Реферат: Методические указания к лабораторным работам и вопросы для самостоятельной подготовки студентов 2-го курса эколого-биологического факультета



Государственное образовательное учреждение высшего

профессионального образования

ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ


Руководство к практическим занятиям

по биологической химии


Методические указания к лабораторным работам

и вопросы для самостоятельной подготовки

студентов 2-го курса эколого-биологического факультета


Петрозаводск

Издательство ПетрГУ

2007

Рассмотрены и утверждены к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и техники «биология» 11 сертября 2007 г.


Печатаются по решению

редакционно-издательского совета

Петрозаводского государственного университета


Составители

^ М. Н. Яковлева, канд. биол. наук;

В. В. Осташкова, канд. биол. наук;

Я. П. Нижник, канд. хим. наук


ПРЕДИСЛОВИЕ

Настоящие методические указания содержат лабораторные работы по биологической химии, выполняемые студентами 2-го курса эколого-биологического факультета в процессе изучения предмета. На лабораторных занятиях студенты овладевают методами эксперимен-тальных исследований, закрепляют теоретические знания, анализиру-ют полученные на практических занятиях результаты. В каждой лабораторной работе излагаются цель и задачи, поставленные перед студентом, принцип используемого метода, ход работы, предлагается проанализировать результаты проведенных исследований и сделать выводы. Вопросы, представленные в конце каждого раздела, способствуют лучшему усвоению теоретического материала при самоподготовке.

РАЗДЕЛ 1

^ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ


РАБОТА 1. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВЕЩЕСТВ В РАСТВОРАХ. ПРИНЦИП И ТЕХНИКА КОЛОРИМЕТРИРОВАНИЯ. УСТРОЙСТВО И ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2


^ Цель работы: ознакомиться с одним из наиболее распространенных в биохимии методов количественного определения веществ в исследуемом растворе.

Задачи:

ознакомиться с основными принципами и правилами работы на КФК-2;

измерить оптическую плотность двух окрашенных растворов;

подобрать наиболее оптимальную длину волны и размер кюветы для определения оптической плотности предложенных растворов.


Фотометрия – метод количественного анализа, основанный на определении концентрации вещества по спектру поглощения, испускания или флуоресценции.

В зависимости от характера возникающих изменений выделяется несколько видов фотометрии (колориметрия, нефелометрия, турбидиметрия, флуориметрия, рефрактометрия, поляриметрия и др.). Фотометрические методы анализа характеризуются высокой чувствительностью, достигающей 10-4-10-6% определяемого элемента в твердых образцах и 10-5-10-7% – в водных растворах. Колориметрический метод получил самое широкое распространение среди биохимических методов количественного определения веществ в биологических объектах.

^ Принцип метода. В основе этого метода лежит закон Бугера –Ламберта – Бера (1852), согласно которому существует прямо пропорциональная зависимость между концентрацией вещества в окрашенном растворе и степенью поглощения лучей света данным раствором. Интенсивность поглощения света зависит не только от количества и природы растворенного вещества, но и от толщины слоя раствора, длины волны падающего света, температуры раствора.

Степень поглощения света окрашенным раствором выражается оптической плотностью (экстинкцией), под которой понимают логарифм отношения интенсивности света, падающего на раствор, к интенсивности света, прошедшего через раствор. Величина оптической плотности обозначается буквой Е или D. Чем больше оптическая плотность, тем меньше света пропускает раствор. Для определения оптической плотности или светопропускания используют фотоэлектроколориметры.


^ 1.Устройство фотоэлектроколориметра КФК-2

Колориметр фотоэлектрический концентрационный (КФК-2) предназначен для количественного определения веществ в окрашенных растворах по их оптической плотности или коэффициенту светопропускания в диапазоне волн 315-980 нм. КФК-2 состоит из оптического блока (передняя часть прибора), где находятся осветитель, светофильтр, оптика, кюветное отделение, фотометрическое устройство и регистрирующий прибор, и блока питания (задняя часть), где расположены стабилизатор напряжения с выпрямителем и силовой трансформатор.

