Реферат: Методические указания мук 1111-02

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач

Российской Федерации - Первый заместитель

Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

26 февраля 2002 г.


Дата введения: 1 мая 2002 г


4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса)

для санитарно-микробиологического исследования питьевой воды

Методические указания


МУК 4.2.1111—02


1. Разработаны Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Подунова Л. Г., Кривопалова Н. С., Сорокина Р. С.) при участии фирмы «SY-LAB», Австрия (М. Шинкингер, Соколов Д. М.).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. № 12 от 14 февраля 2002 г.).

3. Утверждены Главным государственным санитарным; врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 26 февраля 2002 г., введены в действие с 1 мая 2002 г.

4. С момента ввода данных методических указаний считаются утратившими силу «Методические рекомендации по проведению бактериологических исследований питьевой воды с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100» № 01 - 19/82—23 от 22.05.96 и раздел 6 «Исследование питьевой воды» методических указаний МУК 4.2.590—96 «Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100».

5. Введены впервые.


^ 1. Область применения


1.1. Настоящие методические указания предназначены для центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора, осуществляющих контроль качества питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжения, а также для лабораторий организаций, предприятий и иных хозяйственных субъектов, обеспечивающих производственный контроль.

1.2. Методические указания устанавливают ускоренный метод качественного и количественного определения индикаторных микроорганизмов в питьевой воде в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.4.1074—01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

1.3. Настоящие методические указания разработаны для осуществления объективного, достоверного и быстрого санитарно-микробиологического анализа питьевой воды с целью контроля ее качества и для обеспечения безопасности и безвредности воды в централизованных системах питьевого водоснабжения.


^ 2. Сущность метода


Методические указания содержат описание санитарно-микробиологического исследования питьевой воды по показателям качества СанПиН 2.1.4.1074—01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества» с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100»* производства австрийской фирмы «SY-LAB».

____________

* Далее «Бак Трак».


Предлагаемый анализатор является автоматизированной системой, созданной на основе импедансной технологии и предназначенной для ускоренной количественной и качественной оценки степени микробного загрязнения исследуемой пробы.

Импеданс - это сопротивление потоку переменного тока через проводящий материал. Импедансная технология в микробиологии является непрямым культуральным методом для определения микроорганизмов с использованием измерения электрического сопротивления. Изменения импеданса происходят в питательной среде по мере того, как ее химический состав преобразуется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. Под действием микроорганизмов заряженные конечные продукты метаболизма выделяются в ростовую среду.

В основном незаряженные или слабозаряженные субстраты превращаются в сильнозаряженные конечные продукты: белки утилизируются до аминокислот, углеводы и жиры — до органических кислот и т. д. Образующиеся метаболиты имеют меньший размер и, таким образом, более подвижны. Эти электрохимические процессы приводят к существенным изменениям импеданса. Когда количество микроорганизмов достигает порога около 106—107 клеток/мл, наблюдаются экспоненциальные изменения импедансного сигнала. Время, необходимое для достижения значимого изменения импеданса, называется временем определения импеданса (IDT). Значение IDT обратно пропорционально начальной концентрации микроорганизмов в исследуемой пробе. Ход кривых импедансного сигнала соответствует и отражает кривую роста микроорганизмов в исследуемой пробе.

Селективные питательные среды, специально разработанные для измерения импеданса в системе «Бак Трак 4100», позволяют определять микробиологические показатели качества питьевой воды в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.4.1074—01 и сокращают сроки получения результатов.


^ 3. Нормативные ссылки


3.1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52—ФЗ.

3.2. «Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» от 22.07.93 № 5487—1.

3.3. Санитарные правила и нормы «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». СанПиН 2.1.4.1074—01.

3.4. Методические указания «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды». МУК 4.2.1018—01.

3.5. Методические указания «Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100». МУК 4.2.590—96.


