Реферат: Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов №

Источник: ИС ПАРАГРАФ, 10.01.2011 13:09:22


Утверждаю

Главный государственный санитарный врач

Республики Казахстан Е. Е. Дурумбетов

2 июля 1997 г.

 

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ

№ 3.05.039.97*

 

Настоящие методические указания распространяются на воду водоемов, используемых или намечаемых к использованию в качестве централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения или для рекреационных целей, и устанавливают методы санитарно-микробиологического анализа воды.

Методические указания являются обязательными при исследовании качества воды поверхностных водных объектов в соответствии с ГОСТ «Охрана природы. Гидросфера. Правила выбора и оценка качества воды источников централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения» и ГОСТ 17.1.5.02-80 «Охрана природы. Гидросфера. Гигиенические требования к зонам рекреации водных объектов».

Санитарно-микробиологический анализ воды подземных источников производят в соответствии с санитарными правилами «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа».

При выборе нового поверхностного источника централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения или места рекреации санитарно-микробиологический анализ осуществляется учреждениями санэпидслужбы, а также другими организациями, которым санэпидслужба предоставляет право проведения санитарно-микробиологических анализов по показателям, установленным ГОСТ: основной показатель лактозоположительные кишечные парочки, дополнительные показатели - сапрофитные микроорганизмы, Е.соli, энтерококки, фаги кишечных палочек, сальмонеллы, шигеллы, кишечные вирусы.

При лабораторно-производственном контроле; качества воды эксплуатируемых источников водоснабжения санитарно-микробиологический анализ осуществляется производственными лабораториями и может быть ограничен определением двух показателей: числа сапрофитных микроорганизмов (температура инкубации 370С) и лактозоположительных кишечных палочек.

При текущем контроле качества воды в местах рекреации санитарно - микробиологический анализ ограничивается определением числа лактозоположительных кишечных палочек.

 

____________

^ Настоящий документ составлен на основе нормативных актов бывшего СССР, а также законов РК: «Об охране здоровья народа Республики Казахстан», «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения Республики Казахстан» и Положения о Государственной санитарно-эпидемиологической службе Республики Казахстан. Подготовлен Казахским государственным медицинским университетом (проф. Неменко В. А., доц. Биржанов М. К., доц. Зоточкина Э. Г.), Республиканской санэпидстанцией (Снигирева М. С., Пожелаев В. И.), Алматинским областным санэпидуправлением (Харитонова Н.А.).

Предназначен для органов государственной исполнительной власти и местного самоуправления, предприятий, организаций, учреждений, других лиц, организаций, осуществляющих государственный и ведомственный санэпиднадзор, а также студентов санитарно-гигиенических факультетов высших учебных заведений.

На водном объекте, эксплуатируемом в качестве источника водоснабжения или для рекреации, в случаях превышения установленных в соответствующих ГОСТ нормативов по коли-индексу для решения вопроса о проведении гигиенических и других мероприятий проводят дополнительные исследования:

- при неблагоприятной санитарной и эпидемической ситуации определяют патогенные микроорганизмы (сальмонеллы, шигеллы, кишечные вирусы, а в местах массового купания также и стафилококки);

- при необходимости уточнить источник и характер микробного загрязнения определяют Е.соli, энтерококки, фаги кишечных палочек.

Дополнительные исследования воды осуществляются органами санитарно-эпидемиологической службы.

 

^ 1. ОТБОР, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ ПРОБ ВОДЫ

 

1.1. Отбор проб воды осуществляется санитарным врачом, его помощником или специально инструктированным по методике отбора проб лицом под его личную ответственность.

1.2. Поверхностные пробы отбирают с глубины 10-15 см от поверхности воды или от нижней кромки льда. В случаях необходимости отбора проб на разных глубинах придонные пробы отбирают в 30-50 см от дна. В местах купания отбирают поверхностный слой воды, не заглубляя горлышко бутылки. Отбор проб следует производить с использованием различных плавсредств, мостов, помостов и т. п. в местах, где глубина водоема не менее 0,5 м. Недопустимо производить отбор проб с берега.