Источником света в колориметре служит галогенная лампа. Приемниками излучения являются фотоэлемент Ф-26 для работы в диапазоне волн 315-540 нм и фотодиод ФД-24К для работы в специальном диапазоне 590-980 нм.

Световой поток лампы с помощью специальных устройств конденсируется, усиливается и проходит через светофильтр, кювету с исследуемым раствором и падает на приемник излучения. При этом световое излучение преобразуется в электрические сигналы, которые подаются на измерительный прибор. Показания микроамперметра пропорциональны световому потоку, проходящему через исследуемый раствор.


^ Выбор светофильтра

При проведении фотоэлектроколориметрии следует учитывать, что в данном методе используется монохроматический свет различных длин волн. Для преобразования полихроматического света в монохроматический используются светофильтры. В КФК-2 имеется набор из 11 светофильтров. Использование конкретного светофильтра позволяет пропускать через раствор лучи определенной длины, поглощение которых наиболее характерно для исследуемого вещества. Обычно эффективная длина волны и цвет светофильтра указаны в применяемом методе. Если же такой ссылки нет, то выбрать нужный светофильтр можно с помощью таблицы:


Окраска исследуемого раствора

Цвет нужного светофильтра

Длина волны пропускаемого света, нм

Желтая

синий

420 – 450

Оранжевая

синий

430 – 460

Красная

зеленый

460 – 500

Пурпурная

зеленый

490 – 530

Синяя

оранжевый

590

Сине-зеленая

красный

600 – 650

Голубая

красный

750

Сине-фиолетовая

красный

750


Примечание. Некоторые растворы одинакового цвета могут избирательно поглощать лучи с различной длиной волны. Поэтому при подборе светофильтра желательно знать спектр поглощения исследуемого вещества, причем выбор его осуществляют таким образом, чтобы он пропускал лучи с длиной волны, максимально поглощаемой исследуемым раствором. Таким образом, при выборе светофильтра оптимальной длиной волны окажется та, при прохождении которой через исследуемый раствор оптическая плотность будет максимальной.


^ 3. Подбор кювет

Известно, что чем толще слой жидкости, через который проходит луч света, тем больше поглощение светового пучка и тем выше показание оптической плотности исследуемого раствора. К колориметру прилагается набор кювет, отличающихся расстоянием между рабочими гранями, через которые проходит световой поток. Это расстояние (в мм) указано на одной из рабочих граней. На боковой стенке кювет имеется метка, до которой необходимо наливать жидкость. При работе с летучими растворами кюветы закрывают специальными крышками.

К каждому прибору прилагается набор кювет с толщиной слоя исследуемого раствора от 1 до 50 мм. Подбор кювет осуществляется таким образом, чтобы оптическая плотность исследуемого раствора не была ниже величины 0,15 и выше 0,7. Именно в этих пределах наиболее точно выполняется закон Бугера – Ламберта – Бера. Следовательно, при интенсивной окраске раствора необходимо взять кюветы с меньшим расстоянием между рабочими гранями, а при слабой окраске – с бóльшим расстоянием.


^ 4. Общая схема прибора и обозначения





1  Рукоятка установки светофильтра (около рукоятки маркировка по длине волны).

2 – Ручка перемещения кювет в кюветном отделении.

3 – Ручка включения чувствительности фотоприемников (обозначена цифрами 1, 2 и 3 черного цвета при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм и красного цвета – в диапазоне от 590 до 980 нм).

4 – Микроамперметр (по верхней шкале измеряют коэффициент светопропускания (от 0 до 100%), а по нижней – оптическую плотность раствора (от 0 до 1,5).

5 – Ручка «грубой» настройки микроамперметра.

6 – Установка «точной» настройки микроамперметра.

7 – Крышка кюветного отделения.


5. Правила работы на КФК-2


I. Подготовка прибора к работе

Установить нужный светофильтр (рукояткой 1).

Рукоятку 3 (чувствительность фотоэлемента) установить на цифру 1 соответствующего цвета: при работе в диапазоне волн от 315 до 540 нм чувствительность обозначена цифрами черного цвета и в диапазоне от 590 до 980 нм – красного цвета.

