Реферат: Молекулярно-генетическая природа первичных гемофагоцитарных лимфогистиоцитозов в россии 03. 02. 07 генетика 14. 01. 21 гематология и переливание крови

На правах рукописи


Милованова Наталья Викторовна


молекулярно-генетическая природа ПЕРВИЧНЫХ ГЕМОФАГОЦИТАРНЫХ ЛИМФОГИСТИОЦИТОЗОВ В РОССИИ


03.02.07 – генетика

14.01.21 – гематология и переливание крови


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


МОСКВА, 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН




^ Научные руководители:


доктор биологических наук, профессор

Поляков Александр Владимирович


кандидат медицинских наук

Масчан Михаил Александрович


^ Официальные оппоненты:



доктор медицинских наук, профессор

Журков Вячеслав Серафимович





кандидат медицинских наук,

Бронин Глеб Олегович



^ Ведущая организация:



ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава (РГМУ)



Защита состоится « » 2011 г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.


Автореферат разослан « » 2011 г.


Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

^ Актуальность проблемы

Гемофагоцитарные лимфогистиоцитозы (HLH - Hemophagocytic lymphohistiocytosis) - группа иммунологических заболеваний, характеризующаяся неконтролируемой пролиферацией цитотоксических лимфоцитов и гистиоцитов со стремительным фатальным течением без специальной терапии. Основными клиническими симптомами HLH являются лихорадка, гепатоспленомегалия, поражение ЦНС. Основными лабораторными показателями являются би- или пан-цитопения, гипертриглицеридемия, гиперферритинемия, гипофибриногенемия. При гистологических исследованиях обнаруживают лимфогистиоцитарную инфильтрацию и гемофагоцитоз (Janka G. E.et al., 1983).

Выделяют две формы HLH: первичные (наследственные) и вторичные. Вторичные формы HLH ассоциированы с различными инфекциями, онкологическими, аутоиммунными и другими заболеваниями, они являются более частыми и встречаются как у детей, так и у взрослых и требуют иной тактики лечения, чем первичные HLH (Janka G.E. et al., 1998). В ряде случаев нельзя клинически различить первичные и вторичные формы HLH. В данных случаях только молекулярно-генетическое исследование дает возможность правильно поставить диагноз и выбрать тактику лечения пациента.

Семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (FHL) и Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром (XLP) являются разновидностями первичных HLH. По международным данным частота FHL, наиболее распространенной формы первичных HLH, составляет 1 на 50 000 новорожденных (Henter J. I. et al., 1991), а XLP - от 1 до 3 на 1 000 000 новорожденных мальчиков (Purtilo D. T.et al., 1991). Генетически выделяют пять форм FHL: FHL1 (ген неизвестен, локус 9q21.3-22), FHL2 (ген PRF1, локус 10q21-22), FHL3 (ген UNC13D , локус 17q25), FHL4 (ген STX11, локус 6q24.1) и FHL5 (ген STXBP2, локус 19p13.3-13.2). Наиболее частой генетической формой заболевания в мире является FHL2 (ген PRF1, мутации в котором ответственны за 20 - 50% случаев заболевания). Ген PRF1 кодирует белок перфорин, участвующий в образовании пор в мембране клетки-мишени. Белок Munc13-4 (ген UNC13D, мутации в котором выявляют у 20 - 25% FHL пациентов) отвечает за последние этапы связывания цитотоксической гранулы с мембраной NK-, CTL- клеток. Белки синтаксин (ген STX11, мутации обнаруживают у 10 -20 % FHL пациентов) и Munc18-2 (ген STXBP2) тесно взаимодействуют друг с другом и регулируют экзоцитоз цитотоксических гранул (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene∂=hlh#hlh.Summary).