1.3. Пробу воды отбирают с соблюдением правил стерильности: в стерильную посуду, стерильными батометрами, руки перед отбором проб должны быть обеззаражены. При отборе одним батометром нескольких проб его каждый раз стерилизуют фламбированием. Из одной точки в первую очередь отбирают пробы для микробиологических исследований, а затем для других целей. Проруби делают, избегая внесения загрязнения со льда и инструментов. Посуду открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и горлышко не должны чего - либо касаться. Ополаскивать посулу не следует.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность (корковой, резиновой, ватной, обернутой фольгой и т.п.) и стерильным колпачком.

1.4. Объем пробы зависит от того, какие микроорганизмы должны быть определены:

- при анализе воды на индикаторные микроорганизмы - 500 мл;

- при анализе воды на индикаторные и патогенные бактерии (сальмонеллы, шигеллы) - 2500 мл;

- при анализе воды на индикаторные, патогенные бактерии и кишечные вирусы - 5500 мл.

 

^ 2. АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, РЕАКТИВЫ,

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

 

2.1. Аппаратура, лабораторная посуда, материалы и реактивы по ГОСТ 18963-73.

2.2. Реактивы для дополнительных методов исследования.

Агар-агар в волокнах или порошке по ГОСТ 17206-71.

Антибиотики: левомицетин (хлорамфеникол), полимиксин М6, синтомицин, фурациллин.

Висмут - сульфит агар сухой ТУ 42. 14. 127.-78.

N, N' - диметил-пара-фенилендиамин солянокислый и другие фенилендиаминовые соединения ТУ 6-09-1828-72.

Желчь сгущенная и сухая для технических целей ОСТ 49-11-70.

Желчь крупного рогатого скота свежая или сухая обезвоженная.

Индикаторы: бриллиантовый зеленый ТУ 6-09-4278-76.

Калий теллуристокислый ТУ 6-09-2060-77.

Кислота ортофосфорная ТУ 6-09-4229-76.

Магний хлористый б-водный по ГОСТ 4209-77.

Метиленовый синий.

Молоко.

Натрия азид.

Натрий двууглекислый по ГОСТ 2156-76.

Натрий кислый селенистокислый ТУ 6-09-1965-77.

Натрий углекислый по ГОСТ 4332-76.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 4172-76.

Натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245-76.

Перекись водорода по ГОСТ 10929-76.

Пара-диметиламинобензальдегид ТУ 6-09-3272-77.

Сусло охмеленное.

Сыворотки агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные

О-сыворотки группы авсде (сухие) и редких групп.

Сыворотки О и Н сальмонеллезные агглютинирующие адсорбированные (сухие).

Сыворотки агглютинирующие адсорбированные поливалентные к шигеллам.

2, -3, -5- трифенилтетразолий хлорид ТУ 6-09-3838-78.

Ферментативный гидролизат казеина неглубокой степени расщепления ТУ 42.14.528-73.

Яйца куриные.

 

Примечание: Допустимая погрешность взвешивания 0,1%.

 

2.3. Подготовку посуды и материалов и их стерилизацию осуществляют в соответствии с ГОСТ 18963-73.

2.4. Приготовление питательных сред и реактивов.

2.4.1. Приготовление фуксин-сульфитной среды Эндо (в модификации Т. З. Артемовой).

Готовят из сухого препарата по прописи на этикетке. В готовую и охлажденную до 60-700С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды: 0,2 мл 10% спиртового раствора основного фуксина для повышения дифференцирующих свойств среды. Добавление розоловой кислоты не обязательно.

Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой не более 2-3-х суток в темноте, раствора фуксина - не более 1-го месяца.

При исследовании методом мембранных фильтров воды чистой и средней степени загрязнения, где значительно преобладает над бактериями группы кишечных палочек водная микрофлора, вырастающая на среде Эндо, для частичного подавления роста посторонних бактерий на 100 мл среды Эндо допускается (помимо фуксина) добавление 0,4-0,5 мл 5%-го водного раствора фенола и 1.8 мл этилового спирта.

2.4.2. Приготовление полужидкой среды с лактозой.

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 4-5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН (7,2-7,4), добавляют 1 мл 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при 120±2°С (1,1 кгс/см2) 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки столбиком высотой 3 см и стерилизуют при 112°С (0,5 кгс/см2) 12 мин. Срок хранения не более 2-х недель.

2.4.3. Приготовление полужидкой среды с лактозой из сухого препарата с ВР - по прописи на этикетке. Срок хранения не более 7 суток.