^ 4. Проведение анализа


Исследование проводится по микробиологическим показателям качества питьевой воды, регламентированным СанПиН 2.1.4.1074—01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

Определяемые показатели:

1. Общее число микроорганизмов в 1 мл.

2. Общие колиформные бактерии в 100 мл.

3. Термотолерантные колиформные бактерии в 100 мл.

4. Споры сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл.

5. Колифаги в 100 мл.

Отбор, хранение и транспортирование проб для исследования, а также подготовка их к анализу и методика работы при использовании мембранных фильтров проводятся в соответствии с требованиями МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».


4.1. Определение общего числа микроорганизмов


1. Питательная среда: BiMedia 001 А, приготовленная в соответствии с требованиями инструкции изготовителя.

2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °С на приборе «Бак Трак».

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

• М-параметр 0—50 %

• Е-параметр 0—50 %

Время задержки (Delay) 1 ч

3. Установка пороговых значений (Thresholds):

3.1. В случае использования калибровочного файла для исследования питьевой воды параметры пороговых значений вносятся автоматически (имеется коммерческий калибровочный файл для исследования питьевой воды — WATER.COR).

3.2. При отсутствии калибровочного файла одновременно с посевом исследуемого образца воды на среду BiMedia 001 А производится определение общего количества бактерий классическим методом на чашках Петри в соответствии с требованиями МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».

Наименования рекомендуемых для использования в данном случае питательных сред приведены в разделе 6 данных методических указаний.

Результаты, полученные при классическом методе исследования (KOE/CFU в 1 мл), вносят в соответствующий файл (MAIN MENU / DATA FUNCTION / ENTER VALUES). Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в разделе 5 данных указаний.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 001 А.

5. Внести 1 мл исследуемого образца воды в измерительную ячейку с 9 мл питательной среды.

6. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).

7. Для контроля среды используют одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 001 А (без инокулята).

8. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерение.

9. После того, как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор «Бак Трак».

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

При пересечении порогового значения происходит автоматический подсчет численности микроорганизмов в исследуемом образце воды.

Результат определения КОЕ (CFU) выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в 1 мл исследуемого образца воды.

Учет результатов проводится по М-параметру.


4.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий


Исследование может проводиться одним из трех методов:

1) мембранной фильтрации с последующим тестированием на микробиологическом экспресс-анализаторе «Бак Трак»;

2) титрационным с предварительным этапом накопления бактерий в жидкой питательной среде;

3) прямого измерения с использованием измерительных ячеек прибора «Бак Трак» объемом 100 мл.


4.2.1. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из установленного объема анализируемой пробы воды и дальнейшем определении показателя на приборе «Бак Трак». Используется метод мембранных фильтров в соответствии с МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».

1. Среда BiMedia 160 B* приготовленная в соответствии с требованиями инструкции изготовителя.

__________________

* Возможно использование питательной среды BiMedia 160 С при необходимости определения индолообразования.


2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °С на приборе «Бак Трак».

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Время исследования (Duration) - 24 ч

Масштаб измерений (Scale)

• М-параметр 0—50 %

• Е-параметр 0—50 %

Время задержки (Delay) 1 ч

3. Установка пороговых значений (Thresholds):

3.1. В случае использования калибровочного файла для исследования питьевой воды параметры пороговых значений вносятся автоматически (имеется коммерческий калибровочный файл для исследования питьевой воды на колиформные бактерии - COLI.COR).

3.2. В отсутствие калибровочного файла одновременно с посевом исследуемого образца воды на среду BiMedia 160 В производится определение наличия колиформных бактерий классическим методом мембранных фильтров в соответствии с МУК 4.2.1018—01.

Результаты, полученные при классическом методе исследования, вносят в соответствующий файл (MAIN MENU / DATA FUNCTION / ENTER VALUES). Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в разделе 5 данных указаний.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл среды BiMedia 160 В.

5. Поместить мембранный фильтр исследуемого образца воды в измерительную ячейку с 10 мл среды.

