Реферат: Учебно-методическое пособие для студентов медицинского университета по гистологии и цитологии с основами эмбриологии

Министерство здравоохранения и социального развития РФ Владивостокский государственный медицинский университет


УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ СТУДЕНТОВ МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

ПО ГИСТОЛОГИИ И ЦИТОЛОГИИ

С ОСНОВАМИ ЭМБРИОЛОГИИ


Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому

и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособиядня студентов медицинских вузов


Под редакцией

профессора П.А. Мотавкина

доцента И.В. Ковалевой

Владивосток

Медицина ДВ

2008


УДК 611(07)

ББК 28.703/706

У 91 Утверждено в печать редакционно-издательским советом

Владивостокского государственного медицинского университета


Рецензенты:

Б. Я. Рыжавский, доктор медицинских наук, профессор,

заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии

Дальневосточного государственного медицинского университет;


^ А. П. Анисимов, доктор медицинских наук, профессор,

заведующий кафедрой клеточной биологии

Дальневосточного государственного университета


Составители:

П. А. Мотавкин, Г. В. Рева, А. В. Ломакин, И. В. Ковалева,

Н. Ю. Матвеева, Г. М. Холоденко


^ Учебно-методическое пособие для студентов медицинского университета по гистологии и цитологии с основами эмбриологии : учеб. пособие / [П.А. Мотавкин и др.]. - Владивосток : «Медицина ДВ», 2008. - 252 с.

Предлагаемое учебно-методическое пособие написано в соответствии с действующей программой и новейшими данными по гистологии, цитологии и эмбриологии для студентов 1-2 курсов лечебного, педиатрического, медико-профилактического и стоматологического факультетов медицинских вузов. Основная задача учебного пособия - дать студентам в краткой форме необходимую информацию для успешной работы во время лабораторных занятий и при индивидуальной работе на кафедре с целью развития у них навыков самостоятельного изучения микроструктуры тканей и выявления их основных морфологических признаков.

УДК 611(07)

ББК 28.703/706


© Коллектив авторов, 2008

© «Медицина ДВ», 2008


ОГЛАВЛЕНИЕ

ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ НА КАФЕДРЕ. ...........................5

^ ВЕСЕННИЙ СЕМЕСТР. ЦИТОЛОГИЯ. ОБЩАЯ ГИСТОЛОГИЯ.

НЕРВНАЯ, ИММУННАЯ И СЕНСОРНАЯ СИСТЕМЫ..............................................................................................................7

Тема 1. ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА....................................... ................7

Тема 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСТОЯННОГО

ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА.............................................................13

Тема 3. ФОРМЫ ОРГАНИЗАЦИИ ЖИВОЙ МАТЕРИИ.

ЦИТОПЛАЗМА И ЯДРО КЛЕТКИ. ................................................................21

Тема 4. МОРФОЛОГИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ В КЛЕТКЕ.............................27

Тема 5. СПОСОБЫ РЕПРОДУКЦИИ КЛЕТОК. РЕАКЦИЯ КЛЕТКИ

НА ПОВРЕЖДЕНИЕ...........................................................................................33

Тема 6. Семинар «ЦИТОЛОГИЯ».....................................................................................................40

Тема 7. ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ ТКАНИ............................. ................................42

Тема 8. МЕЗЕНХИМА. СОЕДИНИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИ...................................49

Тема 9. КРОВЬ И КРОВЕТВОРЕНИЕ................... ......................................55

Тема 10. ИММУННАЯ СИСТЕМА.............................................................................................................62

Тема 11. КОСТНАЯ ТКАНЬ................................................................................71

Тема 12. ХРЯЩЕВЫЕ И МЫШЕЧНЫЕ ТКАНИ..............................................78

Тема 13. Семинар «ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ, МЕЗЕНХИМНЫЕ

И МЫШЕЧНЫЕ ТКАНИ. ИММУННАЯ СИСТЕМА».....................................87

ТемаЫ. ТКАНЕВЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ.............................93

Тема 15. СИСТЕМА СПИННОГО МОЗГА........................................................99

Тема 16. КОРКОВЫЕ ФОРМАЦИИ ГОЛОВНОГО МОЗА.

