Реферат: Факультет биотехнологии и биотехники кафедра промышленной биотехнологии Реферат По "Биотрансформации" Тема: Биотрансформация иммобилизованными ферментами

Национальный технический университет украины «Кпи»

факультет биотехнологии и биотехники

кафедра промышленной биотехнологии


Реферат По “Биотрансформации”


Тема:

Биотрансформация иммобилизованными ферментами.



Работу выполнил:

студент V курсу

ФБТ

Группы БТ-81

Островной Д.В.



Киев 2002

Оглавление


2. Свойства ферментов 5

3. Строение ферментов 9

4. Номенклатура ферментов 15

^ 5. Классификация ферментов и характеристика некоторых групп 19

6. Локализация ферментов в клетке 22

7. Методы выделения и очистки ферментов 24

Литература 53

1. Общие положения


Ферменты (от лат. fermentum - брожение, закваска), специфические белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие роль биологических катализаторов. Через их посредство реализуется генетическая информация и осуществляются все процессы обмена веществ и энергии в живых организмах. Ферменты бывают простыми или сложными белками, в состав которых наряду с белковым компонентом (апоферментом) входит небелковая часть - кофермент. Эффективность действия ферментов определяется значительным снижением энергии активации катализируемой реакции в результате образования промежуточных фермент-субстратных комплексов. Присоединение субстратов происходит в активных центрах, которые обладают сходством только с определенными субстратами, чем достигается высокая специфичность (избирательность) действия ферментов. Одна из особенностей ферментов - способность к направленному и регулируемому действию. За счёт этого контролируется согласованность всех звеньев обмена веществ. Эта способность определяется пространственность структурной молекулы ферментов. Она реализуется через изменение скорости действия ферментов и зависит от концентрации соответствующих субстратов и кофакторов, рH среды, температуры, а также от присутствия специфических активаторов и ингибиторов (например, адениловых нуклеотидов, карбонильных, сульфгидрильных соединений и др.). Некоторые ферменты помимо активных центров имеют дополнительные, т.н. аллостерические регуляторные центры. Биосинтез ферментов находится под контролем генов. Различают конститутивные ферменты, постоянно присутствующие в клетках, и индуцируемые ферменты, биосинтез которых активируется под влиянием соответствующих субстратов. Некоторые функционально взаимосвязанные ферменты образуют в клетке структурно организованные полиферментные комплексы. Многие ферменты и ферментные комплексы прочно связаны с мембранами клетки или её органоидов (митохондрий, лизосом, микросом и т.д.) и участвуют в активном транспорте веществ через мембраны.

Известно более 20000 различных ферментов, из которых многие выделены из живых клеток и получены в индивидуальном состоянии. Первый кристаллический фермент (уреаза) выделен американским биохимиком Д.Самнером в 1926 г. Для ряда ферментов изучена последовательность аминокислот и выяснено расположение полипептидных цепей в трёхмерном пространстве. В лабораторных условиях осуществлен искусственный химический синтез фермента рибонуклеазы. Ферменты используют для количественного определения и получения различных веществ, для модификации молекул нуклеиновых кислот методами генной инженерии, диагностики и лечения ряда заболеваний, а также в ряде технологических процессов, применяемых в лёгкой, пищевой и фармацевтической промышленностях.

2.^ Свойства ферменто^ Ферменты Области использования Гликозидазы
-амилаза Хлебопечение

» Пивоварение

» Производство кондитерских изделий

» Обработка текстильных изделий

» Производство высококачественной бумаги

глюкоамилаза Получение глюкозы

» Осахаривание ликеров и пива

инвертаза Производство кондитерских изделий лактаза Производство мороженого пектиназы Производство и осветление вин и фруктовых соков

» Производство кофе

целлюлазы Облагораживание растительных кормов

» Приготовление морковных джемов

» Обработка цитрусовых
Протеазы
протеазы микробного

происхождения Размягчение мяса

» Добавки к детергентам

» Обработка текстильных изделий

» Хлебопечение

» Осветление вин и пива

» Стабилизация сгущенного молока

» Выделка кож

бромелаин Размягчение мяса

» Стабилизация пива

папаин Осветление пива

» Получение белковых гидролизатов молока

» Размягчение мяса

фицин Размягчение мяса

трипсин Выделка кож

реннин Сыроделие

пепсин Сыроделие

» Стабилизация пива

Липазы Модификация вкуса молочных продуктов

» Сыроделие

Оксидоредуктазы Производство кондитерских изделий

» Выделка кож

глюкозооксидаза Удаление кислорода и/или глюкозы из пи-
щевых продуктов

» Пивоварение

» Приготовление майонезов

каталаза Удаление перекиси водорода после стерили-
зации молочных продуктов, после отбелива-

ния тканей, кожи,древесины и т. д.

