Реферат: Методические указания и задания к лабораторно-практическим занятиям по биотехнологии сельскохозяйственных растений Часть

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ


ДЕПАРТАМЕНТ КАДРОВОЙ ПОЛИТИКИ И ОБРАЗОВАНИЯ РФ


Казанская государственная сельскохозяйственная академия


Кафедра ботаники и физиологии растений


МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ И ЗАДАНИЯ

К ЛАБОРАТОРНО-ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ


по биотехнологии сельскохозяйственных растений


Часть I


Казань – 2003 г.

УДК 581.1 (07)

ББК 28.55р


Методическое указание содержит задания по выполнению лабораторных работ по курсу «Биотехнология сельскохозяйственных растений» студентами агрономического факультета; изложены основные принципы и приемы, используемые на практике культивирования растительного материала в клеточной и генной инженерии растений.


Составители: ст.преподаватель, к.б.н. Бунтукова Е.К. и профессор, д.б.н. Пахомова В.М.


Рецензенты:

заслужен. деятель науки РТ д.б.н., профессор Каримова Ф.Г.;

д.с.-х.н., профессор Владимиров В.П.


Рассмотрена и одобрена:

решением кафедры ботаники и физиологии растений (протокол № 8 от 17.03.03 г.), решением методической комиссии агрономического факультета КГСХА (протокол № 4 от 20.12.01 г).





С Казанская государственная сельскохозяйственная академия

2003 год


^ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ


Первые попытки культивирования растительных тканей были предприняты в конце прошлого – начале настоящего столетия. В 1902 г. Д. Габерландт, известный ботаник и физиолог растений, первым высказал мнение о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений. Однако прошло более трех десятилетий, прежде чем был достигнут прогресс в этой области.

Основоположниками метода культуры изолированных органов, тканей и клеток растений стали Ф. Уайт и Р. Готре (1932–1934 гг.). Они установили, что изолированные ткани растений могут расти в культуре неопределенно долго, если их периодически переносить на свежую питательную среду. К 1955 г. in vitro успешно культивировали не только ткани, но и клетки растений. Были достигнуты успехи в области морфогенеза в культуре изолированных клеток и получении растений-регенерантов для многих видов двудольных растений. В результате проведенных работ было доказано, что практически каждая соматическая клетка обладает способностью к формированию целого растения, т.е. тотипотентна.

В 1960 г. Английский исследователь Э. Кокинг предложил метод, основанный на разрушении клеточных оболочек с помощью пекталитических и целлюлитических ферментов. В настоящее время протопласты выделяют из тканей различных органов. Протопласты, высеянные на питательную среду, регенерируют клеточную стенку. Клетки переходят к делению, формируют каллус, из которого можно вырастить растения – регенеранты. Изолированные протопласты обладают способностью сливаться, в результате возникают соматические гибриды. Это явление лежит в основе клеточной инженерии высших растений. Таким образом, культивирование растительных клеток и тканей in vitro превратилось в разветвленную и многоплановую отрасль экспериментальной биологии и стало основой развития биотехнологии растений.

Новейшие достижения в области клеточной и генной инженерии во многом определяются совершенствованием культуральных методов. Благодаря развитию методов культуры изолированных тканей и клеток стало возможным осуществление генетической трансформации и получение трансгенных растений. Интерес исследователей к генетической трансформации высших растений возрастает в связи с появлением клонированных генов бактериального и растительного происхождения, а также с расширением круга растений, доступных для манипуляции на клеточном уровне.


^ 1. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Обычно культивируют каллусные растительные клетки, значительно реже опухолевые клетки. По морфологии опухолевые клетки мало отличаются от каллусных, однако между ними существует значительное физиологическое различие-гормоннезависимый рост опухолевых клеток. Иначе говоря, опухолевые клетки могут расти на безгормональных средах. Кроме того из опухолевых клеток практически невозможно получить нормальные растения-регенеранты. Иногда опухолевые клетки формируют тератомы-уродливые образования. Каллусные клетки при длительных пересадках могут приобрести гормоннезависимость к одному или обоим гормонам (ауксину и цитокинину), природа которой может быть или генетической, как результат мутации, или эпигенетической, как результат изменения экспрессии генов, вовлеченных в гормональный метаболизм. В последнем случае клетки могут потерять гормоннезависимость в ряду превращений клетка-растение-каллус.