XLP– редкий первичный иммунодефицит, характеризующийся патологической реакцией организма на инфицирование вирусом Эпштейна-Барр (EBV). EBV вызывает развитие фульминантного инфекционного мононуклеоза, приводящего к HLH. В настоящее время известно две генетические формы заболевания, XLP1 – ген SH2D1A и XLP2 - ген BIRC4. Ген SH2D1A кодирует белок SAP, ответственный за передачу сигнала активации цитотоксического лимфоцита, за созревание NKT-клеток, за последние этапы дифференцировки В-клеток и Т-клеточный гомеостаз. Ген BIRC4 кодирует Х-сцепленный ингибитор апоптоза . По литературным данным мутации в гене SH2D1A находят у 16-60% , а в гене BIRC4 у 20% XLP пациентов (Filipovich A. H. et al., 2010).

Лечение FHL и XLP больных обычно проводится по протоколу HS2004 с последующим обязательным проведением трансплантации костного мозга (ТКМ). Без специального лечения и ТКМ эти заболевания являются летальными.

И FHL, и XLP являются генетически гетерогенными заболеваниями, и лишь молекулярно-генетическое исследование может определить генетическую форму болезни. До настоящего времени в России не была определена частота распространенности различных генетических форм FHL, не изучен спектр мутаций, приводящих к этому заболеванию, не разработан алгоритм молекулярно-генетического обследования таких пациентов.
^ Цель исследования: Исследование молекулярно-генетической природы первичных гемофагоцитарных лимфогистиоцитозов в группах российский больных. ^ Задачи исследования
В группе российских FHL пациентов исследовать кодирующие последовательности генов PRF1, UNC13D, STX11 и STXBP1, ответственных за развитие FHL, а также генов SH2D1A и BIRC4, ответственных за развитие XLP, включая прилегающие области экзон-интронных соединений. Изучить частоты встречаемости различных генетических форм FHL, определить спектр мутаций, определяющих развитие этого заболевания среди российских больных.

В группе российских XLP пациентов провести исследование кодирующих последовательностей генов SH2D1A и BIRC4, ответственных за развитие этого заболевания, включая прилегающие области экзон-интронных соединений. Определить частоты встречаемости двух основных генетических форм заболевания (XLP1 и XLP2).

Для наиболее часто встречающихся мутаций определить причины их распространенности в исследуемой выборке, разработать эффективные методы диагностики. Исследовать корреляцию генотип-фенотип и прогностическое значение наиболее распространенных генетических форм.

На основании полученных результатов разработать оптимальный алгоритм молекулярно-генетической диагностики первичных гистиоцитозов среди российских больных.
^ Научная новизна
Впервые в России проведено молекулярно-генетическое обследование российских FHL и XLP пациентов. Определен спектр мутаций в генах PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2, SH2D1A и BIRC4, определяющих развитие этих заболеваний у российских FHL и XLP пациентов.

Проведен анализ частоты встречаемости различных генетических форм FHL в группе российских больных. Впервые разработан алгоритм молекулярно-генетического анализа российских FHL пациентов.

Впервые в России проведен анализ причин высокой доли отдельных мутаций в исследуемой выборке. Показано влияние эффекта основателя на распространение этих мутаций в России.

Исследована корреляция генотип-фенотип для наиболее распространенной генетической формы - FHL3 и выполнена оценка влияния генетической формы заболевания на результаты терапии.

Разработан быстрый, простой и недорогой способ одновременного выявления трех наиболее частых мутаций в гене UNC13D с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Проведено молекулярно-генетическое исследование группы российских пациентов с клиническим диагнозом ХLP (Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром). Изучен спектр мутаций, приводящих к развитию этого заболевания.
^ Практическая значимость
Разработанная методика проведения молекулярно-генетического анализа FHL и XLP может быть использована для подтверждающей, дифференциальной, пресимптоматической и пренатальной диагностики этих заболеваний.

Сочетание методов клинической и молекулярно-генетической диагностики поможет врачам в выборе тактики лечения таких больных, в частности в решении вопроса о целесообразности проведения ТКМ для каждого конкретного больного.

Своевременная молекулярно-генетическая верификация диагноза позволяет ускорить планирование и реализацию программной химиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и, таким образом, увеличивает вероятность излечения пациентов с FHL.
Использование разработанного алгоритма молекулярно-генетического обследования российских больных поможет сделать проведение данной диагностики более эффективной, быстрой и менее дорогостоящей. ^ Положения, выносимые на защиту
Разработана методика молекулярно-генетического обследования российских FHL и XLP пациентов.