2.4.4. Приготовление лактозо-пептонной среды: 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. После растворения устанавливают рН (7,4-7,6), разливают по 10 мл в пробирки с поплавками или комочками ваты, стерилизуют в автоклаве при 112°С 12 мин. Для наглядности можно добавить индикатор по ГОСТ 18963-73.

Концентрированную лактозо-пептонную среду готовят также, как и среду нормальной концентрации, но с добавлением на 1000 мл дистиллированной воды 39 г пептона, 19,3 г натрия хлористого, 19,3 лактозы. Разливают по 3 мл в пробирки или по 15 мл во флаконы с поплавками.

2.4.5. Приготовление желчно-лактозного бульона с бриллиантовым зеленым по ГОСТ. При использовании среды для одновременного определения ферментации лактозы и образования индола следует уменьшить количество лактозы до 1 г и добавить 1 г триптофана (среда ФКП-1 Г. П. Калины). При отсутствии триптофана следует вместо воды использовать бульон Хоттингера, содержащий 100-120 мг аминного азота).

2.4.6. Приготовление лактозного бульона с борной кислотой по ГОСТ.

Примечание: От точности взвешивания ингибитора - борной кислоты зависит качество среды. Каждую новую партию борной кислоты следует испытать: при выращивании Е.соli при температуре 430С среда дает положительную реакцию (газ), при выращивании Enterbakter- отрицательную.

2.4.7. Приготовление реактива для определения оксидазного теста. Готовят:

1) 1%-ный спиртовой раствор а-нафтола;

2) 1%-ный водный раствор любого фенилендиаминового соединения (диметил-п-фенилендиамина, диметил-п-фенилендиамина солянокислого, дифенил-п-фенилендиамина). Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: 1-й- до одного месяца, 2-й - до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора. Реактив может быть заменен готовой бумажной индикаторной системой, которую перед определением следует смочить дистиллированной водой.

Каждую новую партию реактива, а также периодически в процессе его хранения, следует проверять на заведомо положительных культурах, а при их отсутствии - при посеве воды водоемов, где обязательно бывает оксидазоположительная флора.

 

2.4.8. Приготовление щелочно-полимиксиновой среды (ЩЭС) (Г.П. Калины).

 

 

Обычная концентрация
^ Удвоенная концентрация
 

 

1. Мясо-пептонный бульон                               70,0 мл                                       70,0 мл

Натрий хлористый                                              0,5 г                                            1,0 г

Глюкоза                                                                1,0 г                                            2,0 г

Дрожжевой экстракт                                           2,0 мл (или 2 г)                         4,0 мл (или 4 г)

2. Вода дистиллированная                                 15,0 мл                                       15,0 мл

Натрий углекислый                                             0,53 г                                          1,1 г

3. Вода дистиллированная                                 10,0 г                                          10,0 мл

Натрий двууглекислый                                       0,25 г                                          0,5 г

Раздельная стерилизация растворов 1, 2 и 3 при 112°С 12 мин. После стерилизации растворы смешивают, проверяют рН (10,0-10,2), прибавляют 20000 единиц полимиксина М, 0,5 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего, разливают в пробирки по 5 мл. В среду удвоенной концентрации добавляют 40000 единиц полимиксина М и 1 мл бромтилового синего. Разливают в колбы или флаконы по 10,50 или 100 мл соответственно количеству исследуемой воды.

2.4.9. Приготовление молочно-ингибиторной среды (Г. П. Калина).

Готового питательного агара 85 мл, стерильного снятого молока 15 мл, 0,1%-го водного раствора кристаллического фиолетового 1,25 мл, теллурита калия 2%-го водного раствора 1 мл. Все хорошо смешать и разлить в чашки.

2.4.10. Приготовление дрожжевого экстракта (Г. П. Калина).

1000 г прессованных (пекарских) дрожжей распределяют равномерно в 2000 мл дистиллированной воды, прогревают в автоклаве при 100°С 30 мин., отстаивают в холодильнике 4-5 суток, декантируют надосадочную жидкость, разливают во флаконы по 50-100 мл, прибавляют на каждые 100 мл экстракта 1,25 мл 0,01%-го водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогревают при 100°С 30 мин. Хранят экстракт в холодильнике. Экстракт можно готовить по этой же методике из 1000 г сухих дрожжей на 6000 мл дистиллированной воды. Можно применять сухой дрожжевой экстракт фабричного производства, уменьшив концентрацию в 10 раз.