Для получения каллусных тканей фрагменты органов помещают на питательные среды in vitro. Процесс получения и поддержания каллуса требует стерильных условий. Клетки тканей, помещенных на искусственные среды, дифференцируются, теряют функции, которые они выполняли в растении, и начинают делиться, что приводит к формированию каллуса.


^ 2.1.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД


Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, определенные аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, повышающие доступность железа для клеток в широких пределах рН.

Углеводы выступают необходимым компонентом питательных сред при культивировании изолированных клеток и тканей, так как они не способны к автотрофному питанию. Обычно в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20-40 г/л. Опухолевые ткани, в которых много активных гидролитических ферментов, могут расти на средах с растворенным крахмалом.

Регуляторы роста необходимы для дифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление дедифференцированных клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза можно снизить содержание ауксинов в среде или исключить их из питательной среды. На средах без гормонов растут опухолевые и «привыкшие» к таким условиям ткани. Автономность по отношению к гормонам того и другого типа или к одному из них связана со способностью клеток синтезировать гормоны (1).

В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции образования каллуса обычно применяют высокие концентрации ауксинов, а при последующих пересадках ткань может расти, если содержание ауксинов в среде уменьшено в несколько раз.

В качестве источника цитокининов в искусственных питательных смесях используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин (0,001-10 мг/л). Зеатин и БАП более активны в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза, чем кинетин. В состав некоторых питательных смесей входит аденин.

Отдельные питательные среды включают кроме ауксинов и цитокининов гибберелловую кислоту (ГК). Иногда к питательной среде добавляют растительные экстракты или соки. Наибольшей ростактивирующей способностью обладает кокосовое молоко-жидкий эндосперм кокосового ореха.

Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар-полисахарид, получаемый из морских водорослей. Наименьшее количество нежелательных примесей содержат бактериальный агар «Difco» и бактериальный агар отечественного производства, их можно применять без предварительной промывки. Обычно для получения твердой питательной смеси к среде добавляют 5-8% агара.

Растворы макросолей, микросолей и витаминов удобно готовить концентрированными. Маточные растворы хранят в холодильнике, витамины при отрицательной температуре. В 10-20 раз более концентрированными, чем нужно, готовят растворы макросолей, в 100-1000 раз более концентрированными-растворы микросолей, в 1000 раз-растворы витаминов.

Для культивирования клеток, тканей и органов тех или иных растенийиспользуют питательные среды различного состава. Наиболее широко применяются среда Мурасиге-Скуга (табл. 2.1, 2.2), среда Уайта (табл.2.3), среда Гамборга, или В-5 (табл.2.4).

Реактивы и оборудование. Химреактивы (табл.2.1). Колбы или стаканы химические на 1л, банки с притертыми пробками для хранения маточных растворов на 1л и 100мл, баночки на 20-50мл, мерные пипетки на 10 и 1мл, весы технические, весы торзионные, электроплитка.

Ход работы. Приготовить питательную среду Мурасиге и Скуга (табл.2.1, 2.2) для культивирования растительных органов и тканей.