Определен спектр мутаций, приводящих к развитию заболевания в группе российских FHL пациентов.

Определен спектр мутаций, приводящих к развитию XLP в группе российских пациентов.

Наиболее частой генетической формой FHL в исследованной группе российских FHL пациентов является FHL3, обусловленная мутациями в гене UNC13D.

Причиной высокой частоты FHL3 в России является распространение в популяции отдельных мутаций в результате эффекта основателя.

Разработанный алгоритм молекулярно-генетического обследования российских FHL пациентов увеличит эффективность и ускорит проведение анализа.
^ Апробация работы
Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: Ежегодные конференции Европейского общества генетики человека (ESHG) в 2008 году (г. Барселона, Испания), 2009 году (г. Вена, Австрия), 2010 году (г. Гетеборг, Австрия)- стендовое сообщение; 24-я Ежегодная конференция международного общества гистиоцитологов в 2008 году (г. Берлин, Германия) – доклад; VI симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» в январе 2009 года (г. Москва) – доклад; 25-я Ежегодная конференция международного общества гистиоцитологов в 2009 году (г. Бильбао, Испания) – стендовое сообщение; XI Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в 2009 году (г. Санкт-Петербург) – доклад; Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы первичных иммунодефицитов» в 2009 году (г. Минск, Беларусь)- доклад; VI съезд Российского общества медицинских генетиков в 2010 году (г. Ростов) – доклад

^ Личный вклад автора в проведение исследования

Автор лично принимал участие в анализе отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, планировании экспериментов и получении основной части результатов. Автор самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, проводил поиск мутаций в исследуемых генах методом прямого автоматического секвенирования, самостоятельно анализировал все полученные результаты.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 10 печатных работах. Из них 3 статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

^ Внедрение результатов работы

Результаты исследований и практические рекомендации внедрены в работу МГНЦ РАМН.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Библиография содержит 72 источника, из них 3 отечественных и 69 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 19 рисунками.
^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Для исследования использовали образцы геномной ДНК 26 семей с клиническим диагнозом FHL (28 больных ребенка, 37 здоровых родственников) и 11 мальчиков с клиническим диагнозом XLP из различных регионов России (рисунок 1). Все пациенты обследованы или проконсультированы в РДКБ (Республиканской детской клинической больницы) или ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии».

Анализ клинических характеристик и исследование клинико-генетической корреляции проводились на основании ретроспективного анализа доступной медицинской документации. Статистический анализ выполнен в программе Statistica 7.0. Сравнение средних и медиан выполнено с помощью точного теста Фишера. Расчет общей выживаемости по методу Kaplan-Meier. Сравнение выживаемости между группами на основании log-rank теста.

^ Контрольная выборка взята из банка лаборатории ДНК диагностики МГНЦ РАМН. Её составили 100 необследованных детей того же возраста из различных регионов России (50 мальчиков и 50 девочек).

Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom TM из образцов периферической крови.

Исследование генов ^ PRF1, UNC13D, STX11, STXBP2, RAB27A, BIRC4 и SH2D1A проведено с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-интронных соединений. Амплификация необходимых фрагментов геномной ДНК проведена методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) Все фрагменты секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator’s v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проведен с помощью программы Chromas.

В случае обнаружения у пациента двух мутаций в одном гене, проведено исследование образцов ДНК родителей для подтверждения транс-положения обнаруженных изменений нуклеотидной последовательности.

При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене UNC13D были выбраны 8 микросателлитных маркеров на хромосоме 17q25, расположенных в области размером 7,4 млн.п.н. вокруг исследуемого гена. Физическая и генетическая локализация маркеров на хромосоме оценена с помощью карт Sequence и Marshfield той же базы. Для каждого из маркеров выбраны и синтезированы пары праймеров. Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении.