АВТОНОМНАЯ (ВЕГЕТАТИВНАЯ) НЕРВНАЯ СИСТЕМА.......................105

Тема 17. ОРГАНЫ ЧУВСТВ. ОРГАН ЗРЕНИЯ И ОБОНЯНИЯ....................114

Тема 18. ОРГАНЫ ЧУВСТВ. ОРГАН СЛУХА, РАВНОВЕСИЯ, ВКУСА...123

ОСЕННИЙ СЕМЕСТР. ЧАСТНАЯ ГИСТОЛОГИЯ. ЭМБРИОЛОГИЯ..........................................................................................132

Тема 19. Семинар «ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ, МЕЗЕНХИМНЫЕ

И МЫШЕЧНЫЕ ТКАНИ. ИММУННАЯ СИСТЕМА»...................................132

Тема 20. Семинар «ТКАНЕВЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ.

НЕРВНАЯ СИСТЕМА».... ................................................................................137

Тема 21. СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТАЯ СИСТЕМА..........................................141

Тема 22. ОРГАНЫ КРОВЕТВОРЕНИЯ И ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ............150

Тема 23. ПИЩЕВАРИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА: ЯЗЫК, ЗУБЫ, ПИЩЕВОД...........................................................................................................156

Тема 24. ПИЩЕВАРИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА: ЖЕЛУДОК И КИШЕЧНИК.......................................................................................................165

Тема 25. КРУПНЫЕ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ ЖЕЛЕЗЫ...............................172

Тема 26. Семинар «СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТАЯ

^ И ПИЩЕВАРИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА. ОРГАНЫ КРОВЕТВОРЕНИЯ

И ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ»............ ...........................................................181

Тема 27. КОЖА И ЕЕ ПРИДАТКИ. ОРГАНЫ ДЫХАНИЯ......................186

Тема 28. ^ ЭНДОКРИННАЯ СИСТЕМА. ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНАЯ

СИСТЕМА.......................................................................................................194

Тема 29. ЭНДОКРИННАЯ СИСТЕМА. ПЕРИФЕРИЧЕСКИЕ ЖЕЛЕЗЫ

ВНУТРЕННЕЙ СЕКРЕЦИИ........... ...........................................................202

Тема 30. МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА........................................209

Тема 32. Семинар «ЭНДОКРИННАЯ СИСТЕМА.

МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА»...................... .............................215

Тема 32. ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ. РАЗВИТИЕ ХОРДОВЫХ........................222

Тема 33. МУЖСКАЯ ПОЛОВАЯ СИСТЕМА................... ....................231

Тема 35. ^ ЖЕНСКАЯ ПОЛОВАЯ СИСТЕМА. МАТКА.

ОВАРИАЛЬНО-МЕНСТРУАЛЬНЫЙ ЦИКЛ................... .....................242

Тема 36. ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ЧЕЛОВЕКА ………………. 243

^ ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ НА КАФЕДРЕ


В качестве основных форм работы со студентами на кафедре использу­ются лекции и лабораторные занятия. Изучение крупных разделов за­вершается итоговым семинаром, на котором преподаватель, используя различные формы контроля (тесты, опрос-беседа, диагностика микро­препаратов и микрофотографий, решение ситуационных задач) уста­навливает и оценивает степень усвоения знаний студентами, а в конце курса (3-й семестр) предлагается заключительный экзамен. Лекции дают возможность студентам получить наиболее современные и систематизи­рованные знания по основным разделам предмета.

Задачей практического занятия является изучение морфологичес­кой организации клеток, тканей, органов и умение связать их строение с выполняемыми функциями. Студент должен овладеть навыками самостоятельного «чтения» гистологических препаратов, научиться воспроизводить гистологическую структуру как в устной форме, так и в виде рисунков.