2.4.11. Приготовление азидной среды Сланеца в модификации Т. З. Артемовой.

30-40 г сухого питательного агара, 4 г калия фосфорнокислого однозамещенного расплавляют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. устанавливают рН 7,0, разливают мерно в сосуды, стерилизуют при 120°С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и слегка остуженный агар добавляют из расчета на 100 мл среды: дрожжевого экстракта - 2 мл, глюкозы - 1,0 г, азида натрия – 0,04 1, 1%-го водного раствора 2, -3, -5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) - 1 мл. Тщательно смешивают, разливают в чашки по 20-25 мл. Хранят в холодильнике не более 2-х недель. Среду можно готовить перед употреблением без стерилизации в автоклаве.

2.4.12. Приготовление желчной среды «ЖСТ» (И. Н. Турчинский). К 600 мл дистиллированной воды добавляют 400 мл желчи крупнорогатого скота. 35-40 г сухого питательного агара, 5 г однозамещенного фосфата калия, 5 г двузамещенного фосфата калия, 5 г натрий-аммоний фосфата, расплавляют при нагревании, устанавливают рН 7,2-7,4, разливают мерно во флаконы и стерилизуют при 1200С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и слегка остуженный агар добавляют из расчета на 100 мл среды: 0,5 г глюкозы, 1 мл 1%-го водного раствора ТТХ, 0,6 мл 1%-го водного раствора метиленового синего (хранить не более 14 дней), 30000 ЕД полимиксина М, 1-2 мл 0.1%-го спиртового раствора фурациллина. Тщательно смешивают, разливают в чашки по 20-25 мл. Хранят в холодильнике не более 7 суток.

2.4.13. Приготовление молочно-желточно-солевого агара (МЖСА) (Е. Д. Вовк, В. Н. Ульянова, в модификации Т. З. Артемовой). Сухой питательный агар по прописи на этикетке и 90 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, разливают мерно в сосуды, стерилизуют при 1200С 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и остуженный до 50-55°С солевой агар добавляют:

- стерильное обезжиренное молоко - 60 мл;

- один яичный желток, тщательно смешанный с 50 мл физиологического раствора с помощью стеклянных бус;

- полимиксин М (раствор хранят не более 14 дней ) 300000 ЕД (при наличии постороннего роста).

Тщательно смешивают и разливают в чашки Петри толстым слоем по 20-25 мл для выращивания бактерий на мембранных фильтрах и тонким слоем по 12-15 мл для подтверждения этапа. Молочно-желточный агар готовят по этой же прописи, но без добавления натрия хлористого.

2.4.14. Приготовление индикаторных бумажек для определения продукции индола.

4 г пара-диметиламинобензальдегида растворяют в 50 мл этилового спирта 96, добавляют 10 мл ортофосфорной кислоты (очищенной концентрированной). Реактивом смачивают полоски из фильтровальной бумага на 1/3 их длины. Смоченный конец - лимонно-желтый. Высушенные индикаторные бумажки можно сохранить в темноте длительное время. Чувствительность бумажек возрастает при замене этилового спирта на амиловый или изоамиловый.

2.4.15. Приготовление тетратионатной среды Мюллера-Кауфмана (экспедиционная модификация Г. П. Калины).

В 500 мл исследуемой воды вносят 25 мл 10%-го пептона, 0,5 г желчных солей, 5 г кальция углекислого, 15 г натрия тиосульфата, 5 мл 0,1%-го водного раствора бриллиантового зеленого, 10 мл раствора Люголя. Для приготовления раствора Люголя в 10 мл воды вносят 3 г йода кристаллического и 2.5 г калия йодистого.

2.4.16. Приготовление желчной соли по Олькеницкому.