Проверить, выключен ли микроамперметр (рукоятки 5 и 6 должны быть повернуты до отказа влево).

Прибор включить (вилку в сеть; тумблер, расположенный на задней стенке в нижнем левом углу, переключить в положение «вкл»). При этом загорается лампочка накаливания.

Прибор прогреть в течение 15-20 минут.


^ II. Измерение оптической плотности раствора

Кювету с контролем или растворителем поставить в дальнее (от исследователя) гнездо кюветодержателя; кювету с исследуемым раствором (опытом) – в ближнее гнездо кюветодержателя.

Кювету с контролем (или растворителем) поместить в световой поток поворотом ручки 2 до отказа влево.

Закрыть крышку кюветного отделения (7).

Установить стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале поворотом ручки 5 («грубой» настройки). В случае необходимости воспользоваться ручкой 6 («точной» настройки).

Примечание. Если не удается вывести стрелку микроамперметра на 0, то необходимо повысить чувствительность фотоэлемента. Для этого необходимо:

а) микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево);

б) рукоятку переключения чувствительности фотоэлемента (3) поставить на цифру 2 соответствующего цвета;

в) вывести стрелку микроамперметра на 0 по нижней шкале (то есть повторить действия, указанные в пункте 4).

Если и в этом случае стрелка микроамперметра не выводится на 0, необходимо еще раз повысить чувствительность фотоэлемента, повторяя все действия, перечисленные в пунктах «а», «б» и «в», но установив рукоятку 3 на цифру 3 соответствующего цвета.

5. Заменить в световом потоке кювету с контролем на кювету с исследуемым раствором (опытом), поворачивая рукоятку 2 до отказа вправо.

Записать величину оптической плотности исследуемого раствора по нижней шкале микроамперметра.

Микроамперметр выключить (рукоятки 5 и 6 до отказа влево).



III. Завершение работы на приборе

Реактивы из кювет вылить.

Кюветы сполоснуть дистиллированной водой и поставить в чашку Петри вверх донышком (кюветы необходимо полоскать только после полного завершения работы или методики, в промежутках между отдельными измерениями этого делать не следует!).

Прибор выключить (тумблер, расположенный на задней стенке в левом углу, переключить в положение «выкл.»; вилку вынуть из розетки).

Крышку кюветного отделения закрыть.


Примечание. При работе на КФК-2 необходимо соблюдать следующие правила:

До включения прибора в сеть проверить заземление.

Не оставлять прибор включенным без надобности.

Следить за чистотой прибора, не проливать реактивы.

Не хлопать крышкой кюветного отделения.

Особенно осторожно обращаться с кюветами – не царапать, протирать только мягкой и чистой тряпочкой (марлей).

При смене светофильтра работу продолжать не ранее чем через 5 минут.

При переключении светофильтров и замене кювет в кюветодержателе микроамперметр должен быть выклю-чен (рукоятки 5 и 6 должны находиться в крайнем левом положении!).



^ 6. Определение концентрации вещества в растворе

по оптической плотности

Определение концентрации вещества в окрашенном растворе по оптической плотности можно осуществить двумя способами – путем сравнения с оптической плотностью стандартного раствора (такой способ используется, например, в ортотолуидиновом методе определения глюкозы в крови) или, более точно, в результате построения калибровочной кривой по стандартному раствору. В этом случае из стандартного раствора готовят серию рабочих растворов с известной концентрацией исследуемого вещества, проделывают с ними необходимые химические реакции и измеряют на ФЭКе оптическую плотность. Полученные результаты отражают графически, откладывая по оси абсцисс концентрацию вещества, а по оси ординат – соответствующую ей оптическую плотность. Определив оптическую плотность исследуемого раствора, находят содержание в нем вещества по калибровочной кривой.


^ Результаты проведенных исследований оформляют в виде таблицы:


Окраска раствора

Длина волны (нм)

Цвет светофильтра

Размер кюветы (мм)

Оптическая плотность (Е)
































Выводы:
^


РАЗДЕЛ 2 состав И СВОЙСТВА БЕЛКОВ


2. 1. АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ

Анализ аминокислотного состава белков можно осуществлять несколькими способами. Присутствие тех или иных аминокислот может быть выявлено с помощью цветных реакций на белок, а также в результате кислотного его гидролиза и последующего разделения полученной смеси аминокислот методом хроматографии.