6. Для контроля среды используют измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 160 В.

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерение.

8. После того, как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор «Бак Трак».

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDТ) будут записаны автоматически.

При наличии в исследуемом образце воды единичных клеток колиформных бактерий изменение сигнала импеданса превышает 5 %-ное пороговое значение по М-параметру за период времени менее 16 часов.

При положительном результате наблюдается также изменение цвета питательной среды: исходный пурпурный цвет среды меняется на желтый.

При использовании калибровочного файла результат исследования выдается автоматически в виде количества колиформных бактерий в исследуемом объеме воды.

Для постановки оксидазного теста и определения ферментации лактозы при (44 ± 0,5) °С с целью подтверждения наличия или отсутствия термотолерантных колиформных бактерий в исследуемой пробе из ячеек с признаками роста колиформных бактерий делают высев петлей на чашки Петри со средой Эндо. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ± 2 часов.

Постановка тестов проводится в соответствии с требованиями МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».


4.2.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий прямым методом с использованием измерительных ячеек объемом 100 мл

1. Концентрированная среда BiMedia 160 В (5-кратной концентрации)*.

________________

* Для приготовления концентрированной среды навеска сухого препарата среды увеличивается в 5 раз, а объем дистиллированной воды остается прежним.


2. Протокол измерения.

2.1. Установить температуру 37 °С на приборе «Бак Трак».

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters)

Время исследования (Duration) - 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

• М-параметр 0—50 %

• Е-параметр 0—50 %

Время задержки (Delay) 1 ч

3. Установка пороговых значений (Thresholds):

3.1. В случае использования калибровочного файла для исследования питьевой воды параметры пороговых значений вносятся автоматически (имеется коммерческий калибровочный файл для исследования питьевой воды на колиформные бактерии - COLI.COR).

3.2. В отсутствие калибровочного файла одновременно с посевом исследуемого образца воды на среду BiMedia 160 В производится определение колиформных бактерий классическим методом мембранных фильтров в соответствии с МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».

Результаты, полученные при классическом методе исследования, вносят в соответствующий файл (MAIN MENU / DATA FUNCTIONS / ENTER VALUES). Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в разделе 5 данных указаний.

4. Поместить 100 мл исследуемого образца воды в измерительную ячейку прибора объемом 100 мл.

5. Добавить в каждую измерительную ячейку по 20 мл концентрированной среды BiMedia 160 В.

6. Для контроля среды используют одну измерительную ячейку со 100 мл стерильной дистиллированной воды и 20 мл концентрированной среды BiMedia 160 В.

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерения.

8. После того, как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор «Бак Трак».

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

При наличии в исследуемом образце воды единичных клеток колиформных бактерий изменение сигнала импеданса превышает 5 %-ное пороговое значение по М-параметру менее чем за 16 часов.

При положительном результате наблюдается также изменение цвета питательной среды с исходного пурпурного до желтого.

При использовании калибровочного файла результат исследования выдается автоматически в виде количества колиформных бактерий в исследуемом объеме воды.

Из ячеек с признаками роста колиформных бактерий делают высев петлей на чашки Петри со средой Эндо для постановки оксидазного теста и определения ферментации лактозы при (44 ± 0,5) °С с целью подтверждения наличия или отсутствия термотолерантных колиформных бактерий в исследуемой пробе. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 2) ч.

Постановка тестов проводится в соответствии с МУК 4.2.1018—01.


4.2.3. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Определение колиформных бактерий титрационным методом проводится в соответствии с МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды» на приборе после этапа подращивания засеянных объемов пробы анализируемой воды в средах накопления.

Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой пробы воды в жидкую питательную среду для накопления бактерий с последующим высевом в измерительную ячейку прибора.

1. Среда BiMedia 160 B, приготовленная в соответствии с требованиями инструкции изготовителя.

2. Протокол измерения

2.1. Установить температуру 37 °С на приборе «Бак Трак».