К 1000 мл желчи прибавляют 40 г натрия гидрата окиси, гидролизуют в автоклаве при 1200С 3 часа или 2 раза по 2 часа. Нельзя производить гидролиз в алюминиевой посуде. После охлаждения в гидролизат прибавляют 100 мл 20%-го водного раствора бария хлористого и прогревают в автоклаве при 100°С 1 час. Через 18-24 часа сливают жидкость с осадка и фильтруют. К профильтрованному гидролизату прибавляют при постоянном помешивании 20%-й раствор соляной кислоты до кислой реакции (рН 6,4-6,6) и оставляют на 18-24 часа. Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают водой, прибавляют при нагревании 40%-й раствор натрия гидрата окиси до слабощелочной реакции (рН 7,2-7,4 ) и выливают на противень для подсушивания в сушильном шкафу при 115°С до порошкообразного состояния. Из 1000 мл желчи можно получить 36 г смеси желчных солей. Следует остерегаться сильного перещелачивания при последней операции. Хранят соли в темной банке с притертой пробкой.

2.4.17. Приготовление селенитового бульона (Лейфсон).

2.4.17.1. Приготовление основного раствора (буфера). В стерильную колбу наливают 1 л дистиллированной воды, добавляют 10 г пептона (импортного, стран-членов СЭВ) или ферментативный гидролизат казеина неглубокой степени расщепления, растворяют нагреванием, добавляют 6 г натрия фосфорнокислого однозамещенного безводного, 14 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 8 г лактозы. Тщательно перемешивают, фильтруют, стерилизуют при 112°С 12 мин. Основной раствор хранят 1-32 месяца при +4° +10° С.

2.4.17.2. Приготовление 10%-го раствора натрия кислого селенистокислого.

В 100 мл дистиллированной воды растворяют 10 г натрия кислого селенистокислого. Раствор готовят ex tempore.

2.4.18. Приготовление магниевой среды (рецептура приготовления 100 мл среды обычной и двойной концентрации) (Раппопорт, Конфорти, Навои, в модификации Г. П. Калины и В. Л. Шигановой).

Готовят раздельно растворы А, Б, В по нижеследующей прописи:

 

Раствор

Ингредиенты

Обычная концентрация

Удвоенная концентрация

А.

 

 

 

 

 

Б.

 

В.

Пептон семипалатинский

Натрий хлористый

Калий фосфорнокислый

однозамещенный

Дрожжевой экстракт

Вода дистиллированная

Магний хлористый кристаллический

Вода дистиллированная

Бриллиантового зеленого 0,1%-ый

водный раствор

0,42 г

0,7 г

0,15 г

 

2,0 мл

89,0 мл

3,6 г

9,0 мл

0,5 мл

0,84 г

1,4 г

0,3 г

 

4,0 мл

89,0 мл

7,2 г

9,0 мл

1,0 мл

 

Ингредиенты растворяют, кипятят в течение 10 мин., затем растворы А, Б и В сливают в одну колбу.

Для облегчения транспортирования и хранения можно предварительно готовить и растворы ингредиентов среды в расфасованном виде, которые затем вносят в исследуемый субстат в соответствии с нижеследующей схемой (Г. П. Калина):

 

^ Навески ингредиентов на исследуемые объемы жидкостей

500 мл

100 мл

Магний хлористый кристаллический

Натрий хлористый

Калий фосфорнокислый однозамещенный безводный

10% раствор пептона

Дрожжевой экстракт

Бриллиантового зеленого 0,1%-й водный раствор

19,5г

4,0 г

0,8 г

25,0 мл

11,0 мл

2,5 мл

3,9 г

0,8 г

0,16 г

5,0 мл

2,5 мл

0,5 мл

 

Все навески можно соединить в одной емкости в виде жидкой кашицы. Уже через 24 часа хранения при комнатной температуре происходит самоостерилизация концентрата, который вносят в исследуемую вод) без дополнительной стерилизации.

2.4.19. Приготовление среды с охмеленным суслом (при отсутствии необходимости количественного определения сальмонелл и шигелл) (С. Данон-Моше, Ю. Г. Талаева).

125 мл охмеленного сусла наливают в стерильную посуду, добавляют 6,3 г пептона, размешивают, доводят до кипения и кипятят на медленном огне в течение 5 мин. Остужают, приливают 500 мл исследуемой воды, 15 капель 20%-го раствора натрия гидрата окиси, доводя рН до 7,8, добавляя 8,7 мл 0,1%-го раствора бриллиантового зеленого. Среда готовится ex tempore.