^ РАБОТА 2. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

Цель работы: ознакомиться с основными наиболее распространенными цветными реакциями на белки и доказать, что с их помощью можно выявить сходство и различия в аминокислотном составе исследуемых белков (на примере яичного альбумина и желатина).

Задачи:

провести цветные реакции на белки с раствором яичного альбумина и желатина;

показать, что существуют универсальные цветные реакции, которые дают все белки, независимо от их аминокислотного состава, и специфические цветные реакции на определенные аминокислоты, позволяющие выявить различия в исследуемых белках;

сравнить результаты проведенных исследований и сделать выводы;

отметить, какие из проведенных реакций являются универсальными, а какие – специфическими.


Цветные реакции на белки являются качественными реакциями, обусловленными специфическими группами – радикалами. Некоторые из таких реакций широко используются в биохимической практике для изучения структуры и аминокислотного состава белков, их количественного определения.


^ 1. Биуретовая реакция (на обнаружение

пептидных связей в белках)

Принцип метода. Белки (пептиды) в щелочном растворе в присутствии солей меди (II) образуют комплексные ее соединения, окрашенные в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет.

Для пептидной (амидной) группы характерна лактам-лактимная таутомерия:





В щелочной среде преобладающая лактимная (енольная) форма полипептида взаимодействует с гидроксидом меди(II) с образованием стабильного окрашенного комплекса:





^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка (желатина, яичного белка или сывороточного албумина) добавляют 1 мл 10%-го раствора щелочи (NaOH или KOH) и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. Появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание.


^ 2. Нингидриновая реакция (на аминогруппу,

находящуюся в -положении)

Принцип метода. Белки, полипептиды и свободные -амино-кислоты при нагревании реагируют с нингидрином (трикето-гидринден-гидратом) с образованием продукта конденсации, окрашенного в фиолетовый цвет:



^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка прибавляют 0,5 мл 0,5%-го раствора нингидрина и нагревают до кипения. Появляется фиолетово-синее окрашивание.

Проделывают эту реакцию с раствором аминокислоты, взяв вместо раствора белка 1%-й раствор глицина. Сравнить полученные результаты и сделать вывод.


^ 3. Реакция Сакагучи (на аргинин)

Принцип метода. Белки, содержащие аргинин, в присутствии щелочи дают красное окрашивание с гипобромитом и -нафтолом. Гуанидиновая группа аргинина окисляется гипобромитом, и окисленный аргинин при взаимодействии с -нафтолом образует продукт конденсации красного цвета:




^ Ход работы. К 0,5 мл 1%-го раствора белка (яичного белка, желатина) добавляют 0,5 мл 10%-го раствора щелочи, 3 капли 0,1%-го спиртового раствора -нафтола и после перемешивания – 2-3 капли 2%-го раствора гипобромита натрия. Появляется красное окрашивание.


4. Реакция Фоля (на цистеин и цистин)

^ Принцип метода. При кипячении белка со щелочью от цистеина (цистина) легко отщепляется сера в виде сероводорода, который в щелочной среде образует сульфид натрия:





Для выявления сульфида натрия используют ацетат свинца, который при взаимодействии с гидроксидом натрия превращается в тетрагидроксоплюмбат натрия:

Pb(CH3COO)2 + 4NaOH  Na2[Pb(OH)4]+ 2CH3COONa.

В результате взаимодействия ионов серы и свинца образуется сульфид свинца черного или бурого цвета:

Na2S + Na2[Pb(OH)4]  PbS + 4NaOH.

^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора яичного белка или кусочку шерстяной нити добавляют 1 мл 30%-й щелочи и 3-4 капли 5%-го раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость окрашивается в бурый или черный цвет.

Реакцию Фоля проделывают с 1%-м раствором желатина, сравнивают полученные результаты и делают вывод.