Изомеразы

глюкозоизомераза Производство глюкозо-фруктозных сиропов


В основном, как видно, это относится к пищевой промышлен­ности, где применяются главным образом малоочищенные комп­лексные ферментные препараты для гидролиза природных полиме­ров — белков, крахмала, пектинов.

В последние полтора-два десятилетия определились пути расширения областей применения ферментов. Они связаны с полу­чением так называемых иммобилизованных ферментов, а также иммобилизованных клеток микроорганизмов [2]. Сочетание уни­кальных каталитических свойств ферментов с их водонерастворимостью в иммобилизованном виде послужило основой для создания ряда новых технологических процессов [4]. Эти процессы в настоя­щее время применяются главным образом в производстве пищевых продуктов.

К настоящему времени шесть процессов с использованием иммо­билизованных ферментов или клеток нашли крупномасштабное применение в пищевой промышленности ряда развитых стран мира.

1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов и далее фруктозы из глюкозы.

2. Получение оптически активных D-аминокислот из их рацеми­ческих смесей.

3. Синтез L-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты.

4. Синтез L-яблочяой кислоты из фумаровой кислоты.

5. Получение диетического безлактозного молока.

6. Получение cахаров из молочной сыворотки.


^ Получение глюкозо-фруктозных спиртов

Фруктоза, или иначе фруктовый, плодовый или медовый сахар, широко распространена в природе. Этот особый сахар содержится во многих фруктах и плодах. Особенно богаты им яблоки и поми­доры, а также пчелиный мед, который почти наполовину состоит из фруктозы. По сравнению с обычным сахаром (в состав молекул которого фруктоза также входит, но в виде химического соедине­ния с менее сладкой глюкозой) фруктоза обладает более приятным вкусом, и, согласно профессиональной терминологии, вкус фрукто­зы «медовый», а обычного сахара—«приторный». Далее, по сла­дости фруктоза на 60-70% слаще сахара, и соответственно ее меньшее потребление влечет за собой меньшую калорийность про­дукта. Это важно с точки зрения диетологии питания. Наконец, фруктозу в отличие от глюкозы или сахара могут потреблять боль­ные диабетом, и вообще замена сахара фруктозой существенно снижает вероятность этого заболевания. Дело в том, что физиологический путь использования человеческим организмом фруктозы совер­шенно другой, чем сахара или глюкозы, и не связан с превращени­ем инсулина. К этому остается добавить, что фруктоза значительно менее вредна для зубов (из-за кариеса), чем сахар, и в смеси с глюкозой не кристаллизуется (не засахаривается), что важно в производстве мороженого, кондитерских изделий и т. д.

Несмотря на все эти неоспоримые преимущества фруктозы по сравнению с обычным сахаром, ее производство в мире практиче­ски отсутствовало вплоть до начала 70-х годов. Однако после того как в 1973 г. американской компанией «Клинтон Корн» был внед­рен в промышленность процесс превращения глюкозы во фруктозу под действием иммобилизованного фермента глюкозоизомеразы, этот процесс стал самым крупным в мире по сравнению с другими, в которых используются иммобилизованные ферменты.

Научные основы процесса довольно просты. Фермент глюкозо-изомераза-катализирует превращение (изомеризацию) глюкозы во фруктозу в одну стадию, и реакция протекает до тех пор, пока в реакционной системе количества глюкозы и фруктозы не станут приблизительно равными. После этого реакция останавливается, и полученную смесь можно либо использовать в виде глкжозо-фруктозного сиропа, либо отделить фруктозу и оставшуюся глюкозу опять подвергнуть изомеризации. Этот процесс проводят непрерыв­но в реакционных колоннах высотой до 5 м, - которые предвари­тельно заполняют иммобилизованным ферментом в виде гранул, полых нитей, кусочков геля (типа желатины) и т. д. В колонну не­прерывным потоком подают раствор глюкозы (предварительно по­лученной при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала), из колонны вытекает глюкобзо-фруктозный сироп.

Об эффективности такой технологии свидетельствуют следую­щие данные: на 1 кг иммобилизованного фермента за 100 дней ра­боты получается 4 т фруктозы (в пересчете на сухой продукт) [4]. При этом время, за которое активность фермента уменьшается вдвое (так называемое время полуинактивации фермента) состав­ляет от 20 до 50 дней. Иначе говоря, катализатор (иммобилизован­ный фермент) в колонне следует заменять только раз в 2 или даже 3 мес и процесс благодаря этому становится экономически выгод­ным, особенно по сравнению с использованием растворимой глюко­зоизомеразы. Расчеты показывают, что в последнем случае затраты на фермент в 10 раз выше, и трудозатраты выше в 3 раза. В целом стоимость процесса с иммобиллизованным ферментом составляет лишь 61% от стоимости процесса с растворимым ферментом [4].

