использованием хлористого йода в качестве йодирующего агента.

^ Использование молекулярного йода в качестве йодирующего агента

Молекулярная форма йода в водных растворах существует в поляризованном виде nН2О (Iδ+ ... Iδ-). При йодировании белков в реакцию вступают только положительно заряженные атомы:



Рис. 2 Механизм электрофильного замещения в бензольное кольцо с образованием атакующей электрофильной частицы Iδ+.

Источниками элементарного йода для йодирования белков могут быть различные соединения: йод в виде порошка или раствора или йодиды, из которых йод высвобождается с помощью различных окислителей.

Элементарный йод, используемый в качестве йодирующего агента или служащий промежуточным звеном в образовании катионов Iδ+ может добавляться в реакционную среду в виде порошка, раствора в различных растворителях или освобождаться из йодидов действием сильных окислителей. Только положительно заряженная поляризованная молекула йода может включиться в структуру йодирующейся аминокислоты.

Эффективность такого метода составляет не достигает 50%. На практике же она оказывается значительно ниже, а попытки поднять ее добавлением сильных окислителей для освобождения йода из йодидов в большинстве случаев, если не во всех, приводят к неблагоприятному влиянию на свойства йодированного таким образом белка.

При этом белки частично разрушаются, а образовавшиеся в результате гидролиза продукты распада связываются с избытком йода, что приводит к ошибочному завышению количества йода, включенного в белок.

В условиях щелочной среды количество включенного в белок йода увеличивается, и образовавшийся йодопротеин по физико-химическим свойствам не значительно отличается от исходного, т.е. его растворимость, размеры молекулы, аминокислотный состав минимально претерпевают изменения от исходного нативного состояния.

^ Методы окисления

В связи с развитием радиоизотопных методов для изучения обмена белков в норме и патологических состояниях у животных и человека исследования по введению йода в белки получили второй импульс. Так как радиоактивный йод доступен в виде йодида натрия, где йод является анионом, а для замещения водорода в аминокислотах белков (в первую очередь в тирозине) путем электрофильной атаки нужен катион Iδ+, катализаторами реакции йодирования белков служат окислители, способные отобрать у аниона йода электроны и превратить его в катион.

Одним из катализаторов, способствующих поляризации молекулы Iδ+... Iδ является N-хлортолуолсульфамид натрия, получивший торговое название «хлорамин Т». Метод йодирования белков с его использованием был впервые опубликован в 60-ые годы, но остается до сих пор одним из самых распространенных методов введения радиоактивной метки в белки. Принцип метода состоит в том, что в водном растворе хлорамин Т превращается в гипохлорную кислоту, которая в щелочной среде окисляет йодид натрия до атомарного йода, дающего в дальнейшем ионы Iδ+, которые в присутствии белка принимают участие в электрофильном замещении в аминокислотных остатках тирозина илигистидина в зависимости от рН среды. Скорость гидролиза хлорамина Т в нейтральных растворах невелика, поэтому хлорамин Т непосредственно сам способен окислять йодид-анион. Реакция йодирования идет практически мгновенно. Избыток хлорамина Т блокируется добавлением сильного восстановителя, обычно метабисульфита натрия.

Хлорамин Т как сильный окислитель представляет опасность для нативности белка. Наряду с йодидом окисляются также сульфгидрильные группы серосодержащих белков (цистеина) и S-СНз группы метионина, приводя к серьезным конформационным изменениям белков. Кроме того, хлорамин Т может также хлорировать ароматические кольца.

Поэтому данный способ йодирования белковой матрицы в применении пищевой продукции мало приемлем - контакт белка с хлорамином Т в таком случае должен быть сведен к минимуму и после йодирования должна немедленно следовать процедура очистки. Оптимальное значение рН для йодирования белков с использованием хлорамина Т - около 7,5, эффективность уменьшается при рН ниже 6,5 и выше 8,5. При рН 7-7,8 происходит замещение водорода в бензольном кольце тирозиновых остатков, а рН выше 8-8,5 благоприятствует замещению в имидазольном кольце гистидина. Последнее обстоятельство используется при необходимости йодирования белков, не содержащих остатков тирозина, но богатых остатками гистидина.

Молочные белки легко разрушаются, а также теряют ферментную активность после выдержки в среде такого сильного окислителя.