Для одновременного обнаружения трех наиболее часто встречающихся мутаций в гене UNC13D использовали мультиплексную амплификацию. Такая реакция позволяет одновременно амплифицировать и регистрировать несколько фрагментов разной длины. Этот метод значительно дешевле, проще и быстрее, чем прямое автоматическое секвенирование.

При выявлении у пациентов ранее неописанных нуклеотидных замен, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях, исследованы частоты их встречаемости в контрольной группе методом ПДАФ- или ПДРФ-анализов.
^ Результаты и обсуждение Исследование кодирующей последовательности генов в группе FHL пациентов
При исследовании гена PRF1 выявлен один пациент - носитель двух мутаций:

ранее описанная миссенс-мутация c.916G>T (p.306Gly>Cys), приводящая к изменению аминокислотной последовательности в области MAC домена (Trizzino et al.,2008).

ранее не описанная нонсенс-мутация c.1283G>A (p.428 Trp>Stop), приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона в области, кодирующей С2 домен белка.

Исследование всех экзонов и прилегающих областей экзон-интронных соединений гена ^ UNC13D проведено в 25 образцах ДНК FHL пациентов.

При исследовании гена UNC13D найдено 13 мутаций в 13 семьях на 23 хромосомах. Выявлены 1 гомозиготный (GL17) и 9 компаунд-гетерозиготных носителей двух различных мутаций (GL1-5, 19, 27, 32, 33) в этом гене. Три пациента (GL8, GL15, GL18) оказались гетерозиготными носителями одной мутации в гене UNC13D.

Три мутации в гене UNC13D c.1828insA (на двух хромосомах), c.2346_2349del (на четырех хромосомах) и c.3037insG (на пяти хромосомах)) выявлены на одиннадцати хромосомах в группе российских FHL пациентов. Это составляет 48% всех хромосом с мутацией, найденных в гене UNC13D. Высокая суммарная частота выявляемости этих трех мутаций делает целесообразным использование системы с использованием ПЦР-ПДАФ для одновременной диагностики этих мутаций, в качестве первого этапа исследования выборки российских пациентов.

Из 13 мутаций в гене ^ UNC13D, выявленных в результате проведенного исследования, 9 впервые описаны в данной работе (табл.1).

По две мутации в гене UNC13D найдены у 10 из 26 FHL пациентов. Доля FHL3 формы заболевания в исследованной группе составила 38%. Частота этой формы FHL в мире по литературным данным составляет от 17% в Германии (Zur Stadt U. et al., 2006) до 25% в Японии (Ishii E. et al., 2005)

Исследование гена STX11 проводилось в образцах ДНК 15 пациентов с неподтвержденным на первых этапах молекулярно-генетически FHL диагнозом. Выявлена одна ранее не описанная мутация c.675_679del во втором экзоне гена STX11 у пациента GL9 в гомозиготном состоянии. Обнаруженная мутация приводит к делеции трех аминокислот, вставке одной новой, исчезновению стоп-кодона и, предположительно, к образованию более длинной мРНК (p.H225_L227delinsHFsX127). Частота этой формы FHL сильно зависит от этнической принадлежности пациентов. Например, у курдов FHL4 выявляют у 20% пациентов, что связано с распространенностью в этой популяции нескольких мутаций, в других странах регистрируют единичные случаи FHL4 (Marsh R.A. et al., 2010).




Рис. 1 Регионы России, в которых проживают пациенты, составившие исследованную FHL группу


FHL4 форма диагностирована только у одного из обследованных пациентов, что соответствует международным данным о доле данной генетической формы заболевания в разных популяциях.