^ 5. Ксантопротеиновая реакция

(на ароматические аминокислоты)

Принцип метода. При нагревании с концентрированной азотной кислотой белки дают желтое окрашивание. Реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот, имеющих желтую окраску:





Нитропроизводные аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет:




^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора альбумина или яичного белка добавляют 5 капель концентрированной азотной кислоты. Появляется осадок. При осторожном нагревании смесь окрашивается в желтый цвет. После охлаждения осторожно добавляют 10 капель концентрированного раствора аммиака (или 30%-й раствор едкого натра), при этом желтая окраска переходит в оранжевую.

Проделывают эту реакцию с 1%-м раствором желатина и 0,1%-м раствором тирозина, сравнивают результаты и делают выводы.


6. Реакция Милона (на тирозин)

^ Принцип метода. Реакция Милона открывает в белке тирозин, в составе которого имеется фенольный гидроксил. При нагревании белка с реактивом Милона (смесь нитратов и нитритов ртути (I) и (II), растворенных в концентрированной азотной кислоте) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в красный цвет. Реактив Милона дает окрашивание почти со всеми фенолами:





^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора яичного белка добавляют 3-5 капель реактива Милона и осторожно нагревают до образования окрашенного в красный цвет осадка.

Аналогично проделывают реакцию с растворами желатина, тирозина и фенола. Полученные результаты сравнивают и делают вывод.

7. Реакция Адамкевича (на триптофан)

^ Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами (глиоксиловой кислотой) с образованием окрашенных продуктов конденсации:




Глиоксиловая кислота всегда присутствует в небольшом количестве в ледяной уксусной кислоте, которую используют в реакции Адамкевича.

^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка добавляют 1 мл ледяной (концентрированной) уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения осадка. После охлаждения к смеси осторожно добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты (по каплям, по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешались). Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.

Проделывают реакцию Адамкевича с 0,1%-м раствором триптофна, сравнивают полученные результаты и делают вывод.


8. Реакция Ваузене (на триптофан)

^ Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, дают в кислой среде в присутствии нитрита натрия и формальдегида сине-фиолетовое окрашивание. В этой реакции триптофан взаимодействует с формальдегидом с образованием продукта конденсации (бис-2-трип-тофанилметана), который окисляется нитритом натрия до бис-2-трип-тофанилкарбинола, который в присутствии минеральных кислот образует соли сине-фиолетового цвета.




^ Ход работы. К 2 мл 1%-го раствора яичного белка добавляют 1 каплю 2,5%-го раствора формальдегида. К полученной смеси, тщательно перемешивая, добавляют осторожно, по каплям 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом. Через 10 минут добавляют, перемешивая, 10 капель 0,5%-го раствора нитрита натрия. Появляется сине-фиолетовая окраска.


9. Реакция Паули (на гистидин и тирозин)

^ Принцип метода. Реакция Паули позволяет обнаружить в белке аминокислоты гистидин и тирозин, которые образуют с диазобензолсульфокислотой соединения вишнево-красного цвета. Диазобензолсульфокислота образуется в реакции диазотирования при взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия (или калия) в кислой среде:







^ Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора сульфаниловой кислоты (готовится на 5%-м растворе соляной кислоты) прибавляют 2 мл 0,5%-го раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл 1%-го раствора яичного белка и после перемешивания 6 мл 10%-го раствора карбоната натрия. После перемешивания смесь окрашивается в вишнево-красный цвет.

Проделывают эту реакцию с 0,1%-м раствором гистидина, сравнивают полученные результаты и делают вывод.


^ Общие выводы по работе:


^ Техника безопасности
Категорически запрещается отмеривать концентрированные кислоты и щелочи обыкновенными пипетками – для отмеривания реактивов использовать мерные пробирки.

Будьте внимательны при наливании концентрированных кислот и щелочей.

В процессе нагревания постоянно перемешивайте жидкость, не допускайте выброса ее из пробирки.

Соблюдайте правила пожарной безопасности.



^ РАБОТА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ИЗ ТКАНЕЙ

И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА протеинов

Цель работы: ознакомиться с основными этапами изучения состава простых и сложных белков (гомогенизация биомате-риала, экстракция белков, гидролиз и разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматогра-фии.