В качестве альтернативы методам химического окисления йодирования белков существует метод, использующий электролиз для превращения йодида в реакционно-способную форму. Раствор йодируемого белка в растворе хлористого натрия смешивают с Na125I и проводят электролиз в течение 40 минут. Полученный продукт сохранял высокий уровень иммунологической и биологической активности. Преимуществом этого метода является то, что протеин не подвергается действию ни окислителей, ни восстановителей, есть возможность регулирования скорости выделения свободного йода.

Наиболее химически «мягким» и направленным путём получения йодированных белков является ферментативный способ, впервые описанный в 1969 году, где в качестве катализатора окисления йодида используются ферменты (пероксидаза хрена, лактопероксидаза, хлорпероксид) в присутствии небольших количеств перекиси водорода Чаще всего используют лактопероксидазу, которая обладает большей окислительной активностью. При йодировании белка по этому методу его смешивают с йодидом натрия и лактопероксидазой, а затем инициируют и поддерживают реакцию добавлением порций перекиси водорода. Останавливают процесс йодирования добавлением цистеина или разведением. Иногда вводят две сопряженные ферментные системы: глюкоза и глюкозооксидаза образуют перекись водорода за счет воды и окисления глюкозы, а затем лактопероксидаза использует образующуюся перекись водорода для окисления йодида.

Преимущество ферментного йодирования состоит в том, что белок не находится в контакте с сильным окислителем.

^ Ферментативный способ получения биологически активной добавки к пище

Ферментативный способ предусматривает смешивание белкового сырья с водным раствором неорганического йода с обработкой ферментами. В качестве белкового сырья используют смесь обезжиренного свежего молока и белков различного природного происхождения. Процесс осуществляют при 18-45ºC реакционной смесью модифицированных ферментов, иммобилизованных на полупроницаемых мембранах или на инертных носителях, и комплексом минеральных солей с поддержанием рН раствора от 5-8. Далее осуществляют макро-, микро- и диафильтрацию раствора на ультрафильтрационной установке при рН 6,8-7,2. Процесс диафильтрации ведут при постоянном контроле остаточного количества свободного йода в растворе. Затем раствор йодированных белков подвергают стерилизующей микрофильтрации и сублимационной сушке с получением целевого продукта; изобретение обеспечивает упрощение и удешевление промышленного процесса получения неденатурированных растворимых йодированных пищевых белков без примесей химических реагентов и несвязанного йода с одновременным увеличением их выхода.

^ Применение хлористого йода

Метод разработан для эффективного введения радиоактивной метки в белки. Хлористый йод представляет собой стабильный коммерческий реактив, но может быть синтезирован в лабораторных условиях или условиях опытного производства различными методами, к примеру, обработкой водного раствора КJ в смеси с КJO3 концентрированной соляной кислотой:



Хлористый йод - вещество мало полярное (μ=0,65). В неполярных растворителях и в расплаве он подвергается в основном гомолитической диссоциации. Со многими органическими веществами в отсутствие растворителя и в неполярных растворителях хлористый йод действует хлорирующим образом, так как хлор является более активным галоидирующим средством, чем молекулярный йод. Недостатками йодирования хлористым йодом является агрессивная среда растворения. В малополярных растворителях (CCl4) белки подвержены не только йодированию, но также способны в значительной степени хлорироваться.

Концентрация соляной кислоты существенно влияет на поведение хлористого йода и направление реакции электрофильного замещения и, применяя его солянокислые растворы для йодирования органических соединений, необходимо создавать условия, благоприятствующие электролитической диссоциации ICI и повышению концентрации электрофильной атакующей частицы.

Реакции йодирования органических соединений хлористым йодом путем замещения атома водорода являются необратимыми, в отличие от йодирования молекулярным йодом, так как в этом случае выделяется НCl. Недостатком использования хлористого йода также является его высокая активность. Так при йодировании о- и п-толуидинов наряду с йодированием происходит и окисление этих аминов, в результате чего образуются осадки бурого цвета, получаются повышенные и несовпадающие результаты.