2.4.19.1. Приготовление среды с охмеленным суслом для количественного определения сальмонелл (методика ИОКГ им. А. Н. Сысина). 140 мл охмеленного сусла наливают в колбу, добавляют 7 г пептона, размешивают, доводят до кипения, кипятят на медленном огне в течение 5 мин., остужают, добавляют 17 капель 20%-го раствора натрия гидрата окиси, доводя рН среды до 7,8 и 9,7 мл 0,1%-го раствора бриллиантового зеленого. Расчет среды с охмеленным суслом приведен на 1 ряд разведений.

2.4.20. Приготовление агара с эозиновым метиленовым синим (ЭМС) и бактоагара Плоскирева с антибиотиками: на 1 л свежеприготовленной среды до застывания добавляют 8 мл 0,5%-го раствора синтомицина или 4 мл 0,5%-го раствора левомицетина. После этого среду разливают в чашки.

2.4.21. Приготовление желчного бульона. К мясо-пептонному бульону добавляют нативную желчь крупного рогатого-скота, устанавливают рН 7,6. Для получения 10%-го желчного бульона к 900 мл мясо-пептонного бульона добавляют 100 мл желчи. Приготовленный желчный бульон стерилизуют в автоклаве при 120°С 20-30 мин.

 

^ 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА САПРОФИТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

К сапрофитным микроорганизмам относят мезофильных, сапрофитных аэробов и факультативных анаэробов, способных образовывать на питательном агаре данного состава колонии, видимые при увеличении в 2 раза.

При выборе нового источника водоснабжения целесообразно определять:

- число сапрофитных микроорганизмов, вырастающих при температуре 20-220С в течение 48 часов.

- число сапрофитных микроорганизмов, вырастающих при температуре 37°С в течение 24 часов.

Соотношение численности этих групп микроорганизмов  позволит судить о динамике и интенсивности процесса самоочищения. При температуре 20°С вырастает больше сапрофитных микроорганизмов, чем при температуре 37°С. Эта разница более выражена при завершении процесса самоочищения, в местах загрязнения хозяйственно-бытовыми сточными водами численные значения обеих групп близки. Сапрофиты, вырастающие при температуре 20°С, являются активными участниками процесса самоочищения водоемов.

При лабораторно-производственном контроле за действующими источниками водоснабжения определяют только одну группу при температуре 37°С. Динамика численности этого показателя является чувствительным индикатором загрязнения водоема, в частности, органическими веществами.

3.1. Объем исследуемой воды.

Объем воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2-х чашках выросло от 20 до 300 колоний. Из каждой пробы должно быть посеяно не менее 2-х десятикратных разбавлений в 2-х повторностях. При выборе разбавлений ориентируются на результаты предыдущих анализов и на указания таблицы приложения 1.

При исследовании заведомо чистых вод с содержанием сапрофитов до 300 в 1 мл делают посев пробы воды без разбавления по 1 мл в 2-х повторностях. При исследовании воды неизвестной степени микробного загрязнения производят посев 4-х десятикратных разбавлений.

3.2. Выполнение анализа.

После тщательного перемешивания пробы готовят разбавления и немедленно вносят по 1 мл воды из пробы или из соответствующего разбавления в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки, сразу же после внесения воды в каждую чашку вливают 5-7 мл (на чашку диаметром 95 мм) расплавленного остуженного до 45-46 С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержался. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.

Не допускается посев из разбавлений, приготовленных заранее. Целесообразно сохранять расплавленный агар во время посевов в водяной бане, автоматически поддерживающей температуру 45-46°С. Тонкий слой агара увеличивает эффективность учета сапрофитной микрофлоры водоемов за счет лучших условий для роста аэробных бактерий, преобладающих в водоемах. Колонии вырастают более крупные, легко подсчитываемые на фоне прозрачного тонкого слоя агара. Ограничен рост расплывчатых колоний.

3.3. Выращивание посевов.

Чашки с посевами в одной повторности помещают в термостат и выращивают при температуре 37±0,5°С в течение 24±2 часа. Посевы в другой повторности выращивают при температуре 20-22ºС в течение 48±2 часов.

3.4. Учет результатов.

Должны быть подсчитаны все выросшие на чашке колонии, видимые при увеличении в 2 раза. Подсчет следует производить только на тех чашках, на которых выросли изолированные колонии в количестве от 20 до 300. При посеве 1 мл неразбавленной пробы ведут подсчет на чашках с любым количеством колоний, меньше 300.