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч

Масштаб измерений (Scale)

• М-параметр 0—50 %

• Е-параметр 0—50 %

Время задержки (Delay) 1 ч

3. Установка пороговых значений:

Пороговые значения (Thresholds)

• М-параметр 5 %

• Е-параметр 10 %

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) - 3 ч.

4. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 160 B.

5. Внести 1 мл из каждого объема с признаками роста в среде накопления в 9 мл среды BiMedia 160 В.

6. Для контроля среды использовать одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 160 В (без инокулята).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерения.

8. После того, как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор «Бак Трак».

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

При наличии в засеянных после накопления объемах колиформных бактерий сигнал импеданса превышает 5 %-ное пороговое значение по М-параметру в течение 3 ч.

При положительном результате наблюдается также изменение цвета питательной среды с исходного пурпурного на желтый.

Для постановки оксидазного теста и определения ферментации лактозы при (44 ± 0,5) °С с целью подтверждения наличия или отсутствия термотолерантных колиформных бактерий в исследуемой пробе из засеянных объемов с признаками роста в среде накопления делают высев петлей на среду Эндо. Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение (18—20) ч.

Постановка тестов проводится в соответствии с МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».

Для ускорения получения результатов на присутствие термотолерантных колиформных бактерий допустимо проводить высев 1 мл из объема среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование, в измерительную ячейку «Бак Трак» с 9 мл среды BiMedia 160 В и инкубировать при режиме (44 ± 0,5) °С по вышеописанному протоколу измерения.

Учет результатов титрационного метода ведется в соответствии с МУК 4.2.1018—01, раздел 8.3.5.


4.3. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий


Сущность метода заключается в концентрировании определенного объема исследуемого образца воды с использованием мембранных фильтров и последующем тестировании на приборе «Бак Трак».

1. Среда BiMedia 660 А (готовится в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя).

2. Протокол измерения:

2.1. Установить температуру 43 °С на приборе «Бак Трак».

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

• М-параметр 0—50 %

• Е-параметр 0—50 %

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

• М-параметр 5 %

• Е-параметр 10 %

Проводить учет результатов по М-параметру.

Пороговое значение по времени (Time limit) - 23 часа.

Определение сульфитредуцирующих клостридий необходимо проводить, используя измерительные ячейки для анаэробов.

3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 10 мл питательной среды BiMedia 660 А.

4. Отфильтровать соответствующее количество исследуемого образца воды (20 мл), в котором не допускается наличия спор сульфитредуцирующих клостридий, и поместить фильтр в измерительную ячейку со средой.

5. Для контроля питательной среды используют одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 660 А.

6. Поместить измерительные ячейки с образцами исследуемых проб воды и контролем питательной среды в штатив и прогреть на водяной бане при температуре (75  5) °С в течение 15 мин.

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерения.

8. После того, как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор «Бак Трак».

Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.

^ Учет результатов

Образец загрязнен спорами сульфитредуцирующих бактерий, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 23 часов.

При положительном результате на стенках измерительной ячейки должен обнаруживаться выпавший осадок черного цвета.


Примечания:

Определение возможно проводить, используя обычные измерительные ячейки и парафиновое масло.

Для этого необходимо добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл питательной среды BiMedia 660 А и 1 мл парафинового масла (как покрывающий слой) и автоклавировать ячейки с внесенной в них питательной средой и парафиновым маслом (крышки должны быть приоткрыты!).


4.4. Прямой метод определения колифагов


Определение колифагов в воде проводится в измерительных ячейках объемом 100 мл.

1. Среда BiMedia 001 А десятикратной концентрации *.

_______________

* Для приготовления концентрированной среды навеска сухого препарата среды увеличивается в 10 раз, а объем дистиллированной воды остается прежним.


2. Протокол измерения:

2.1. Установить температуру 37 °С на приборе «Бак Трак».