Задачи:

выделить белки из мышечной ткани и яичного альбумина;

провести кислотный гидролиз яичного альбумина;

разделить предложенную смесь аминокислот методом распредели-тельной хроматографии, определить, какие аминокислоты входят в ее состав.


1. Основные этапы изучения состава протеинов

Первый этап. Выделение белков из биоматериала

а) Выделение белков из мышечной ткани

Принцип метода. Миофибриллы мышечной клетки содержат сократительные белки (миозин и актин) и регуляторные белки (тропомиозин и тропонин). Белки миофибрилл не растворяются в воде, но их можно экстрагировать из мышечной ткани солевыми растворами с концентрацией соли 0,5 моль/л. Многие белки саркоплазмы (гиалоплазмы мышечных клеток) растворимы в воде или солевых растворах низкой концентрации (0,05 моль/л). При экстракции мышечной ткани 5%-м раствором хлорида калия извлекаются как миофибриллярные, так и саркоплазматические белки.

^ Ход работы

1. Взвешивают 2 г мышечной ткани. Измельченную ножницами навеску помещают в фарфоровую ступку, добавляют 2 мл 5%-го раствора хлорида калия и растирают со стеклянным песком до гомогенного состояния. К гомогенату добавляют 3 мл раствора хлорида калия и растирают кашицу в течение 5 минут, после чего прибавляют еще 5 мл 5%-го раствора хлорида калия и продолжают растирание в течение 5 минут.

2. Полученный гомогенат фильтруют через два слоя марли или центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин.

3. С фильтратом (или центрифугатом) проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, ксантопротеиновую, реакции Милона, Фоля и Сакагучи).


б) Выделение яичного альбумина

Принцип метода. Яичный белок представляет собой смесь нескольких белков. Примерно 70% яичного белка составляет альбумин, который легко отделяется от глобулинов. При десятикратном разведении яичного белка дистиллированной водой глобулины выпадают в осадок, а альбумин остается в растворе.

^ Ход работы

1. Чтобы отделить белок от желтка, осторожно проделывают отверстия в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан емкостью 500 мл, затем в стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

2. Раствор переносят в мерный цилиндр и объем доводят дистиллированной водой до 300 мл. Раствор оставляют на 30 минут при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов.

Примечание: работу, описанную в пунктах 1 и 2, выполняет и демонстрирует дежурный студент, приготовленную суспензию затем использует каждый студент в группе.

20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.

С фильтратом, содержащим яичный альбумин, проделывают цветные реакции на белки (биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, реакции Милона, Фоля).


^ Второй этап. Кислотный гидролиз белков

Принцип метода. В процессе гидролиза белков происходит разрыв пептидных связей и молекула белка поэтапно распадается на высокомолекулярные полипептиды, более простые пептиды и, наконец, на аминокислоты. Кислотный гидролиз белков проводят в присутствии соляной или серной кислот при кипячении.

Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом изучения первичной структуры белка. В организме гидролиз постоянно протекает в процессе пищеварения и в тканях под действием протеолитических ферментов.

^ Ход работы. В небольшую колбочку, снабженную обратным холодильником, наливают 2-3 мл 2%-го раствора альбумина и 15-20 мл 25%-го раствора серной кислоты. Содержимое колбы кипятят под тягой в течение 60-90 минут. Через каждые полчаса (с момента закипания) с гидролизатом проделывают биуретовую реакцию, для этого к 0,5 мл гидролизата добавляют 30%-й раствор щелочи до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге и 1-2 капли 1%-го раствора сульфата меди. Отрицательная биуретовая реакция указывает на полное расщепление белка до аминокислот.

Для сравнения биуретовую реакцию делают с 2%-м раствором альбумина.

^ Вывод (написать уравнение гидролиза белков):


Третий этап. Разделение смеси аминокислот методом

распределительной хроматографии на бумаге

Принцип метода. Метод основан на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях: воде и органическом растворителе. Водная фаза неподвижна, так как вода сорбирована на инертном носителе  целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20-22% воды. Подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислот в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота на бумаге.