Подсчитанное число колоний на каждой чашке делят на объем воды в мл, засеянный на те чашки, на которых велся подсчет и вычисляют в числе колоний в 1 мл исследуемой воды, округляя до 2-3-хзначных чисел.

Допустимы следующие исключения из общего правила, но с отметкой в протоколе анализа: Результат можно представить на основании подсчета колоний на одной чашке, если на других чашках:

а) рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки;

б) число колоний превышает 300-500;

в) при посеве из разбавлений выросло менее 20 колоний. Если на всех чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространившийся на всю поверхность чашки, или в результате неудачной схемы посева в чашках с посевом самого большого разбавления выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, допустимо в порядке исключения вести подсчет с помощью счетной пластинки, разделенной на квадраты, или трафарета, делящего чашку на сектора. Подсчитывают не менее 1/4 площади чашки в разных местах, с последующим пересчетом на всю площадь чашки.

Если рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки и подсчет невозможен, то в протоколе анализа отмечают «сплошной ползучий рост».

Окончательный результат заносят в протокол анализа, где обязательно указывают температуру инкубации посевов. Кроме того, в примечании отмечают особые обстоятельства, могущие повлиять на результат (превышение срока хранения пробы, изменение температуры и времени инкубации посевов, отклонения от правила при учете результатов и т. п.).

Воспроизводимость результатов метода может быть достигнута при строгом соблюдении деталей техники анализа, а также при использовании питательного агара одинакового состава.

 

^ 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА ЛАКТОЗОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ

КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК

 

В качестве основного показателя степени фекального загрязнения воды водоемов определяют лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), к которым относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки. Ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре 37±0,5°С в течение 24 часов, с отрицательным оксидазным тестом.

Число лактозоположительных кишечных палочек определяют методом мембранных фильтров или титрационным методом.

4.1. Метод мембранных фильтров.

4.1.1. Объем воды для посева.

Объем воды выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения с таким расчетом, чтобы не менее, чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии, среди которых не более 30 колоний относятся к бактериям группы кишечных палочек. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований и на рекомендации таблицы в приложении 1.

4.1.2. Выполнение анализа.

Для фильтрования используют мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,5 мкм. Подготовку мембранных фильтров к анализу осуществляют в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.

Фильтрование воды выполняют с помощью специальных приборов с соблюдением правил стерильности. Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании 1 мл воды в воронку наливают сначала 5-10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую вод) с последующим созданием вакуума.

После окончания фильтрования мембранный фильтр снимают при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра. Фильтр переносят на среду Эндо не переворачивая и добиваются полного прилегания его к среде без пузырьков воздуха. На одну чашку можно поместить несколько фильтров, но с условием, чтобы они не соприкасались.

Если анализируемая вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, то ее фильтруют сначала через фильтр со средним диаметром пор 4 мкм для удаления крупной взвеси, который помешают в фильтровальный прибор, накладывая на фильтр с диаметром пор 0,5 мкм. После окончания фильтрования фильтры переносят на среду Эндо раздельно и при выведении результатов анализа учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

4.1.3. Инкубация посевов.

Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре 37±0,5°С в течение 16-18 часов.

4.1.4. Учет результатов.

Для учета выбирают фильтры, на которых выросли изолированные колонии, и число колоний, характерных для лактозоположительных кишечных палочек, не более 30. Допустимо вести учет по 1 фильтру или на фильтрах с более густым ростом, но с обязательной оговоркой в приложении к протоколу анализа.

Выполняют оксидазный тест. Мембранный фильтр с выросшим на нем колониями переносят на кружок Фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом для определения оксидазной активности. Через 2-5 мин. после достаточно четкого проявления реакции (сине-фиолетовая окраска ободка или всей колонии оксидазоположительных бактерий) фильтр переносят обратно на среду и учитывают результат.

Примечание: при необходимости сохранения жизнеспособности бактерий, выросших на фильтрах, следует учитывать бактерицидность реактива для определения оксидазного теста. Поэтому высев колоний в полужидкую среду с лактозой и другие среды производят немедленно после проявления реакции и не позднее 5-7 мин. от начала контакта с реактивом.