^ Таблица 2.1. Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8


Компоненты

Содержание,

мг/л

Компоненты

Содержание,

мг/л

NH4NO3

1650

Fe2SO4 7H2O

27,8

KNO3

1900

Na2-ЭДТА 2H2O

37,3

CaCl2. 2H2O

440

Тиамин - HCl

0,1

MgSO4. 4H2O

370

Пиридоксин - HCl

0,5

KH2PO4

170

Никотиновая кислота

0,5

MnSO4. 4H2O

22,3

Мезо-инозит

100

CoCl2 .6H2O

0,025

Глицерин

2,0

ZnSO4. 7H2O

8,6

ИУК

2,0

CuSO4. 5H2O

0,025

Кинетин

0,2

Na2MoO4. 2H2O

0,25

Сахароза

30.000

Kl

0,83









^ Таблица 2.2. Состав маточных растворов по Мурасиге и Скугу



Компоненты питательной среды

Примечание


Макросоли, г/л маточного раствора

КNO3 38

CaCl2 (безводный) 8,8

NH4NO3 33

или CaCl2. 2H2O 13,8

MgSO4 (безводный) 3,6

или MgSO4.7H2O 7,4

KH2PO4 3,4


На 1 л среды брать по 50мл маточного раствора


Микросоли, мг/100 мл маточного раствора

H3PO4 620

MnSO4. 4H2O 2230

ZnSO4 860

Kl 83

Na2MoCl4. 2H2O 25

CuSO4. 5H2O 2,5

CoCl2. 6H2O 2,5

На 1 л среды брать по 1 мл маточного раствора


Fe-хелат, мг/100 мл маточного раствора

FeSO4.7H2O 557

ЭДТА-Na2 (трилон Б) 745

На 1 л среды брать по 5 мл маточного раствора




Прежде всего необходимо приготовить маточные растворы макро-, микросолей и витаминов. Для среды Мурасиге и Скуга обычно готовят маточные растворы следующего состава: 1) NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4 .7H2O (MgSO4. 7H2O вливают последним без нагревания, что предотвращает выпадение осадка); 2) раствор CaCl2 ; 3) раствор хелата железа (раствор FeSO4 и ЭДТА-Na2, необходимый для образования хелата железа, следует нагреть до кипения); 4) раствор микроэлементов.

Количество солей, необходимое для приготовления маточных растворов, а также количество маточного раствора, которое надо взять для приготовления питательной среды, приведены в табл. 2.2.

Полученные растворы сливают в склянки с притертой пробкой, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Хелат железа хранят в темной склянке.

Концентрированные растворы витаминов (каждого в отдельности) хранят во флакончиках. Для приготовления растворов берут десятикратную по отношению к добавляемой дозе навеску витамина и растворяют в 10 мл воды. В 1 мл этого раствора содержится порция витамина, необходимая для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга.

Теперь, используя маточные растворы, надо приготовить питательные среды для культивирования органов и тканей растений. В химический стакан или колбу емкостью 1л помещают навеску сахарозы 30 г, доливают до половины дистиллированную воду, нагревают, после растворения сахарозы добавляют необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей (см. табл. 2.2.), витаминов и доводят объем до 1л дистиллированной водой.

Растворы фитогормонов готовят следующим образом.

Ауксины ( 2,4-Д, -НУК, ИУК, индолил-масляная кислота – ИМК): 100 мг вещества растворяют в 0,5-2 мл спирта, подогревают, добавляют дистиллированную воду до 100 мл (концентрация 1 мг/мл).

Цитокинины (кинетин, зеатин, БАП): растворяют в небольшом объеме 0,5 н. HCl, подогревают, добавляют соответствующий объем дистиллированной воды.

^ Абсцизовая кислота (АБК): навеску растворяют в 70%-ном этаноле, доводя до нужного объема.

Гиббереллиновая кислота (ГК): навеску растворяют в воде.

При введении фитогормонов в среду перед автоклавированием следует обязательно довести рН среды до 5,5-5,6. Однако следует учитывать, что после автоклавирования изменяется первоначальный состав термолабильных компонентов среды. Так, тиамин распадается на пиримидин и тиазол, а кинетин и ИУК теряют часть своей активности. В связи с этим витамины и особенно термолабильные фитогормоны стерилизуют фильтрованием, пропуская через фильтр Зейца или «Миллипор» с диаметром пор 0,4 мкм (НУК, ИУК, зеатин, БАП). В этом случае для регуляции рН среды используют стерильные растворы щелочи.

Агар-агар предварительно замачивают в воде для набухания. Затем его нагревают на электроплитке при помешивании до полного растворения. После этого раствор агара надо слить с раствором солей, витаминов и сахарозы и довести объем среды до 1л. Колбы со средой закрывают ватной пробкой, бумагой или фольгой и стерилизуют в автоклаве.

Питательные среды разливают в пробирки (1/3 объема), которые закрывают ватными пробками или фольгой, стерилизуют в автоклаве.