Положение аминокислот на бумаге можно определить с помощью нингидриновой реакции: в присутствии нингидрина отдельные аминокислоты выявляются в виде окрашенных пятен.

Показателем скорости движения аминокислоты является коэффициент распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (точка старта) до середины ее пятна (а) к расстоянию от точки старта до фронта растворителя (в): Rf = а/в. Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой амино-кислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и др.).

Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем сравнения Rf разделяемых и известных аминокислот (стандартов).

Существуют различные способы хроматографического разделения смеси аминокислот на бумаге.
^ Радиальная (круговая) хроматография
Для разделения смеси аминокислот используется растворитель, состоящий из смеси н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5. Приготовленная смесь встряхивается в делительной воронке в течение 5 минут, а затем отстаивается 7-10 часов, после чего нижний слой используется для насыщения хроматографической камеры парами, а верхний  для разделения аминокислот. Хроматографической камерой служит эксикатор.

^ Ход работы

Хроматографическую бумагу вырезают в форме диска, диаметр которого соответствует внутреннему диаметру эксикатора. В центр диска (на точку старта) наносят микропипеткой в несколько приемов 0,005-0,01 мл исследуемой смеси аминокислот. Нанесение смеси следует проводить очень аккуратно, слегка касаясь микропипеткой стартовой точки, чтобы диаметр мокрого пятна был не более 5 мм. После каждого нанесения пятно подсушивают над электроплиткой или в термостате.

В центре хроматограмм делают иглой отверстие, в которое пропускают фитилек из сложенной вчетверо х/б нити. Хроматограмму помещают в эксикатор, на дно которого предварительно наливают верхний слой растворителя. Проверяют положение фитилька и хроматограммы: конец фитилька должен быть погружен в растворитель, а края хроматограммы должны находиться на выступах эксикатора. Закрывают эксикатор крышкой.

Растворитель поднимается вверх по фитильку, а затем радиально распространяется по бумаге от центра. Когда растворитель достигнет края бумаги, ее вынимают из эксикатора, высушивают под тягой, обрабатывают 0,5%-м раствором нингидрина (готовится на ацетоне или спирте) и помещают в сушильный шкаф при 60-70 оС на 10-15 минут. На хроматограмме появляются сине-фиолетовые пятна, каждое из которых соответствует отдельной аминокислоте.
^ Нисходящая хроматография
В качестве хроматографической камеры используют высокие стеклянные банки с выступом в верхней части. На выступ в строго горизонтальном положении ставят лодочку – специальный стеклянный сосуд для растворителя.


^ Ход работы

Из хроматографической бумаги вырезают полоску шириной 5 см и длиной, примерно соответствующей высоте камеры. На расстоянии 10 см от конца полоски проводят простым карандашом стартовую линию, в середине которой отмечают точку старта. На стартовую точку микропипеткой наносят 0,005-0,01 мл смеси аминокислот (в несколько приемов, диаметр мокрого пятна не более 5 мм), периодически просушивая бумагу над электрической плиткой (или над настольной лампой).

На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество нижнего слоя растворителя, а в установленную лодочку – верхний слой растворителя. Хроматограмму с нанесенной смесью аминокислот помещают в камеру так, чтобы ближний к старту конец был опущен в лодочку и зафиксирован в ней предметным стеклом, а другой висел вертикально, не касаясь стенок камеры. Камеру закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов.

Растворитель продвигается по хроматограмме сверху вниз, и когда фронт его приблизится к нижнему краю бумаги, хроматограмму вынимают из камеры и высушивают под тягой. Затем ее обрабатывают 0,5%-м раствором нингидрина и помещают в сушильный шкаф при 60-70 оС на 10-15 минут для развития окраски, после чего на ней появляются пятна сине-фиолетового или лилового цвета, соответ-ствующие аминокислотам.

Результаты:


Выводы:


2.2. изучение некоторых свойств белков


^ РАБОТА 4. РАСТВОРИМОСТЬ И РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Цель работы: изучение важного свойства белков  способности к растворению и реакциям осаждения.