После первых трех этапов исследования диагноз не был подтвержден генетически 14-ти FHL пациентам. При исследовании кодирующих последовательностей гена RAB27A, ответственного за развитие синдрома Griscelli, не выявлено ни одной мутации. Согласно литературным данным до 10% пациентов с клиническим диагнозом FHL имеют мутации в гене RAB27A, что обусловлено тем, что нарушение пигментации у этих пациентов может быть очень незначительным (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene∂=hlh#hlh.Summary).Табл. 1. Мутации в гене UNC13D, выявленные в исследованной группе российских FHL пациентов (жирным шрифтом выделены мутации, впервые описанные в данной работе)

^ Выявленная мутация

Изменение аминокислотной последовательности

экзон / интрон

На скольких хромосомах выявлена

ссылка

c.919C>T

p.307Gln>Stop

экзон 11

1

новая

c.1055+5G>A

мутация сайта сплайсинга

интрон 12

1

новая

c.1592G>A

p.531Trp>Stop

экзон 18

1

новая

c.1828insA

p.R610HFsX6

экзон 20

2

новая

c.2216_2239del

p.N739_S747delinsS

экзон 23

2

новая

c.2867C>T

p.956Pro>Leu

экзон 30

1

новая

c.3011T>C

p.1004Asp>Gly

экзон 31

1

новая

c.3037insG

p.D1013GFsX11

экзон 31

5

новая

c.3173T>C

p.1058Leu>Pro

экзон 32

1

новая

с.2346_2349del

p.R782SFs11

экзон 24

4

E Rudd et al 2008

c.627delT

p.T209TFsX40

экзон 8

1

E Rudd et al 2008

c.322-1G>A

мутация сайта сплайсинга

интрон 4

1

Santoro et al 2006

c.2782C>T

p.928Arg>Cys

экзон 29

2

E Rudd et al 2008


После первых четырех этапов исследования диагноз остался не подтвержденным молекулярно-генетически у 14 пациентов. В образцах ДНК этих больных проведен поиск мутаций в гене STXBP2, ответственном за развитие FHL5 формы заболевания. Мутации в этом гене в исследованной FHL группе не выявлены, хотя по литературным данным эта форма заболевания встречается у 16% FHL пациентов в центральной Европе (Johnson J. et al., 2010; Zur Stadt U. et al., 2009).

Из 14 пациентов с неподтвержденным молекулярно-генетическим диагнозом FHL отобраны 10 мальчиков, семейный анамнез которых не позволял исключить Х-сцепленный тип наследования. При исследовании кодирующей последовательности гена SH2D1A обнаружены две мутации c.164G>T (p.55Arg>Leu) CD014961 (Dutz J.P. et al., 2001) у пациента GL14 и c.245_246insA (p.N82KFsX21) CI034488 у пациента GL34. Данные мутации приводят к развитию XLP согласно базе HGMD ( http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SH2D1A). Таким образом, в группе FHL пациентов выявлено два мальчика с Х-сцепленным лимфопролиферативным синдромом. Зарубежные исследователи первичных гистиоцитозов подчеркивают возможную клиническую неразличимость FHL и XLP и рекомендуют всем мальчикам с диагнозом, неподтвержденным при исследовании FHL генов, обязательно проводить поиск мутаций в генах SH2D1A и BIRC4, ответственных за развитие XLP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book =gene∂=hlh#hlh.Summary). В исследованной FHL группе мутации в гене SH2D1A обнаружены у 2 пациентов из 26 обследованных. При исследовании данной группы пациентов в гене BIRC4 мутации не выявлены.


Исследование кодирующей последовательности генов SH2D1A и BIRC4 в группе XLP пациентов

При исследовании образцов ДНК 11 пациентов XLP группы у шести пациентов (D1, 2, 19, 20, 21 и 24) выявлены мутации в кодирующей последовательности гена SH2D1A.

У пациента D1 обнаружена делеция всего гена. Три пациента (D2, 19 и 20) оказались носителями нонсенс-мутации с.163С>T (p.55Arg>Stop) CD981809 (Coffey A.J. et al., 1998) в гемизиготном состоянии. Также в этом же кодоне выявлена мутация c.164G>T (p.55Arg>Leu) CD014961 (Dutz J.P. et al., 2001) у пациента из FHL группы. Возможно, в области кодона 55 расположена «горячая точка» мутаций гена SH2D1A.