Все колонии, которые приобрели сине-фиолетовую окраску, из учета исключают. Среди колоний, не изменивших первоначального цвета (оксидазоотрицательных), подсчитывают количество темно-красных и красных с металлическим блеском и без него, а также розовых слизистых крупных выпуклых, розовых с темно-красным центром (с отпечатками на обратной стороне фильтра до выполнения оксидазного теста).

При лабораторно-производственном контроле за эксплуатируемыми объемами анализ может быть завершен на этом этапе. Анализ продолжают в следующих случаях:

- при выборе нового источника водоснабжения;

- при арбитраже;

- при небольшом опыте работы выполняющего анализ;

- при отсутствии достаточно четкой дифференциации лактозоположительных колоний и других. В этих случаях по 2-3 колонии каждого подсчитанного типа оксидазоотрицательных колоний пересевают в полужидкую сред) с лактозой. Инкубация посевов и учет результатов описаны в п. 4.1.5.

4.1.5. Учет результатов при отсутствии реактива для определения оксидазного теста. На мембранных фильтрах, на которых выросли изолированные колонии, и число колоний кишечных палочек не более 30, подсчитывают отдельно каждый тип колоний, которые по морфологии и окраске можно предположительно отнести к ферментирующим лактозу кишечным палочкам (темно-красные с металлическим блеском, темно красные без блеска, красные, розовые с красным центром, розовые выпуклые слизистые и других оттенков с отпечатками на обратной стороне мембранных фильтров). По 3-4 колонии каждого подсчитанного отдельного типа микроскопируют после окраски по Граму по ГОСТ, пересевают уколом до дна пробирки в полужидкую среду с лактозой. Посевы инкубируют в течение 5-6 часов при температуре 37±0,5°С. Через 5-6 часов учитывают результат. При наличии кислоты и газа исследуемую колонию относят к лактозоположительным кишечным палочкам, при отсутствии изменения среды - не учитывают. При наличии кислоты посевы оставляют в термостате и окончательный учет производят через 24 часа.

В тех лабораториях, где учет результатов на полужидкой среде с лактозой не может производиться через 5-6 часов, следует применять лактозопептонную среду с поплавками, в этом случае учет результатов производят через 18-24 часа.

Подсчитывают сумму колоний таких типов колоний, которые ферментируют лактозу до кислоты и газа. Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то для вычисления числа лактозоположительных колоний этого типа используют формулу (a v c) / b , где а - общее число колоний данного типа, и - число проверенных из них, с - число положительных ответов.

4.1.6. Вычисление числа лактозоположительных кишечных палочек. Результаты анализа выражают в виде числа лактозоположительных кишечных палочек в 1 л воды (коли-индекс). Суммируют количество колоний лактозоположительных кишечных палочек на таких фильтрах, где выросли изолированные колонии и число кишечных палочек не превышает 30, и делят на объем воды, профильтрованный через эти фильтры, выраженный в литрах.

При отсутствии на фильтрах колоний кишечных палочек коли-индекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки. Например, при посеве 10 и 40 мл воды на фильтрах не выросло ни одной колонии кишечных палочек. Коли-индекс будет менее 20 (1:0,05 л = 20).

4.1.7. При отсутствии в 10 и 40 мл лактозоположительных кишечных палочек и несоответствии полученных результатов, с данными санитарного обследования оцениваемого водного объекта следует обратить внимание налактозоотрицательные колонии и провести анализ по п. 4.2.12. ГОСТ.

4.2. Титрационный метод.

4.2.1. Объем воды для посева.

Объем воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы в минимальных объемах или в наиболее высоком разбавлении получить один или несколько отрицательных результатов. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих исследований воды в этом же месте водоема и на рекомендации таблицы в приложении 2, а также таблицы расчета индекса в приложении 3.

Выбирают схему посева в 2 или 3 параллельных рядах, учитывая при этом, что чем больше повторностей, тем выше степень точности получаемых результатов.

4.2.2. Выполнение анализа.

Каждый объем воды или ее разбавления засевают параллельно в 2 или 3 порции лактозо-глюкозо-пептонной среды. 50 мл анализируемой воды вносят во флаконы с 15 мл концентрированной лактозо-пептонной среды. 1 мл пробы воды и 1 мл из разбавл