^ Правила работы студентов на практических занятиях

1. За 5-10 минут до начала занятий дежурный принимает учеб­ную комнату и после предъявления студенческого билета получает у лаборанта учебные пособия для практической работы всей группы. Дежурный несет ответственность за сохранность учебных пособий, микроскопических препаратов, таблиц, микроскопов, а также за общий порядок в учебной комнате во время работы. По окончании практичес­кого занятия дежурный сдает учебную комнату и получает студенческий билет у лаборанта.

2.К началу занятий студенты должны быть готовы для его проведе­ния - надеть халаты, убрать портфели на специально отведенное место, приготовить для работы альбомы и набор цветных карандашей и полу­чить у дежурного учебные пособия. Каждому студенту предоставляется закрепленный за ним микроскоп и набор соответствующих препаратов.

3. На занятие студенты должны приходить с подготовленным те­оретическим материалом. В начале занятия и в ходе любого его этапа подготовка контролируется преподавателем. В случае неудовлетво­рительной теоретической подготовки и отсутствия рисунков гисто­логических препаратов в альбоме данное занятие студенту не зачи­тывается.

4. Во время самостоятельной работы на практических занятиях требуется соблюдать дисциплину, поддерживать порядок, бережно обращаться с микроскопами, гистологическими препаратами, таблицами и другим кафедральным имуществом.

5. На стенде «Учебно-методические материалы кафедры» студенты должны ознакомиться с календарным расписанием и темами лекций, практических и итоговых занятий, контрольными вопросами для подготовки, с графиком сдачи отработок, а также объявлениями и другой необходимой информацией.


Весенний семестр


^ ЦИТОЛОГИЯ. ОБЩАЯ ГИСТОЛОГИЯ. НЕРВНАЯ, ИММУННАЯ И СЕНСОРНАЯ СИСТЕМЫ


Тема 1. ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА


Краткое содержание темы

Современные виды микроскопической техники. В настоящее время одним из наиболее современных видов микроскопической техники является конфокальная микроскопия. Она широко используется в клеточной биологии и позволяет изучить структуры клеток и их органоидов благодаря своему высокому разрешению и контрасту, например: цитоскелет, ядро, хромосомы, или даже локализацию в них отдельных генов. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов. Кроме того, конфокальная микроскопия позволяет исследовать динамические процессы, происходящие в живых клетках, например, движение ионов кальция и других веществ через клеточные мембраны.

Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP (восстановление флуоресценции после фотовыжигания) и FRET (передача энергии посредством флуоресцентного резонанса). Данные методы применяются для исследования подвижности биоорганических молекул, а также для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия.

Большинство современных конфокальных микроскопов построено на базе люминесцентного микроскопа. Следовательно, объекты исследования должны быть предварительно окрашены соответствующим люминесцентным красителем или обладать собственной флуоресценцией. Конфокальный микроскоп предназначен прежде всего для усиления контраста изображения; принцип его работы основан на использовании лазерного осветителя, высокочувствительного фотоприемника и компьютерной обработки изображения. Разрешающая способность конфокального микроскопа - его важнейший параметр. Это минимальное расстояние между двумя точками,

при котором прибор может различать их как отдельные структуры. Теоретически разрешающая способность конфокального микроскопа в 1,4 раза выше обычного. Она зависит прежде всего от длины волны излучения, поэтому существует предел, накладываемый волновыми свойствами света. Поскольку конфокальный микроскоп - прибор оптико-электронный, то его разрешающая способность зависит не только от оптических узлов, но и от электронных систем преобразования оптического сигнала в электрический, а затем в цифровой. Конфокальный микроскоп позволяет рассмотреть структуры размером от 1-2 мкм до 0,2 мкм. Для изучения более мелких объектов придется применять другие методы, например, электронную микроскопию.