2.2. Установить в основном меню программы прибора параметры.

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):

Время исследования (Duration) - 24 ч

Масштаб измерений (Scale):

• М-параметр 0—50 %

• Е-параметр 0—50 %

Время задержки (Delay) 1 ч

Пороговые значения (Thresholds):

• М-параметр 5 %

• Е-параметр 10 %

Учет результатов проводится по М-параметру.

3. Отфильтровать 100 мл исследуемой пробы воды через фильтр для микробиологических целей с диаметром пор не более 0,45 мкм.

4. Фильтрат поместить в измерительную ячейку с 10 мл концентрированной среды BiMedia 001 А.

5. Внести 1 мл, 0,1 мл и 0,01 мл свежей ночной культуры чувствительного к фагу штамма Е.coli* в измерительные ячейки с отфильтрованными образцами воды.

__________________

* Наименование тест-культуры и подготовка ее для использования в методике определения колифагов указаны в соответствующих разделах МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».


6. Для контроля использовать измерительные ячейки со 100 мл стерильной воды + 10 мл концентрированной среды BiMedia 001 А + ночная культура чувствительного к фагу штамма Е.coli (1 мл, 0,1 мл, 0,01 мл).

7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (START MEASUREMENT) и начать измерение.

8. После того, как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор «Бак Трак».

Измерение начнется автоматически через 1 час после загрузки ячеек в прибор.

9. Оценка результатов:

• при отсутствии колифагов в воде время детекции импеданса (IDT) будет одинаковым как для исследуемого, так и для контрольного образца (при сравнении одинакового количества внесенной культуры Е. coli);

• при наличии колифагов в воде время детекции импеданса (IDT) для исследуемых образцов будет больше по сравнению с контролем (при сравнении одинакового количества внесенной культуры Е. coli). Изменится также форма кривой импедансного сигнала.


Примечание. Использование различных количеств тест-культуры Е. coli рекомендуется только для начального этапа отработки и нахождения оптимальной плотности культуры. В дальнейших исследованиях возможно использование лишь оптимального количества вносимой культуры. Рекомендуется не превышать показатель 100—1000 клеток Е. coli в измерительной ячейке.


^ 5. Основные этапы создания калибровочного файла


Для создания калибровочного файла необходимо исследовать не менее 50 проб воды централизованных систем питьевого водоснабжения параллельно двумя методами: классическим и с помощью прибора «Бак Трак».

Для этого необходимо:

1. В основном меню программы «Бак Трак» MAIN MENU в разделе «Задание пороговых значений» (THRESHOLDS) не указывать пороговые значения (NONE).

2. Провести исследование проб воды с использованием прибора в соответствии с требованиями данных указаний и параллельные исследования этих же проб классическим методом по МУК 4.2.1018—01 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».

3. Результаты классического метода исследования занести в соответствующий файл данных программы «Бак Трак».

Для этого:

3.1. В основном меню программы «Бак Трак» выбрать раздел «Работа с данными» (Data Functions).

3.2. В меню Data Functions выбрать соответствующие файлы исследования проб воды в разделе «Выбор файлов» (Select files).

3.3. Внести в меню «Data Functions» в разделе «Ввод численных значений» (Enter Values) результаты для соответствующих исследованных проб воды.

4. После того, как будет получено не менее 50 результатов исследования двумя параллельными методами - классическим и автоматическим с помощью прибора «Бак Трак» - можно приступать к созданию калибровочного файла.

5. Основные этапы создания калибровочного файла

5.1. В основном меню программы «Бак Трак» выбрать раздел «Работа с данными» (Data functions).

5.2. В меню «Работа с данными» (Data functions) выбрать соответствующие файлы исследования (не менее 50 проб) питьевой воды в разделе «Выбор файлов» (Select files).

5.3. В меню «Работа с данными» (Data functions) выбрать раздел «Построение калибровочного файла» (Correlation).