^ 2.1.2. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО

МАТЕРИАЛА, ПОСУДЫ,

ИНСТРУМЕНТОВ И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД


Одно из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов состоит в соблюдении строгой стерильности (1). Тщательная стерилизация необходима, так как на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования растительных тканей и клеток хорошо развиваются и микроорганизмы, что создает опасность дял культивируемого материала. В результате жизнедеятельности организмов изменяется состав питательных сред. Кроме того, изолированные от растения ткани, клетки и особенно протопласты легко повреждаются микроорганизмами. Поэтому все опыты с культурой изолированных органов, тканей, клеток и протопластов растений проводят в ламинар-боксах. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы, необходимые для работы.

^ Материалы и оборудование. Семена, клубни, побеги и стебли растений.

Стаканы химические на 500-700 мл, колба с дистиллированной водой на 1 л, чашки Петри, предметные стекла, скальпель, пинцет, игла, марлевые мешочки, стерилизаторы, пробирки, чашки с питательными средами, фильтры Зейца или «Миллипор» для холодной стерилизации.

Автоклав, сушильный шкаф.

Ламинар-бокс. Протирают внутреннюю рабочую поверхность ламинара 70%-ным спиртом. Затем размещают в ламинаре спиртовую горелку, спички, стакан с96%-ным спиртом, стерильную посуду и инструменты, колбу со стерильной водой. При проведении работ по вычленению меристем в ламинар ставят бинокулярную лупу. Ламинар-бокс облучают бакткрицидными ультрафиолетовыми лампами в течение 10-12 ч.

Посуда. Стерилизация проводится в сушильном шкафу или в автоклаве. Перед стерилизацией посуду надо вымыть и высушить. Для мытья посуды используют детергенты, а также раствор двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпик). Перед стерилизацией пробирки, колбы предварительно закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу. Затем посуду помещают в сушильный шкаф и нагревают при температуре +175оС в течение 2 ч (после того как установится нужная температура). При таком нагревании погибают не только бактерии, но и их споры. Температуру в сушильном шкафу выше 175оС допускать не следует, так как при этом ватные пробирки буреют, а бумага, которой закрывают ватную пробку сверху, становится ломкой.

Еще более строгой стерилизации можно добиться под давлением в автоклаве, так как влажный жар эффективнее убивает микроорганизмы и их споры, чем сухой. Автоклавированию подвергают стаканы с крышками, чашки Петри, пипетки, колбы с дистиллированной водой. Посуду заворачивают в фольгу или оберточную бумагу и автоклавируют при 2 атм. В течение 25-30 минут. Верхнюю часть градуированных пипеток закрывают ватной прокладкой, пипетки заворачивают в бкмагу по 10 штук.

Инструменты. Предварительную стерилизацию инструментов скальпелей, пинцетов, игл и т.д. проводят нагреванием сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 12 ч при 140оС. Кипячением удобно стерилизовать шприцы. Металлические предметы нельзя стерилизовать автоклавированием, так как под действием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе посадки инструменты стерилизуют дополнительно, помещая в фарфоровый стакан с 96%-ным этиловым спиртом и обжигая в пламени спиртовки. Обжигать можно ланцеты, пинцеты, микробиологические петли. После стерилизации обжиганием каждый инструмент помещают между листами предварительно простерилизованной плотной бумаги, сложенными в пачку или в специальный штатив. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции. Затем его следует снова простерилизовать спиртом и обжечь. Очень тонкие инструменты (иглы, кусочки лезвий) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт.

Материалы. Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки, которые могут использоваться при посадке тканей, стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. В течение 25-30 мин.

^ Растительный материал. Для стерилизации семян, верхушечных меристем, кусочков ткани, выделенных из различных частей растения, применяют различные стерилизующие растворы: водные растворы сулемы, или двуххлористой ртути (0,1%), брома (1%), пергидроля (20-30%), хлорамина (3-6%), диацида, гипохлорита натрия (10%).

Диацид готовят следующим образом: растворяют отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридинилхлорида в горячей воде (около 300 мл), смешивают полученные растворы, доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1 л и добавляют несколько капель детергента Твин-80. Диацид хранят в холодильнике в плотно закрытой колбе в темноте.