Современный завод по производству глюкозо-фруктозных сиро­пов с помощью иммобилизованного фермента, которых в мире име­ется уже несколько десятков, производит до 400 т продукта в день в пересчете на сухое вещество: В целом мировое производство глю­козо-фруктозных сиропов в 1980 г. достигло 2,5 млн. т и, по оцен­кам, составит около 4 млн. т в 1985 г. и Свыше 5 млн. т в 1990 г. В США уже в 1998 г. потребление населением фруктозы составило 12% от потребления сахара и ожидается дальнейший рост вплоть до 30—40% к 2000 г. В Японии уже к 1985—1990 г,. около 30% потребляемого в стране сахара будет заменено на глюкозо-фруктозную смесь и чистую фруктозу [4].


^ 9.2. Получение аминокислот

Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать все нужные им ами­нокислоты из более простых химических соединений. Однако чело­веческий организм способен синтезировать лишь 12 из 20 так на­зываемых «магических» аминокислот, необходимых ему для жиз­недеятельности. Остальные 8 аминокислот получили название незаменимых и должны поступать в организм извне - с пищей. При нехватке хотя бы одной из незаменимых аминокислот замед­ляется рост организма, начинаются болезни. Поэтому важно про­изводить эти аминокислоты для корректировки рационов питания, в лечебных и профилактических целях и т. д.

Производство многих аминокислот, в том числе и незамени­мых крупнотоннажная отрасль химической промышленности. Однако химики производят смесь оптических изомеров аминокис­лот, иначе говоря, смесь L- и D-аминокислот, молекулы которых в L- и D-форме представляют собой зеркальные отражения друг друга. В химических реакциях эти изомеры практически неразли­чимы, более того, по многим химическим критериям смесь L- и D-изомеров аминокислот представляет собой «химически чистое» вещество. Однако в большинстве случаев (исключением является лишь метионин) человеческий организм усваивает лишь L-аминокислоты, а их D-изомеры являются нежелательной примесью.

Разделение смеси L- и D-аминокислот, так называемой рацеми­ческой смеси, на составляющие ее изомеры стало первым процес­сом в мире, осуществленным с помощью иммобилизованных фер­ментов на промышленном уровне. Этот процесс был реализован в Японии компанией «Танабе Сейяку» в 1969 г. В течение 15 пред­шествующих лет данный процесс проводился компанией с приме­нением растворимого фермента—аминоацилазы, но он был недо­статочно экономичен. После перевода на иммобилизованную аминоацилазу экономическая эффективность процесса возросла в полтора раза, и в настоящее время компания осуществляет на промышленном уровне производство пяти L-аминокислот, из них четыре незаменимые (метионин, валин, фенилаланин, триптофан).

В качестве исходного вещества используются ацилированные L- и D-аминокислоты, полученные с помощью обычного химического синтеза, и их подвергают воздействию аминоацилазы. Фермент гидролизует только ацил-L-изомер, отщепляя от него объемную аыильную группу и тем самым резко увеличивая растворимость обра­зующейся L-аминокислоты по сравнению с присутствующим в реакционной системе ацил-D-изомером. После этого вещества легко отделяются друг от друга с помощью известных физико-химиче­ских приемов, продуктом является чистая L-аминокислота.

Остающаяся ацил-D-аминокислота при нагревании рацемизуется, т. е. переходит опять в смесь ацилированных L- и D-аминокислот, и процесс повторяют сначала. Таким образом, в итоге единствен­ным продуктом является L-аминокислота. Оказалось, что для аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь строение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфичность. Благодаря этому одна и та же реак­ционная колонна с иммобилизованной аминоацилазой может быть использована для производства самых различных, L-аминокислот.

Иммобилизованный фермент легко готовить, так как он просто адсорбируется на специальной смоле, которую затем помещают в колонну объемом 1 м3. Время полуинактдвации иммобилизованного фермента в промышленных условиях составляет 65 дней, и, когда активность катализатора падает ниже нормы (раз в несколько ме­сяцев), в колонну добавляют раствор свежего фермента, который опять адсорбируется на носителе. Устойчивость полимерного носи­теля для иммобилизации фермента столь высока, что он используется японской компанией более 8 лет в той же колонне без замены.