5.4. Указать «Пороговое значение» (Thresholds) для М-параметра или Е-параметра, по которому будет проводиться построение калибровочной кривой. Как правило, для построения калибровочной кривой используется М-параметр, численное значение которого 5 %.

5.5. После задания порогового значения М-параметра необходимо вычислить корреляцию (Calculate).

5.6. Если коэффициент корреляции r превышает значение (-0,85), то данная калибровочная кривая показывает высокую степень корреляции и отвечает требованиям (рис. 5.1, 5.2).

5.6.1. Указать «Пороговое значение по времени» (Time-Limits). Для этого в полученное уравнение регрессии (уравнение калибровочной кривой) необходимо подставить максимально допустимое значение определяемого показателя (ОМЧ, колииндекс и т. д.), регламентированное в данном случае СанПиН 2.1.4.1074—01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». Далее следует вычислить логарифм определяемого показателя и определить из уравнения значение времени - (t). Это и есть величина «Порогового значения по времени» - Time Limits.


File: Text:

Threshold M: 5% Threshold E: 10 % In Use: M-Value

No Limits

Correlation: log (CFU) = -0.1722 * t + 3.6434 correlation factor: r = -0.9811

Dispersion: Syx = 0.1381


104 files used for correlation







Рис. 5.1. Корреляция между логарифмом численности микроорганизмов -

log КОЕ (CFU) и временем определения импеданса — t для образцов

питьевой воды с использованием среды BiMedia 001 А.


File: Text:

Threshold M: 5% Threshold E: 10 % In Use: M-Value

No Limits

Correlation: log (CFU) = -0.2426 * t + 4.4401 correlation factor: r = -0.9605

Dispersion: Syx = 0.2240


101 files used for correlation








Рис. 5.2. Корреляция между логарифмом численности микроорганизмов -

log КОЕ (CFU) и временем определения импеданса — t для образцов

питьевой воды с использованием среды BiMedia 160 В.


5.6.2. Теперь данная калибровочная кривая записывается на диск (Disk) в виде калибровочного файла (Filename).

5.6.3. При необходимости вносится дополнительный комментарий (Comment) для детального описания калибровочного файла.

5.7. Если коэффициент корреляции r не превышает (-0,85), то необходимо более детально проанализировать полученную зависимость. Как правило, прослеживается общая тенденция: большинство точек находится вблизи калибровочной кривой, и имеются лишь отдельные «точки-выбросы», которые расположены вдали от калибровочной кривой (рис. 5.3). В этом случае необходимо «точки-выбросы» исключить. Это приведет к существенному повышению коэффициента корреляции r.


File: Text:

Threshold M: 5% Threshold E: 10 % In Use: M-Value

No Limits

Correlation: log (CFU) = -0.1088 * t + 2.4978 correlation factor: r = -0.7268

Dispersion: Syx = 0.4738


53 files used for correlation








Рис. 5.3. «Точки-выбросы», располагающиеся вдали от калибровочной кривой,

снижают коэффициент корреляции.


6. После создания калибровочного файла необходимо выбрать данный файл при задании пороговых значений (Thresholds) в главном меню программы «Бак Трак» для автоматического подсчета величины определяемого показателя.


^ 6. Питательные среды: назначение, приготовление, использование


Питательные среды, используемые в импедансной микробиологии, специально разработаны фирмой SY-LAB (Австрия)* для системы «Бак Трак». Селективность фирменных питательных сред позволяет определять микробиологические показатели качества питьевой воды систем централизованного водоснабжения в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.4.1074—01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

______________

* Питательные среды BiMedia 001 А и BiMedia 160 B выпускаются также Отделением питательных сред Государственного научного центра прикладной микробиологии (Московская область, г. Оболенск).


Эти среды обладают всеми свойствами, необходимыми для измерения импеданса:

• ровная базовая линия с небольшим или нулевым дрейфом или шумом в присутствии инокулюма:

• высокая начальная скорость изменения электрического сигнала, дающая резкий перегиб в точке определения;

• большая величина тотальных электрических изменений.