Прежде чем приступить к стерилизации растительной ткани, ее предварительно очищают. Корнеплоды, клубни, толстые стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, снимают кожуру (у корней и клубнеплодов), кору (у побегов), промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд в абсолютный спирт. При этом кроме действия спирта отмечается усиление эффекта основного стерилизующего раствора. После стерилизации растительные объекты следует тщательно отмыть от стерилизующих веществ, многократно последовательно ополаскивая дистиллированной водой.

Диацид рекомендуется использовать при стерилизации семян кукурузы, пшеницы, ржи; пергидроль для фасоли, люпина, подсолнечника (с очищенной кожурой), томатов, редиса и др. Время стерилизации семян диацидом 15-20 мин, пергидролем 10 мин. Некоторые семена (хлопчатник, горох) хорошо стерилизуются концентрированной серной кислотой в течении 3 мин, с последующей пятикратной промывкой автоклавированной дистиллированной водой. Время стерилизации меристем и кусочков тканей из разных частей растения примерно вдвое меньше. Обычно используют диацид, который затем отмывают водой, воду меняют 5-6 раз.

Иногда семена некоторых растений: помидор, яблони, тыквы, бобов и табака, не обрабатывают антисептиком. Ко времени созревания семена оказываются заключенными в мясистые, деревянистые или костянковидные покровы. Здоровые с неповрежденной поверхностью плоды этих культур тщательно промывают мыльной водой, затем несколько раз спиртом. После этого в строго асептических условиях их разламывают. Стерильным инструментом из разлома выбирают семена и помещают их в стерильную посуду.

^ Питательные среды. Колбы и пробирки с питательными средами закрывают ватными пробками, завертывают горлышко в целлофан или оберточную бумагу и автоклавируют при температуре 120оС и давлении 1 атм. В течение 20 мин.

^ Холодная стерилизация. Органические жидкости, которые не выносят нагревания, освобождают от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм.


^ 2.1.3. ВЫРАЩИВАНИЕ СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ

Стерильные проростки выращивают с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro. В зависимости от задачи опыта семена высевают на воду или агаризованную питательную среду (3).

Существуют три возможных пути использования стерильных проростков: 1) для получения эксплантов из дифференцированных тканей, которые при переносе на питательную среду, содержащую фитогормоны, дифференцируются и в результате интенсивной пролиферации образуют каллусную ткань; 2) для получения каллуса непосредственно на проростках; 3) для получения протопластов из частей проростка, обычно из листьев, иногда из корней.

Для образования каллуса на проростках необходимы фитогормоны, поэтому в состав питательной среды для выращивания входит 2,4-Д.

^ Материалы и оборудование. Семена (горох, соя). Диацид, 96%-ный спирт, стерильные химические стаканы, стерильная вода.

Стерильные чашки Петри, пробирки, пинцет, стерильные марлевые мешочки.

^ Ход работы. Отобрать здоровые ровные семена гороха или сои, тщательно промыть их в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Промытые семена в марлевых мешочках погрузить на 2-5 мин в 96%-ный спирт, промыть в стерильной воде и поместить в раствор диацида на 20 мин. Затем пятикратно ополоснуть семена в стерильной воде.

Работу проводят в ламинар-боксе. С помощью стерильного пинцета разложить по 5-10 семян в стерильные чашки Петри или пробирки с питательной средой. Чашки Петри с семенами помещают в термокомнату при температуре +25оС. Асептические проростки можно использовать для получения эксплантов через 8-15 дней.

Для проращивания семян можно использовать среды Уайта (табл.2.3), Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 2.1,2.2) или Гамборга (В-5) (табл. 2.4), но без добавок фитогормонов.