При йодировании белков с использованием хлористого йода в большинстве исследований используется щелочная среда. Необходимым условием введения йода в бензольное кольцо тирозина является предварительное превращение хлористого йода в гипоиодит, что наилучшим образом достигается созданием щелочной среды, например, путем добавления, глицинового буфера (рН 8,5) в раствор хлористого йода непосредственно перед смешиванием его с белком. Значение рН раствора не должно превышать 9,5, так как гипоиодит нестабилен выше этого значения. Потеря характерного желто-оранжевого цвета ICI свидетельствует об успешном прохождении реакции. После смешивания растворов белка и хлористого йода реакция происходит практически мгновенно, в течение не более одной минуты, после чего добавляют избыток метабисульфита натрия или другого восстановителя для остановки реакции. Расчет количества хлористого йода, добавляемого к белку, должен учитывать его расход на неспецифическое окисление, в основном SН-групп.

Главный недостаток метода йодирования белков с использованием хлористого йода состоит в том, что белок в процессе реакции находится в агрессивной окислительной среде, губительной для доступных функциональных групп и активности белка.

1.2 ^ БЕЛКИ МОЛОКА

Белковые вещества являются наиболее ценной в пищевом отношении частью молока, обеспечивают белковый обмен клеток организма. В молоке они представлены преимущественно казеином (2,7 %), сывороточными белками — альбумином (0,4%) и глобулином (0,2%), белками оболочек жировых шариков и некоторыми другими малоизученными белковыми веществами, а также азотистыми соединениями.

Белки молока содержат все незаменимые аминокислоты, поэтому относятся к полноценным.

На долю казеина приходится 80 % общего количества белков в молоке. Его молекулярный вес равен 32000.

Казеин является сложным белком — фосфопротеидом, в его молекулу входит остаток фосфорной кислоты, а фосфорнокислый кальций адсорбируется на поверхности молекул казеина. В молоке казеин находится в виде казеинат-кальций-фосфатного комплекса, легко распадающегося в изоэлектрической точке под действием кислот. Кальций выполняет роль «мостиков» между двумя молекулами казеина.

В молекуле казеина преобладают карбоксильные группы — СООН, поэтому он характеризуется кислотными свойствами.

Казеин устойчив к температурам пастеризации, но при длительном кипячении свертывается.

При сквашивании молока образующаяся молочная кислота отщепляет от молекулы казеина кальций, а свободная казеиновая кислота выпадает в осадок. При этом ионизированные группы —СОО переходят в незаряженные СООН. Изоэлектрическая точка молекул казеина наступает при рН 4,7, при удалении от этой точки электрозаряженность молекул казеина возрастает и сгусток начинает растворяться.

Альбумина в молоке содержится около 0,4—0,6 %, а в молозиве—10— 12 %. Он относится к простым белкам — протеинам, отличается от казеина низким содержанием азота, почти в два раза большим содержанием серы, отсутствием фосфора в молекуле.

Молекулярный вес альбумина 15000. Он растворим в воде, а также в слабых кислотах и щелочах, не осаждается под действием сычужного фермента и кислоты; выпадает в осадок при нагревании до температуры 70— 75 °С, при 85 °С он полностью выпадает в осадок и утрачивает способность растворяться. Известно три фракции альбумина: α, ß, γ.

Глобулин относится к сывороточным простым белкам, в молоке его содержится 0,1—0,2%, а в молозиве — до 5—10%.

В молоке обнаружена целая уникальная белковая система, являющаяся источником пищевых белков высокой биологической ценности.

Белки являются самым важным компонентом коровьего молока.

Казеин и сывороточные белки молока разнообразны по строению, физико-химическим, биологическим и функциональным свойствам. Как известно, белки молока всех млекопитающих необходимы для обеспечения быстрого роста и нормального развития новорожденных. Кроме того, белки коровьего молока имеют особое значение в питании человека.

Современная номенклатура и характеристика белков

Общепринятой во всем мире считается номенклатура белков молока, разработанная и опубликованная Комитетом по номенклатуре и методологии молочных белков Американской ассоциации молочной промышленности (ADSA).

Коровье молоко содержит 6 главных белков: αs1-казеин, αs2-казенн, ß-кааеин, ĸ-казеин, ß -лактоглобулин (ß -Лг) и α-лактальбумин (α-Ла).

Кроме того, в молоке имеется небольшое количество других белков
альбумина сыворотки крови, иммуноглобулинов и лактоферрина.
1.2.1 ^ Биологические функции белков.

Биологические функции молочных белков, как и любых других животных белков, многообразны. Так, казеины (казеин) молока, являются собственно пищевыми белками, выполняя в организме млекопитающих весьма важные структурные (пластические) функции. Они максимально расщепляются пищеварительными протеазами в нативном состоянии, в то время как обычно глобулярные белки приобретают эту способность только после денатурации (М. П. Черников).