Обнаружены две ранее не описанные мутации в гене SH2D1A. У 8- летнего мальчика с В-клеточной лимфомой и лимфоидным васкулитом выявлена инсерция c.53insA, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона (p.KK18KFs49). 13-летний мальчик с фульминантным инфекционным мононуклеозом оказался носителем дупликации восьми нуклеотидов c.257_264dupCATTTCAG, которая проявляется в инсерции трех аминокислот, сдвиге рамки считывания и образовании преждевременного стоп-кодона.

По литературным данным мутации в гене ^ SH2D1A находят у 16-60% XLP пациентов (Filipovich A.H. et al., 2010; Sumegi J. et al., 2000). По-видимому, разница частоты выявляемости мутаций в гене SH2D1A обусловлена разными клиническими критериями отбора XLP пациентов в исследованные группы.

В нашей работе мутации в гене SH2D1A выявлены у 54% обследованных российских XLP пациентов, что хорошо соотносится с литературными данными.

При исследовании кодирующей последовательности гена ^ BIRC4 мутации не обнаружены в XLP группе пациентов. А по литературным данным мутации гена BIRC4 выявляют в среднем у 20% XLP пациентов (Rigaud S. et al., 2006).

Разработка метода выявления наиболее частых мутаций в гене UNC13D

В ходе исследования кодирующей последовательности гена UNC13D в группе российских больных встретились повторяющиеся мутации. Инсерция c.1828insA выявлена на двух хромосомах, делеция c.2216-2239del – на двух хромосомах, делеция c.2346_2349del – на четырех хромосомах, инсерция c.3037insG – на пяти хромосомах. Эти три мутации (c.1828insA, c.2346_2349del, c.3037insG) составили 48% от хромосом с мутацией, выявленных в гене UNC13D. Эти три мутации обнаружены у 9 FHL пациентов, что составляет 34% от всех обследованных больных и 69% от пациентов с мутациями в гене UNC13D. Были выбраны праймеры и подобраны условия для проведения мультиплексной амплификации, позволяющей регистрировать 3 наиболее частые мутации. Результаты представлены на рис. 2.

Данный метод обладает высокой степенью информативности, исследование продолжается не более двух дней, не требует использования дорогих реактивов и сложных методических подходов. Таким образом, разработан простой, быстрый и недорогой метод диагностики наиболее частых мутаций гена UNC13D.


1 2 3 4


97 п.н. – mut; 101 п.н. - N

82 п.н. – mut; 81 п.н. - N

70 п.н. – mut; 69 п.н. - N


Рис. 2. Использование мультиплексной ПЦР для выявления наиболее частых мутаций гена UNC13D.

Примечание: Дорожка 1 и 4 - мутация с.1828insA в гетерозиготном состоянии; Дорожка 2 – мутация c.3037insG в гетерозиготном состоянии; Дорожка 3 – мутация c.2346_2349del в гетерозиготном состоянии

Исследование гаплотипов хромосом, несущих мутации c.3037insG и c.2346-2349del

При исследовании кодирующей последовательности гена UNC13D выявлены две наиболее часто повторяющиеся мутации (делеция c.2346_2349del - на четырех хромосомах в семьях GL1, 5, 19 и 33, инсерция c.3037insG – в четырех семьях GL1, 2, 4, 17, на пяти хромосомах). Для семьи GL33 не удалось получить образцы крови родителей больного ребенка, поэтому эту семью исключили из дальнейшего исследования. Все эти семьи прибыли из различных регионов России:

GL1 - Свердловская область,

GL2 - Ханты-Мансийский автономный округ,

GL4 - Кемеровская область,

GL5 - Новгородская область,

GL17 - Башкортостан,

GL19 - Брянская область,

GL33 - Ярославская область.

Было предположено, что высокая доля данных мутаций может объясняться, так называемым «эффектом основателя».

Для исследования гаплотипа основателя выбраны восемь микросателлитных повторов на хромосоме 17q25, расположенных в области размером 7,4 млн.п.н. (9,2 сМ), содержащей исследуемый ген. Для определения гаплотипов хромосом, несущих мутации, проведено исследование образцов ДНК больных детей, их родителей и здоровых сибсов. Полные гаплотипы всех хромосом с мутациями указаны в табл. 2 и 3. В семье GL17 выявлено одно рекомбинационное событие на хромосоме, несущей мутацию c.3037insG.