^ Таблица 2.3. Среда Уайта, рН 5,6-5,8


Компоненты

Содержание, мг/л

Компоненты

Содержание, мг/л

Ca(NO3)2

200

CuSO4.5H2O

0,02

MgSO4

360

ZnSO4

1,5

Na2SO4

200

Na2MoO4.2H2O

0,0025

KNO3

80

Kl

0,75

KCl

65

Пиридоксин-HCl

0,1

NaH2PO4

16,5

Тиамин-HCl

0,1

H3BO3

1,5

Никотиновая кислота

0,5

MnSO4

4,5

Глицин

3,0

Fe(SO4)3

2,5

Сахароза

20.000


^ Таблица 2.4. Среда Гамборга (В-5), рН 5,8


Компоненты

Содержание, мг/л

Компоненты

Содержание, мг/л

NaH2PO4.H2O

150

ЭДТА-Na2.2H2O

37,3

KNO3

2500

Na2MoO4.2H20

0,25

(NH4)2SO4

134

Kl

0,75

MgSO4.7H2O

250

FeSO4.7H2O

28,0

CaCl2.2H2O

150

Тиамин- HCl

10,0

H3BO3

3,0

Пиридоксин- HCl

1,0

MnSO4.7H2O

10,60

Никотиновая кислота

1,0

CoCl2.6H2O

0,025

Мезо - инозит

100

CuSO4.5H2O

0,025

2,4-Д

2,0

ZnSO4.7H2O

2,0

Сахароза

20.000



^ 2.2. МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА (ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗВИРУСНЫХ РАСТЕНИЙ)


Первые работы в области микроклонального размножения были проведены в 50-х годах ХХ в. Французским ученым Жоржем Морелем. Его успеху в микроразмножении орхидей способствовала разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений. Растения, полученные из апикальной меристемы, были свободны от вирусной инфекции. Исследования Мореля по оздоровлению сортов картофеля были первыми в ряду многочисленных работ, направленных на получение здорового посадочного материала. В нашей стране работы по оздоровлению растений были начаты в 60-х годах в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН СССР.

При клональном микроразмножении растений in vitro – массовом бесполом размножении растений в культуре тканей и клеток, возникшие формы генетически идентичны исходному материалу. В основе микроразмножения лежит использование уникальной способности растительной клетки реализовать под влиянием экспериментальных воздействий присущую ей тотипотентность.

Этот метод имеет ряд чрезвычайно важных преимуществ:

за короткий срок возможно получение огромного количества однородного посадочного материала (коэффициент микроразмножения 105-107 растений в год);

ускоряется селекционный процесс, сроки получения товарной продукции новых сортов уменьшаются до 2-3 лет вместо 10-12;

происходит освобождение тканей от патогенных микроорганизмов и вирусов;

растения, получаемые в культуре тканей, однородны;

возможно поддержание роста растений круглый год;

при выращивании растений с длительной ювенильной фазой можно добиться ускоренного перехода от фвенильной к репродуктивной фазе расзвития;

удается размножать растения, которые размножаются с трудом или совсем не размножаются вегетативно. Указанные преимущества метода клонального размножения настолько велики, что в ближайшее время следует ожидать рентабельных биотехнологий получения этим способом посадочного материала новых ценных сортов растений

Итак, культура изолированных апикальных меристем используется для получения свободного от вирусов посадочного материала и для микроклонального размножения растений (6). Метод получения свободных от вирусов растений основывается на том, что по направлению к верхушке содержание вирусов в больном растении снижается. Апикальная меристема – небольшая группа делящихся клеток, обычно свободна от патогенов.


^ 2.2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ КАРТОФЕЛЯ


Из апикальных меристем в питательной среде получают безвирусные растения картофеля, которые могут быть размножены и высажены в теплицы для получения безвирусных клубней. Для ускоренного размножения материала используются также клубни, полученные in vitro.

Материалы и оборудование. Клубни картофеля. Пробирки со стерильной питательной средой (табл.2.5).

Бинокулярная лупа, скальпели, препаровальные иглы, лезвия, зажатые в держателе.