Задачи:

выделить основные две фракции из яичного белка и доказать, что альбумин, входящий в его состав, хорошо растворяется в дистил-лированной воде, а глобулин  в растворе солей;

провести предложенные реакции необратимого осаждения белков;

с помощью реакций высаливания разделить белки плазмы крови на основные фракции (фибриноген, альбумины и глобулины);

доказать, что высаливание  обратимый процесс, при котором сохраняются свойства нативного белка, а денатурация  необратимый;

проанализировать полученные результаты и сделать выводы.


1. Растворимость белков

Многие белки растворяются в воде, что обусловлено наличием на поверхности белковой молекулы свободных гидрофильных групп. Растворимость белка в воде зависит от структуры белка, реакции среды, присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются белки, для которых характерны кислотные свойства, а в щелочной  белки, обладающие основными свойствами. Альбумины хорошо растворяются в дистиллированной воде, а глобулины растворимы в воде только в присутствии электролитов. Не растворяются в воде белки опорных тканей (коллаген, кератин, эластин и др.).

^ Ход работы

1. К 2 каплям неразведенного яичного белка прибавляют 1 мл дистиллированной воды и перемешивают. При этом яичный альбумин растворяется, а яичный глобулин выпадает в виде небольшого осадка.

2. К 2 каплям яичного белка прибавляют 1 мл 5%-го раствора хлорида калия. В слабом солевом растворе растворяются как альбумины, так и глобулины.

3. Проверяют растворимость в воде и 5%-м растворе хлористого калия белка кератина, содержащегося в шерсти и волосах.


^ 2. Реакции осаждения белков

Реакции осаждения белков могут быть необратимыми и обратимыми.

А. Необратимое осаждение белков (денатурация)

Принцип метода. Необратимые реакции осаждения приводят к денатурации белков, при этом разрушается пространственная структура молекулы и белки утрачивают свои естественные биоло-гические и физико-химические свойства. Денатурацию белков можно вызвать физическими воздействиями (кипячение, замораживание, высокое давление, вибрация, радиоактивное излучение и др.) и химическими осадителями.


^ 1. Осаждение белков неорганическими осадителями

Осаждение беков минеральными кислотами

Ход работы. В пробирку осторожно наливают около 1 мл концент-рированной азотной кислоты. Затем, наклонив пробирку, медленно по стенке добавляют 1 мл 1%-го раствора белка. На границе двух жидкос-тей появляется осадок в виде белого кольца.

Такую же реакцию проделывают с концентрированной соляной и серной кислотами.
^ Осаждение белков солями тяжелых металлов
Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл 1%-го раствора белка и добавляют по 3-4 капли: в первую пробирку  7%-го раствора сульфата меди, во вторую  5%-го раствора ацетата свинца, в третью  5%-го раствора серебра. Во всех пробирках образуется осадок.
^ 2. Осаждение белков органическими осадителями Осаждение белка органическими кислотами
Ход работы. В 2 пробирки наливают по 2 мл 1%-го раствора белка и добавляют: в одну пробирку 4-5 капель 10%-го раствора сульфоса-лициловой кислоты, в другую  5-10 капель 10%-й трихлоруксусной кислоты (CCl3COOH). Выпадает осадок белка.
^ Осаждение белка органическими растворителями
Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора белка добавляют 2 мл органического растворителя (96%-го этанола, хлороформа, ацетона или эфира) и перемешивают. Образование осадка можно усилить добавлением нескольких капель насыщенного раствора хлорида натрия.
^ Осаждение белков реактивами на алкалоиды
Ход работы. В три пробирки наливают по 1 мл 1%-го раствора белка, по 4-5 капель 1%-го раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую пробирку  10%-го раствора пикриновой кислоты, во вторую  насыщенного раствора танина, в третью  5%-го раствора железисто-синеродистого калия. Наблюдают выпадение осадка.
3. Осаждение белков при нагревании
^ Ход работы. В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1%-го раствора яичного белка.
еще рефераты
Еще работы по разное
© РОНЛ.орг 2000-2026 По всем вопросам обращаться на эту почту: admin@ronl.org