Табл. 2 Гаплотипы хромосом с мутацией c.3037insG по восьми микросателлитным локусам

Маркер

D17S

1831

D17S

1352

D17S

1301

D17S

1839

UNC13D

D17S

1603

D17S

785

D17S

939

D17S

802

сМ

97.60

98.14

100.02

102.46

mut

102.99

103.53

105.68

106.80

GL1

5

3

2

6

mut

7

1

8

8

GL2

5

6

2

6

mut

7

3

8

7

GL4

6

3

2

6

mut

7

2

6

9

GL17.2

?

1

2

6

mut

7

1

7

7

GL17.3

?

5

2

6

mut

7

1

7

7

Примечание: Жирным шрифтом выделены аллели, составляющие сохранившуюся часть гаплотипа основателя

Табл. 3. Гаплотипы хромосом с мутацией c.2346_2349del по восьми микросателлитным локусам

Маркер

D17S

1831

D17S

1352

D17S

1301

D17S

1839

UNC13D

D17S

1603

D17S

785

D17S

939

D17S

802

сМ

97.60

98.14

100.02

102.46

mut

102.99

103.53

105.68

106.8

GL1

5

5

2

1

mut

2

3

9

10

GL5

3

1

5

1

mut

2

3

10

9

GL19

11

6

2

1

mut

2

3

8

7

Примечание: Жирным шрифтом выделены аллели, составляющие сохранившуюся часть гаплотипа основателя

Для всех хромосом, несущих мутацию c.2346_2349del, выявлен общий гаплотип D17S1839-D17S1603-D17S785: 1-2-3. Для всех хромосом с мутацией c.3037insG также обнаружен общий гаплотип D17S1301-D17S1839-D17S1603: 2-6-7. Можно предположить, что данные гаплотипы являются сохранившимися частями гаплотипов хромосом, на которых исходно в популяции возникли эти мутации. Количественная оценка неравновесия по сцеплению и расчет возраста мутаций в данных случаях не проведены из-за небольшого числа семей с выявленными мутациями. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что наблюдаемое распространение мутаций c.2346_2349del и c.3037insG в России происходило в результате эффекта основателя. Высокую частоту встречаемости в России FHL3 формы заболевания, по-видимому, можно объяснить распространенностью отдельных мутаций, возникшей в результате эффекта основателя.

Исследование корреляции генотип-фенотип

Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз – генетически гетерогенное заболевание. Различные генетические дефекты приводят к формированию сходного клинического фенотипа. Несмотря на строгие диагностические критерии, индивидуальное клиническое оформление болезни подвержено существенной вариации в части выраженности симптомов и лабораторных признаков болезни, возраста клинической манифестации и ответа на терапию. Соотнесение генетического дефекта с клиническим фенотипом необходимо для оптимизации клинической и лабораторной диагностики болезни, определения индивидуального прогноза, выбора тактики терапии и консультирования семьи.

В рамках настоящего исследования проведено сравнение основных клинических и лабораторных проявлений болезни, возраста манифестации, результатов иммуносупрессивной терапии, трансплантации костного мозга и исхода болезни в двух группах. Группы сравнения сформированы на основании результатов молекулярно-генетического анализа: группа 1 (FHL3) и группа 2 (FHL2, FHL4, неустановленный дефект). Дополнительный анализ выполнен в группе 1 на основании сравнения пациентов с миссенс-мутациями (5 человек) и пациентов с мутациями, приводящими к сдвигу рамки считывания (5 человек).

Результаты анализа представлены в табл. 4.

Кривые выживаемости представлены на рисунке 3.

На основании проведенного анализа принципиальных различий в основных клинических и лабораторных проявлениях болезни и результатах терапии между выделенными группами не выявлено. Анализ клинико-генетической корреляции ограничен малым объемом вы