^ Таблица 2.5. Модифицированная питательная среда Мурасиге

и Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля,

рН 5,7-5,8



Компоненты

Содержание, мг/л

Компоненты

Содержание, мг/л

Минеральные элементы

По Мурасиге-Скугу

Гиббереллиновая кислота

1-10

Сахароза

20000

Никотиновая кислота

2

Глюкоза

20000

Фолиевая кислота

0,5

Гидролизат казеина

1000

Кинетин

0,5

Мезо-инозит

100

Пантеонат Са

10

Тиамин

1

Рибофлавин

0,5

Пиридоксин

1

Биотин

1

Аденин

40

Активированный уголь

10000

Витамин В12

0,015

Агар-агар

7000



^ Ход работы. Клубни картофеля хранят в течение недели при температуре 4-8оС, затем проращивают в темноте при температуре 20-22оС. Работы по вычленению меристем проводят в ламинар-боксе. Инструменты, используемые для вычленения (пинцеты, скальпели, иглы), стерилизуют перед каждым вычленением, погружая в спирт с последующим обжиганием. От тщательно вымытых клубней отделяют отростки и стерилизуют в 0,1%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной Н2О. Простерилизованные ростки помещают в стерильную чашку Петри и добавляют несколько капель автоклавированной воды для предупреждения их подсыхания. Перед вычленением с верхушки ростка удаляют покровные листочки, последовательно обнажают боковые и верхушечные меристемы с примордиальными листочками. Эту операцию проводят с помощью препаровальной иглы под бинокулярной лупой. Меристему размерами 100-250 мкм без листовых зачатков (примордиев) вычленяют обычной тонкой иглой, зажатой в держатель. Вычленять можно как верхушечную, так и боковые меристемы. Меристему на острие иглы переносят на поверхность питательной среды в пробирку, закрывают ее пробкой над пламенем горелки и ставят в штатив. После заполнения штатив с пробирками закрывают целлофановым колпаком для предупреждения подсыхания сред и ставят в световую камеру. Через две, три, четыре недели наблюдают за развитием из меристемы побега и зарисовывают этапы этого процесса.


^ 2.2.2. МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ КАРТОФЕЛЯ

ЧЕРЕНКОВАНИЕМ ПОБЕГОВ


Полученные из апикальных меристем на искусственной питательной среде безвирусные растения картофеля размножают. Один из наиболее распространенных способов размножения картофеля состоит в черенковании растений в пробирочной культуре. Растения вынимают из пробирок и разрезают так, чтобы в каждой части находился отрезок стебля с листом и пазушной почкой. Черенки пересаживают в пробирки с питательной средой.

Размножение черенкованием основано на подавлении апикального доминирования и активации пазушных меристем при удалении верхушки побега (1). Из пазушной почки развивается побег.

Каждое следующее черенкование проводят через 16-20 дней. Из одного растения получают до восьми черенков. За два-три месяца от одного растения черенкованием можно получить три-пять тысяч растений. В культуре in vitro у черенков картофеля можно индуцировать появление клубней, доведя концентрацию сахарозы в среде до 30 мг/л.

Следующий этап размножения оздоровленного посадочного материала проводят в теплице. Растения из пробирок вместе с агаровой питательной средой переносят в горшки с почвой. На третий-седьмой день растения подкармливают раствором Кнопа. Через 10-15 дней растения пересаживают на постоянное место в теплицах для получения клубней.

^ Материалы и оборудование. Стерильные скальпели, пинцеты, чашки Петри. Асептические растения картофеля, пробирки с модифицированной стерильной питательной средой Мурасиге-Скуга (табл.2.6).


^ Таблица 2.6. Модифицированная питательная

среда Мурасиге и Скуга

для микроразмножения картофеля

черенкованием побегов, рН 5,8


Компоненты

Содержание, мг/л

Минеральные элементы

По Мурасиге-Скугу

Гибберелловая кислота

2,0

Кинетин

0,5

Аденин

40,0

Никотиновая кислота

2,0

Пиридоксин

1,0

Тиамин

1,0

Пантеонат кальция

10,0

Активированный уголь

10000

Сахароза

30000

Агар

7000


^ Ход работы. Асептическое растение картофеля вынимают в ламинар-боксе из пробирки, помещают в чашку Петри, разрезают на части, содержащие отрезок стебля с листом и пазушной почкой. Часть стебля над листом должна быть в два-три раза короче, чем часть ниже листа. В процессе работы необходимо соблюдать строгую стерильность. Черенки высадить в пробирки на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга. Пробирку с черенком ставят в световую камеру. Наблюдают за развитием побега через 7 и 14 дней.


^ 2.2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ ЗЕМЛЯНИКИ.

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ЗЕМЛЯНИКИ.


При культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде с высоким содержанием кинетина (0,5-1 мг/л) под действием этого гормона происходит подавление апикального доминирования верхушечной меристемы и активация пазушных меристем. В результате примерно через две недели после помещения изолированной верхушки, состоящей из меристематического купола и одного-двух листовых примордиев, на питательную среду, основания развертывающихся листьев начинают зеленеть, увеличиваются в объеме, и вскоре из пазух показываются пучки листьев. В пазухе новых листьев опять закладываются почки, прорастающие через некоторое время. Через один-два месяца экспланты превращаются в конгломерат множества разновозрастных и разновеликих почек с развернутыми листьями. Образовавшиеся почки легко отделяются одна от другой. После пересадки на свежую питательную среду каждая из них формирует новые пазушные почки, увеличивая тем самым число точек роста, но не образует корней. Для корнеобразования почки должны быть пересажены на среду, содержащую ауксин.

Материалы и оборудование. Столоны земляники. Пробирки со стерильной питательной средой (табл.2.7), 96%-ный спирт, 0,1%-ный водный раствор сулемы или диацида, в колбе на 1 л стерильная вода.


^ Таблица 2.7. Модифицированная питательная среда Мурасиге

и Скуга для культивирования апикальных меристем земляники,

рН 5,8

Компоненты

Содержание, мг/л

Компоненты

Содержание, мг/л

Минеральные элементы

По Мурасиге-Скугу

Никотиновая кислота

0,5

Хелат железа

5,0

6-БАП

0,5

Аскорбиновая кислота

1,0

Глюкоза

20.000

Тиамин

0,5

Агар-агар

7000







Пиридоксин

0,5



Стерильные чашки Петри, стерильные скальпели, стерильные иглы, бинокулярная лупа, стерильные предметные стекла, спиртовая горелка, спички, марлевые мешочки, стерильные химические стаканы.

^ Ход работы. Столоны земляники промывают в мыльной воде и ополаскивают чистой водой. Выделяют скальпелем пазушные почки, находящиеся у основания листьев столонов земляники. Эту операцию проделывают вне ламинар-бокса. Всю дальнейшую работу необходимо проводить в ламинар-боксе. Почки собирают в марлевый мешочек и погружают для стерилизации в раствор диацида на 10 мин. Вынимают мешочек за нитку из раствора диацида и пять раз промывают в стерильной дистиллированной воде. Необязательно иметь для этого пять-шесть стаканов со стерильной водой, так как они занимают много места в ламинаре. Достаточно двух стаканов, на ¼ объема наполненных стерильной водой. Последовательно погружают в стаканы мешочек с почками, прополаскивают в воде в течение нескольких минут. Затем воду из второго стакана сливают в первый, а во второй наливают стерильную воду из колбы и прополаскивают в ней мешочек с почками. Так же поступают и в дальнейшем. Стерильные почки переносят из мешочка в чашку Петри и используют для вычленения меристем. Эту операцию проводят под бинокулярной лупой при десятикратном увеличении. На предметном стекле почку с помощью препаровальной иглы и скальпеля освобождают от многочисленных листовых чешуек; затем, придерживая почку иглой, скальпелем вычленяют меристематический купол с одним-двумя листовыми примордиями.

Вычлененную в ламинар-боксе меристему переносят на скальпеле в пробирку с питательной средой (табл.2.7). Пробирки закрывают целлофаном и помещают в световую климатическую камеру при температуре +25оС. Через четыре недели отмечают число образовавшихся почек и используют их для выполнения следующей работы.


^ 2.2.4. ИНДУКЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ

ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ

НА ПРИМЕРЕ ЗЕМЛЯНИКИ.


При культивировании апикальных меристем земляники на питательной среде, содержащей цитокинин (6-БАП), в результате активации пазушных меристем из одной верхушечной меристемы образуется много стеблевых почек, точки роста вытягиваются, разворачиваются новые листья. Однако укоренения образовавшихся почек на этой среде не происходит. Для укоренеия образовавшихся при микроклональном размножении земляники почек их необходимо пересадить на новую питательную среду, содержащую ауксины.

^ Материалы и оборудование. Пробирки с конгломератами почек земляники на питательной среде, пробирки со стерильной питательной средой (табл.2.8). Стерильный пинцет, стерильный ск