Для санитарно-микробиологического анализа питьевой воды используются следующие питательные среды:

• BiMedia 001 А - для определения общего числа микроорганизмов;

• BiMedia 160 В и 160 С - для определения колиформных бактерий;

• BiMedia 660 A - для определения сульфитредуцирующих клостридий.


6.7. Приготовление сред


6.1.1. BiMedia 001 А - для определения мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (общее число микроорганизмов) и BiMedia 160 B - для определения колиформных бактерий (общих и термотолерантных):

• растворить необходимое количество среды в дистиллированной воде (соотношение указано на упаковке),

• разделить приготовленную среду на порции и автоклавировать при 1 атм. 15 мин,

• после стерилизации среда должна уравновеситься при комнатной температуре в течение 6 ч.


Примечание. Приготовленная среда должна храниться при температуре 4 °С. Срок хранения - 3 недели. Изменение режима стерилизации (более продолжительное автоклавирование) снижает качество среды!


6.1.2. Приготовление среды BiMedia 660 A — для определения сульфитредуцирующих клостридий:

• растворить все содержимое упаковки в дистиллированной воде (конечный объем — 1, 2 или 5 л указан на этикетке);

• проверить рН среды и, если необходимо, довести до 7,1 ± 0,1;

• разлить приготовленную среду на порции и стерилизовать при 1 атм. 15 мин;

• дать среде уравновеситься в течение 12 ч при комнатной температуре перед использованием;

• внести по 9 мл среды в стерильные измерительные ячейки и поместить ячейки в штатив;

• прогреть измерительные ячейки (с приоткрытыми крышками) при 95—100 °С на пару в течение 15 мин (для удаления растворенного в среде кислорода);

• дать среде остыть до 50 °С (или меньше), затем можно добавлять аддитив;

• добавить во флакон с Аддитивом 660А 1,5 мл стерильной дистиллированной воды;

• добавить по 30 мкл раствора аддитива в каждую измерительную ячейку с 9 мл среды.

Для предотвращения образования воздушных пузырьков не погружайте наконечники пипетки в среду.


Примечание. Аддитив необходимо добавлять только непосредственно перед использованием среды. Хранить аддитив при 4° С.


Растворы аддитивов следует хранить не более 2 недель.

Приготовленная среда должна храниться при 4 °С не более 2 недель.

Длительное прогревание и обработка при температуре выше рекомендуемой снижают качество среды!


^ 7. Методика тестирования и обработки измерительных ячеек


7.1. Методика тестирования измерительных ячеек прибора «Бак Трак»


Необходимо каждые несколько месяцев проводить тестирование используемых измерительных ячеек для контроля регистрируемых показателей - изменения проводимости среды (М-параметр) и изменения проводимости электродов (Е-параметр).

Для этого необходимо:

1. В стерильные измерительные ячейки налить 10 мл или 100 мл стерильного физиологического раствора (в зависимости от объема ячеек).

2. Установить время исследования (Duration) - 24 ч.

3. Установить пороговое значение (Threshold) для М-параметра - 5 %.

4. Установить значение Time limit - 23 ч.

5. Начать измерение (Start measurement).

6. После того, как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная (Empty), поместить в инкубаторный блок измерительные ячейки с физиологическим раствором.

^ Учет результатов тестирования.

Если за время тестирования измерительных ячеек значения М-параметра не превысили 5 %, то ячейки пригодны для дальнейшей работы.

Если за время тестирования в ячейках значение М-параметра превысило 5%, то цвет ячейки на экране монитора изменится на красный, что означает «проба загрязнена» (Contaminated). В этом случае необходимо повторно тестировать такую ячейку, предварительно поместив ее в любое другое место в инкубаторном блоке. При повторном получении аналогичных результатов (пересечение 5% значения М-параметра) необходимо заменить измерительные