Казеины обладают свойством свертываться в желудке новорожденного с образованием сгустков высокой степени дисперсности.

Важными биологическими функциями обладают сывороточные белки молока. Так, иммуноглобулины выполняют защитную функцию, являясь носителями пассивного иммунитета, лактоферрин и другие белки — лизоцим, лактопероксидаза, ксантиноксидаза, относящиеся к ферментам молока, обладают антибактериальными свойствами.

Многие белки молока выполняют транспортную роль. Например, казеин транспортирует в кишечник новорожденного Са, Р и Mg, лактоферрин — Fe, Р-лактоглобулин — витамин А.

Некоторым белкам свойственна регуляторная функция. Так, ß-лактальбумин регулирует действие фермента галактозилтрансферазы, направляя его на синтез лактозы, а не других олигосахаридов; компонент 3 протеозо-пептонов выполняет функции ингибитора липопротеидлипазы; ß-лактоглобулин — ингибитора плазмина.







Глобулин состоит из нескольких фракций: ß-лактоглобулина, эвглобулина и псевдоглобулина. Основная фракция глобулина - ß-лактоглобулин с молекулярным весом 36000, нерастворима в воде, но растворяется в слабых растворах солей и минеральных кислот. При нагревании раствора, имеющего слабокислую реакцию, до 75 °С глобулин выпадает в осадок. При пастеризации он осаждается вместе с альбумином. Изоэлектрическая точка ß-лактоглобулина находится при рН 5,3.

Эвглобулин и псевдоглобулин имеют молекулярный вес от 150000 до 1000000. Они содержат антитела — иммунные тела, благодаря чему обладают сильно выраженными бактерицидными свойствами.

Кроме основных белков, в молоке содержатся белки оболочек жировых шариков и бактериальных клеток ферментов. Белки оболочек жировых шариков относятся к сложным белкам, представляющим липопротеиновый комплекс, содержащий наряду с белками фосфатиды. Белки оболочек жировых шариков отличаются от молочного белка аминокислотнымсоставом, меньшим содержанием азота и фосфора. Белок оболочек живых шариков составляет 70 % массы оболочки, он осаждается полностью хлористым кальцием при нагревании или при добавлении соляной кислоты (рН 3,9—4,0).

1.2.2 ^ Аминокислотный состав белков.

Белки молока содержат почти все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках. Аминокислоты белков относятся к α-аминокислотам L-формы и имеют общую формулу:






В состав белков молока входят как циклические, так и ациклические аминокислоты — нейтральные, кислые и основные, причем преобладают кислые (табл. 2.4). По содержанию и соотношению незаменимых аминокислот белки молока относятся к биологически полноценным белкам. Количество отдельных групп аминокислот в


Таблица 1. Аминокислотный состав белков молока

Аминокислота

Обозначение

Содержание в полипептидной цепи

αs1-Кн В

αs2-Кн А

ß-Кн А,

к-Кн В

ß-Лг

α-JIa

Acпарагиновая кислота

Асп

7

4

4

4

10

9

Аспарагин

Асн

8

14

5

7

5

12

Треонин

Тре

5

15

9

14

8

7

Серин

Сер

8

6

11

12

7

7

Серинфосфат

Сер Р

8

11

5

1

-

-

Глутамнновая кислота

Глу

24

25

18

13

16

8

Глутамин

Глн

15

25

18

13'

16

8

Пронин

Про

17

10

35

20

8

2

Глицин

Гли

9

2

5

2

4

6

Алании

Ала

9

8

5

15

15

3

Цистеин

Цис

-

2

—

2

5

8

Валин

Вал

11

14

19

11

9

6

Метионин

Мет

5

4

6

2

4

1

Изолейцин

Иле

11

11

10

13

10

8

Лейцин

Лей

17

13

11

8

22

13

Тирозин

Тир

10

12

4

9

4

4

Фенилаланин

Фен

8

6

9

4

4

4

Лизин

Лиз

14

24

11

9

15

12

Гистидин

Гис

5

3

5

3

2

3

Триптофан

Цж

2

2

1

1

2

4

Аргинин

Apr

6

6

4

5

3

1

Всего




199

207

209

169

162

123



белках, определяемое породой, индивидуальными особенностями животных, стадией лактации, сезоном и другими факторами, обусловливает их физико-химич