Поляризационная микроскопия используется в цитологии для определенных целей. Она позволяет выявить структуры с упорядоченным расположением молекул (например, кристаллы или фибриллярные белки). Такие структуры обладают, как известно, двойным лучепреломлением (анизотропией): проходящий через них световой луч разделяется на два, распространяющихся с различной скоростью и в различных направлениях. В поле зрения поляризационного микроскопа анизотропные объекты оказываются ярко светящимися на темном поле. Отечественный микроскоп МИН-8 является отличным прибором и вполне удовлетворяет исследователей-биологов. На кафедре имеется микроскоп «Варшава». Интерференционная микроскопия тоже основана на применении поляризационного света. На основе эффекта фазового сдвига можно судить о структурах объекта и плотности отдельных участков: т.к. сдвиг связан с плотностью структуры, то, измерив величину клетки (или ее части), можно найти ее сухой вес в граммах.

Флуоресцентнаямикроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флуоресценцию ряда веществ, так и вторичную флуоресценцию, вызывая ее окрашиванием биологических структур специальными красителями - флуорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении сами начинают светиться, причем длина волны испускаемого ими света всегда больше, чем длина волны света, возбуждающего флуоресценцию. Поэтому для возбуждения флуоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синими или ультрафиолетовыми лучами. Собственной флуоресценцией обладают нуклеиновые кислоты, рибофлавин и ряд др. В качестве флуорохрома чаще всего применяют акридиновый оранжевый. Флуоресценцию можно наблюдать визуально и фотографировать. Всеми необходимыми качествами для произведения флуоресцентной микроскопии обладает наш отечественный микроскоп МЛ-2.

Электронная микроскопия. Создание электронного микроскопа основано на возможности магнитного поля, обладающего магнитной симметрией подобно линзам, фокусировать поток электронов (Буш, 1926). В связи с тем, что длина волны электромагнитного колебания при движении электронов (=0,0056) короче длины волны видимого света (200-800 нм), разрешающая сила электронного микроскопа во много раз больше, чем у световых микроскопов. Полностью реализовать возможности электронного луча невозможно в связи с техническими затруднениями, однако уже сейчас разрешающая способность электронного микроскопа равна 1/2-1/4 нм. Отечественные электронные микроскопы ЭММА-10 К имеют разрешающую способность 0,5 нм, а ЭНМ-100 Л - 0,25 нм. Электронный микроскоп построен следующим образом: 1) источник электронов (по типу электронной пушки); 2) система электромагнитных конденсоров; 3) держатель образца (исследуемого объекта); 4) электронный объектив (система электромагнитов); 5) система электронных проекторов; 6) флуоресцентный экран для визуального наблюдения; 7) камера для фоторегистрации изображения. Вся система электронного микроскопа работает в глубоком вакууме. В отличие от светового микроскопа, в котором изображение определяется в связи с поглощением света, в электронном микроскопе флуоресценция экрана и воспроизведение деталей объекта зависят от степени рассеивания электронов при прохождении через изучаемый объект. Препараты для электронного микроскопа должны быть тонкими (0,5-2,0 нм). Готовятся они на специальном ультратоме. В частности на кафедре имеется УМВБ-2.

В последние годы широко используются иммуноцитохимические и гистохимические методы исследования, целью которых является изучение химического состава тканей и клеток при сохранении их структуры, а также установление локализации химических веществ в определенных компонентах тканей, типах клеток и клеточных структурах. Имеющиеся в арсенале современной науки гистохимические реакции охватывают методы для выявления белков и аминокислот, нуклеиновых кислот, липидов, биогенных аминов, неорганических веществ, ферментов и т.д.


Хронокарта

1. Организационная часть с мотивацией темы - 5 мин.

2. Программированный контроль - 10 мин.

3. Опрос-беседа - 35 мин.

4. Объяснение препаратов - 10 мин.

5. Перерыв - 15 мин.

6. Контроль за самостоятельной работой студентов. Помощь в работе с препаратами - 65 мин.

7. Подведение итогов. Проверка альбомов - 10 мин. Время лабораторного занятия: 3 часа.