^ 9.3. Получение L-аспарагиновой кислоты

Аспарагиновая кислота не принадлежит к числу незаменимых, но производится в мире многими тысячами тонн. Она находит ши­рокое применение в пищевой промышленности для придания (в со­четании с другой аминокислотой—глицином) кондитерским изде­лиям и напиткам различных оттенков кислого или сладкого вкуса.

Замечателен процесс получения аспарагиновой кислоты с по­мощью фермента аcпартазы. С практической стороны он отличает­ся тем, что в качестве исходных веществ для ферментативного синтеза используются фумаровая кислота и аммиак, крупнотоннаж­ные продукты органического и неорганического синтеза. В отноше­нии самой реакции процесс интересен тем, что фермент здесь всего лишь в одну стадию присоединяет молекулу аммиака к двойной связи: фумаровой кислоты, сразу приводя к оптически активной L-аспарагиновой кислоте. Наконец, особенностью процесса явля­ется и, что в нем впервые в технологической практике были ис­пользованы иммобилизованные клетки микроорганизма, содержа­щие, фермент в его естественной микробиой оболочке. Этот процесс былразработаняпонской фирмой «Танабе Сейяку» в 1993 г.

Сначала японсйие технологи попытались использовать в качест­ве катализатора, микробную массу, состоящую из живых клеток микроорганизмов, содержащих внутриклеточный фермент, аопартазу. Однако время полуинактивации фермента в этих условиях у составляло всего 10 дней и было неприемлемым для технологии. Когда аспартазу выделяли из клеток и иммобилизовали в геле, время полуинактивации увеличилось до 30 дней. Когда же в гель включили сами микробные клетки и дополнительно усилили их путем химического связывания друг с другом и с гелем, стабиль­ность катализатора резко возросла и время полуинактивации фер­мента составило уже 120 дней. Плотный гель с иммобилизованны­ми в нем микробными клетками, содержащими аспартазу, формуют в кубики размерами 2—3 мм, набивают ими колонну объемом 1 м3 и пропускают через нее раствор фумарата аммония. На выходе из колонны L-аспарагиновую кислоту кристаллизуют, центрифугиру­ют и промывают холодной водой. Процесс практически полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Мас­штабы производства на фирме «Танабе Сейяку»—1700, кг чистой L-аспарагиновой кислоты в день на реактор объемом 1 м3.
^ 9.4. Получение L-яблочной кислоты

Яблочная кислота находит спрос на мировом рынке в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и фармацевти­ческих препаратах. Химическим путем (гидролизом ангидрида яб­лочной кислоты) производят только рацемическую смесь оптиче­ских изомеров яблочной кислоты, в то время как оптически актив­ный L-изомер, который получают микробиологическим способом, пока слишком дорог для широкого промышленного производства.

В то же время L-яблочную кислоту можно получать фермента­тивным путем из той же фумаровой кислоты, из которой получают L-аспарагиновую кислоту (см. выше). Только в данном случае фер­ментом является фумараза, которая присоединяет по двойной свя­зи фумаровой кислоты не аммиак, а воду. В остальном реакция происходит так же, и в качестве ферментного катализатора ис­пользуют клетки, содержащие фумаразу и иммобилизованные в гель. В обычных (интактных) клетках время полуинактивации фумаразы составляет 6 дней, в иммобилизованных в полиакриламид-ный гель — 55 дней.

Недавно компания «Танабе Сейяку» изменила технологию и перешла к другому микробному источнику фумаразы, стабильность и продуктивность которого выше в два раза по сравнению с преды­дущим. Помимо этого, компания стала использовать вместо поли-акриламидного геля в качестве носителя для иммобилизованных клеток другой гель на основе каррагинана — полисахарида из мор­ских водорослей. В итоге время полуинактивации иммобилизован­ного фермента составило 160 дней и продуктивность его действия возросла в 5,2 раза по сравнению с прежней технологией.

9.5. Получение без лактозного молока


Лактоза, или молочный сахар, содержится в достаточно боль­ших количествах в молоке и молочной сыворотке. Этот сахар ха­рактеризуется малой сладостью и низкой, растворимостью, и имен­но из-за его присутствия происходит кристаллизация мороженого и других молочных изделий и продуктов, которая иногда случается и приводит к малоприятным вкусовым ощущениям.