Мотивационная характеристика темы

Развитие гистологии как науки и ее дальнейший прогресс тесно связаны с совершенствованием методов исследования. Гистология располагает большим арсеналом средств для изучения биологических структур на всех уровнях их организации: клеточном, тканевом, органном. Методы исследования, применяемые гистологией, необходимы врачу любого профиля для диагностики, лечения и профилактики заболеваний, познания причин, вызывающих болезни и осложнения их течения. Материалы темы «Гистологическая техника» способствуют активному формированию мировоззрения будущего врача. Взаимоотношения между структурой и функцией рассматриваются с позиции диалектического представления о единстве материи и ее движения; нет структуры без функции и нет функции без структуры. Структура является материальным субстратом любой функции организма. Необходимо отметить, что прогресс современной гистологии в большей степени определяется тем, что она основывается на достижениях физики, химии, математики и информационных технологий. Внедрение новейших методов исследования обусловливает бурное развитие биологических наук, в том числе гистологии, обеспечивает широкое внедрение гистологии в клинические дисциплины.


^ Учебная цель

Общая цель. Знать общие принципы микроскопических методов исследования. Уметь работать на световом микроскопе.

Конкретная цель: знать принципы работы и овладеть навыками работы на световом микроскопе. Знать принципы работы поляризационной микроскопии. Знать принципы работы фазово-контрастной микроскопии. Знать принципы работы интерференционной микроскопии. Знать принципы работы флуоресцентной микроскопии. Знать принципы работы электронной микроскопии. Иметь представление о гистологическихи гистохимических методах исследования. Иметь представление о количественном методе исследования.

^ Необходимый исходный уровень знаний

Из других предметов и предшествующих тем: 1. Физические свойства световой, люминесцентной, электронной микроскопии. 2. Химические свойства кислотных и щелочных растворов. 3. Устройство световых микроскопов: «Биолам», «Эрудит», «МБР-1», «МБИ».


Вопросы для самоподготовки

1. Назвать основные части светового микроскопа.

2. Что такое разрешающая способность микроскопа?

3. Правила работы с микроскопом.

4. Конфокальная микроскопия и ее применение при исследовании объектов.

5. Каковы возможности фазово-контрастной и интерференционной микроскопии в изучении биологических объектов?

6. Люминесцентная микроскопия. Первичная и вторичная флуоресценция.

7. Принципы работы электронного микроскопа. Его разрешающая способность.

8. Гистологические и гистохимические методы исследования.

9. Количественные методы гистологического исследования.


Рекомендации для работы на занятии

Задание 1. Овладеть правилами работы со световым микроскопом. Объект изучения: «Биолам», «Эрудит», «МБР-1». Программа действий: научиться микроскопировать при малом и большом увеличении объектива. Ориентировочные основы действий: прежде чем начать работу с микроскопом, нужно установить его на рабочем месте так, чтобы он был обращен колонкой к наблюдателю, а зеркалом к источнику света. Затем установить освещение при слабом увеличении объектива, повернув зеркало так, чтобы поле зрения микроскопа было освещено равномерно и достаточно ярко, но чтобы свет не раздражал глаз. После этого положить препарат на предметный столик покровным стеклом кверху, чтобы объектив приходился против отверстия столика. Микроскопирование препарата всегда надо начинать при слабом увеличении, глядя сбоку на микроскоп, опустить его тубус, вращая от себя макровинт до тех пор, пока фронтальная линия объектива не будет на расстоянии 0,5 см от покровного стекла. Затем смотрят в окуляр левым глазом и держа при этом правый глаз открытым медленно вращают макровинт на себя до получения изображения препарата. Для более четкой наводки пользуются микровинтом, вращая его не более чем на пол-оборота в обоих направлениях. С помощью микровинта можно определить толщину препарата в мкм. Изучая препарат при слабом увеличении микроскопа, нельзя ограничиваться одним полем зрения - необходимо исследовать препарат по всей его поверхности, т.к. заключенный под покровное стекло гистологический срез может лежать не совсем горизонтально и толщина его частей может быть разной, при его перемещении теряется четкость изображения. Поэтому нужно, передвигая препарат, держать свободную руку на макровинте и слегка вращать его. Но при этом нужно помнить, что микроскоп дает обратное изображение, т.е. при перемещении препарата сверху вниз изображение будет двигаться снизу вверх. После того, как на препарате найдено хорошее место дальнейшего изучения, необходимо поставить его в центре поля зрения и закрепить зажимами. После этого сменить увеличение на сильное: поднять тубус микроскопа при помощи поворота микровинта на себя, сменить объектив слабого на объектив сильного увеличения поворотом револьвера. Глядя сбоку на микроскоп, вращают микровинт от себя до тех пор, пока фронтальная линза не приблизится вплотную к покровному стеклу. После этого, глядя в окуляр, осторожно вращают микровинт на себя до появления четкого изображения препарата. Наиболее четкая наводка на фокус достигается вращением микровинта так же, как и при слабом увеличении. После окончания микроскопирования нельзя сразу снимать препарат с предметного стекла, нужно предварительно поднять тубус несколькими оборотами макровинта, иначе можно повредить препаратом фронтальную линзу. Затем приводят микроскоп в исходное состояние, т.е. ставят над отверстием столика объектив слабого увеличения на расстоянии 2-3 см от него. Перенося микроскоп, держат правой рукой колонку штатива, а левую подставляют под его основание. С помощью оптических микроскопов можно изучать биологические объекты при различном увеличении. Увеличение до 440 х дают «сухие» объекты, т.е. те, при работе с которыми между препаратом и объективом имеется небольшое пространство (воздух), большое увеличение достигается с помощью короткофокусных объективов, когда между объективом и исследуемым препаратом помещают каплю жидкости (вода, масло). Эта система называется иммерсионной. В зависимости от применяемой жидкости различают масляную или водную иммерсию. Иммерсионная система позволяет изучать препараты с увеличением в 1200-1500 раз. Оптические микроскопы обладают ограниченными данными, в связи с чем, в гистологию введены новые методы микроскопии.

^ Основная и дополнительная литература

Основная литература: 1) П. А. Мотавкин. Курс лекций по гистологии. - Владивосток : «Медицина ДВ», 2007; 2) Гистология человека в ответах на вопросы / под ред. П.А.Мотавкина, Н.Ю.Матвеевой); 3) Учебник гистологии / под ред. Ю.И. Афанасьева, Н. А. Юриной. - М.: «Медицина», 1999, 2001.

^ Дополнительная литература: 1) М. Уикли. Электронная микроскопия для начинающих. - М.: «Мир», 1978; 2) Н. Луппа. Гистохимия. - М.: «Мир», 1979; 3) Ю.С. Ченцов. Общая цитология, 1978; 4) Г. А. Меркулов. Курс патогистологической техники, 1969.


^ Техническое обеспечение учебного процесса

1) Тестовый контроль с использованием пакета компьютерных программ; 2) обеспечение иллюстративной части занятия наглядными пособиями (стенды, таблицы, электронограммы) с использованием мультимедиа (Multimedia Projector DV-thenter); 3)микроскопы; 4)наборы учебных и демонстрационных препаратов.

^ Домашнее задание

См. учебно-методическую разработку лабораторного занятия для студентов по теме: «Приготовление постоянного гистологического препарата».