Молекулы лактозы состоят из глюкозы и галактозы и распада­ются на них при гидролизе под действием лактазы или b-галактозидазы. Молоко после такой обработки приобретает новые диетиче­ские качества, поскольку определенная часть населения не может употреблять молоко именно из-за наличия в нем лактозы. Это ка­чество организма получило название лактазной недостаточности, и в целом по направлению с севера нашей планеты на юг доля лю­дей, испытывающих лактазную недостаточность заметно возраста­ет. В Африке, например, целые племена и этнические группы не могут пить молоко домашних животных из-за сильных аллергиче­ских откликов или неприятных физиологических ощущений. В то же время они нормально усваивают молоко, не содержащее лакто­зы или предварительно обработанное иммобилизованной лактазой.

Первый коммерческий процесс получения безлактозного молока с использованием иммобилизованной лактазы был осуществлен итальянской фирмой «Сентрале дель Латте» в Милане. Получае­мое диетическое молоко несколько слаще обычного, поскольку глюкоза более сладкая, чем лактоза, однако это не мешает его употреблению. Стабильность иммобилизованного фермента доста­точно высока, и после 50 дней работы он сохраняет 80% первона­чальной активности. В настоящее, время завод в Милане произво­дит 10 т безлактозного молока в день.

9.6. Получение сахаров из молочной сыворотки


Молочная сыворотка содержит в своем составе большое коли­чество лактозы—около 5% в жидкой и 75% в высушенной сыво­ротке. Ферментативный гидролиз лактозы в этом случае открывает новые возможности получения сахаристых веществ и.з нетрадицион­ного сырья, вносит определенный вклад в решение кормовой проб­лемы и в проблему охраны окружающей среды, поскольку сыворот­ка большей частью не утилизируется.

Первый промышленный процесс гядролиза лактозы в молочной сыворотке с помощью иммобилизованной лактазы был реализован в 1980 г. совместно английской, французской и американской орга­низациями одновременно в Англии и Франции.

Перед введением в колонный реактор с иммобилизованным фер­ментом сыворотку пастеризуют, подвергают ультрафильтрации и пропускают через ионообменник, таким образом ее деминерализуя. Мощность установки составляет около 1000 л/ч при степени кон­версии лактозы 80%. Установка полностью автоматизирована. По­лучаемые при этом сахара (глюкоза и галаястоза) по сладости в полтора раза превышают сладость сахара в расчете на одинаковые экономические затраты.

Литература



Иммобилизованные ферменты Под ред. И. В. Березина, В. К. Антонова, К. Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1996. Т. 1. 296 с.; Т. 2. 358 с.

Березин И. В., Варфоломеев С. Д. Биокинетика. М.: Наука, 1979. 312 с.

Березин И. В., Варфоломеев С. Д., Казанская Н. Ф., Никольская И. И. Све­точувствительные каталитические системы.—Усп. науч. фотографии, 1988, 19, с. 255-262.

Березин И. В. и др. Кинетические особенности катализа иммобилизованными ферментами.—Усп. химии, 1985.

Березин И. В. и др. Механохимия иммобилизованных ферментов.— Журн. физ. химии, 1975, 49, с. 2519—'2528.

Введение в прикладную энзимологию — иммобилизованные - ферменты/Под ред. И. В. Березина, К. Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1982. 383 с.

Березин И. В., Мартинек К. Искусственные ферментативные светочувствитель­ные системы.—Усп. химии, 1989.

Химическая энзимология/Под ред. И. В. Березина, К. Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1983. 285 с.

Березин И. В., Мартинек К; Чазов Е. И. Ферментативные детекторы слабых сигналов.—Природа, 1980, № 11.

Варфоломеев С. Д. Конверсия энергии биокаталитическими системами. М.: Изд-во МГУ, 1981.256с.

Кулис Ю. Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных фермен­тов. Вильнюс: Мокслас, 1981. 200 с.

Марголин А. Л., Изумрудов В. А., Швядас В. Ю. и др. Обратимо раствори­мая пенициллинамидаза, иммобилизованная в полиэлектролитных комплек­сах—Докл. АН СССР, 1990.

Мартинек К„ Березин И. В. Стабилизация ферментов—ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику.—Усп. химии, 1980, 49, с. 737—770.

Мартинек К; Левашов А. В., Клячко Н. Л., Березин И. В. Катализ водорас­творимыми ферментами в органических растворителях.—Докл. АН СССР, 1977, 236, с. 920—923.

Мартинек К; Семенов А. Н. Катализ ферментами в органическом синтезе— Усп. химии, 1981, 50, с. 1376—1406.

Можаев В. В. Иммобилизация ферментов как подход к исследованию фунда­ментальных проблем биохимии.—Усп. биологической химии, 1983, 24.

Стрельцова 3. А., Швядас В. К; Максименко А. В. Влияние полиэлектролитов на свойства пенициллинамидазы,— Биоорган, химия, 1975.