Тема 2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСТОЯННОГО ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА


^ Краткое содержание темы

Этапы приготовления постоянного гистологического препарата. Постоянный гистологический препарат - это изготовленный из тканей и органов объект, позволяющий узнать их структуру с помощью микроскопирования. Он может представлять собой тонкий срез органов, тотальный препарат (мягкая мозговая оболочка, рыхлая соединительная ткань), мазок (красный костный мозг, кровь и пунктат органа), отпечаток органов (печень, селезенка). Обработка объектов для приготовления из него постоянного гистологического препарата включает следующие моменты: (1) взятие материала, (2) фиксирование, (3) обезвоживание и уплотнение, (4) заливка в плотные среды, (5) изготовление срезов, (6) окрашивание, (7) просветление и заключение в среду, служащую для сохранения препаратов. Взятие материала: объекты, подлежащие исследованию, забираются как можно раньше после забоя животного и сразу же фиксируются или замораживаются для сохранения структуры органов. В некоторых случаях пользуются иссечением тканей из живого организма (биопсия) с целью диагностического морфологического исследования. Иссечение кусочков проводится острым инструментом (бритвы, секционные ножи) во избежание повреждения тканей. Ножницами пользуются при иссечении оболочек (сальник, мягкая мозговая оболочка) и тонкостенных полых органов (желчный пузырь, кишечник). Кусочки из костей выпиливают, иссекают с учетом микроскопического строения того или иного органа или тканей величиной 1-1,5 см3; например, почки и надпочечник вырезают с таким расчетом, чтобы в них попали корковое и мозговое вещество, для чего разрезы ведут перпендикулярно поверхности органов. Из органов, имеющих во всех частях одинаковое строение (печень, селезенка) объекты можно иссекать в любом участке, но желательно с капсулой. Кусочки из патологически измененных тканей (опухоли, язвы) вырезают на границе с нормальными тканями так, чтобы были захвачены и нормальные, и измененные участки.

Фиксация. Цель фиксации - закрепление и сохранение тканевых структур в том виде, в котором они находились в момент забора материала. Это достигается коагуляцией белков фиксирующими жидкостями, которые должны достаточно быстро проникать в ткани и действовать «мягко», не вызывая грубых нарушений тканевых структур (например сморщивание, чрезмерное уплотнение). К фиксирующим жидкостям относят формалин, спирт, слабые растворы уксусной, азотной, хромовой и других кислот, сулему, двухромовокислый калий. Фиксаторы, состоящие из какого-либо одного вещества, называются простыми фиксаторами. Чаще применяются сложные фиксаторы, состоящие из смеси нескольких простых фиксирующих компонентов. Так, например, раствор Буэна включает уксусную, пикриновую кислоты и формалин, жидкость Ценкера состоит из двухромовокислого калия и сулемы, а жидкость Мюллера - это смесь двухромовокислого калия, сульфата натрия в воде. Выбор фиксатора зависит от характера объекта и цели, которая ставится при изготовлении препарата. Например, чтобы сохранить в клетках включения жира, следует применять формалин, а не спирт, т.к. он является растворителем жира. В то же время этиловый спирт - наилучший фиксатор при исследовании в клетках железа, гликогена и нуклеиновых кислот. После фиксации кусочки промывают водой, если фиксатор содержит вещество, мешающее дальнейшей обработке (сулема, формалин). Если таких веществ нет (спирт или смеси, содержащие спирт), то кусочки не промываются.

Обезвоживание. Уплотнение. Обезвоживание исследуемого образца производят в спиртах возрастающей концентрации (50°, 60°, 70°, 80°, 90°, 100°) с целью уплотнения ткани и подготовки ее к пропитыванию целлоидином или парафином. В каждом спирте исследуемый образец выдерживают не менее суток.

Заливка. Для того чтобы из кусочка можно было приготовить срез, необходимо придать ему еще более плотную консистенцию. Для этих целей применяются парафин и целлоидин. Принцип заливки заключается в последовательном проведении кусочка через ряд жидкостей, из которых каждая предыдущая должна обладать способностью смешиваться с последующей. Схема заливки в парафин состоит в следующем; 1) спирт 100° - 1-2 часа; 2) смесь 100° спирта и ксилола 1:1 - до погружения кусочка; 3) ксилол (хлороформ) 1 час; 4) раствор парафина в ксилоле - 0,5-1 час; 5) расплавленный парафин (воск) 1-2 часа. Время каждого этапа заливки вместе с тем определяется особенностями объекта. После пребывания в расплавленном парафине в термостате при температуре 37°С - 1-2 часа или при 56°С - 0,5-1 час образец полностью пропитывается парафином. В целях полного освобождения объекта от ксилола кусочки проводят последовательно через 2-5 порций расплавленного парафина. Затем кусочек вместе с расплавленным парафином помещают в формочку, где он застывает при комнатной температуре в плотный блок.

Схема заливки в целлоидин состоит в последовательной проводке материала в 100° спирте, смеси спирта и эфира, 5% целлоидине. В каждом растворе целлоидина образец выдерживают от 3 до 7 дней, после чего кусочек вследствие испарения спирта и эфира застывает в плотный гель. Это позволяет нарезать исследуемый образец с прилежащим целлоидином и наклеить его на деревянный брусок. Таким образом, парафиновые блоки могут сохраняться длительное время, а целлоидиновые помещают в 70° спирт для сохранения. Наряду с названными уплотняющими средствами, в настоящее время применяют синтетические смолы и полимеры (например, поливакс, карбовакс или полиэтиленгликоль).

Изготовление срезов. Из залитых целлоидиновых и парафиновых блоков готовят срезы необходимой толщины (5-10 мкм) на специальных приборах различной конструкции - микротомах. Наиболее распространенным является санный микротом (МС-2), в котором нож и объектодержатель движутся на специальных салазках. Основные части микротома: 1) станина - массивная чугунная основа, на которую монтируются все остальные узлы; 2) механизм подъема; 3) зажим для блока; 4) ножевые салазки, несущие на себе ножедержатель. Последний укрепляется на салазках рукояткой, позволяющей менять горизонтальный угол расположения ножа. Зажим снабжен подвижной цилиндрической втулкой, перемещение которой с помощью винта меняет угол наклона ножа; 5) механизм микропередачи состоит из стержня, соединенного с тягой храповика микро-пинта. Эта система поднимает столик с объективом на высоту, соответстнующую толщине среза, а движущийся в горизонтальной плоскости нож режет блок. При необходимости получения препарата в короткий срок (например, с диагностической целью) используется замораживающий микротом или криостат. Первый построен по санному принципу, но имеет особенности конструкции и монтажа. Основные его узлы: станина, механизм подъема, бритводержатель и замораживающий столик. Криостат, в свою очередь, представляет собой холодильник, в рабочей камере которого установлен микротом. Сравнительно небольшой объем камеры, надежная теплоизоляция, наличие специального регулирующего механизма позволяют поддерживать постоянно заданную минусовую температуру. Таким образом, уплотнение материала при резке на замораживающем микротоме и криостате достигается замораживанием образца.

Окрашивание. С тех пор, как было установлено, что отдельные составные части клеток и межклеточные элементы по-разному воспринимают и удерживают красители, было предложено большое количество окрасок препаратов. Хотя до настоящего времени полностью не выяснена сущность механизмов действия многих красителей, несомненно, что в основе окрашивания микроструктур лежат физико-химические процессы. Из физических факторов следует отметить диффузию, адсорбцию (поверхностное впитывание) красителя, а также его растворимость, из химических -электролитические свойства красящих веществ в самих тканях. Немаловажное значение имеет плотность тканей и дисперсность самого красителя. Первое свойство определяет последовательность окраски отдельных структур, второе - скорость процесса окраски. На электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислые и нейтральные. Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структуры кислой природы (например, хроматин, ядра, содержащие ДНК, ядрышко, содержащее РНК). Отсюда и термин - базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся красителями, таким как тионин, гематоксилин, метиловый зеленый, кармин, азур, сафранин и др. Кислотный краситель - это красящая кислота и ее соль, в силу чего она окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эозинофильных лейкоцитов, цитоплазму большинства клеток. Отсюда оксифилен для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями, к которым относятся эозин, кислый фуксин, конго красный, анилиновый синий и др. Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кислотного и основного красителя, например судан-3, эозиновокислый метиленовый синий. Кроме того, в гистологической практике часто используются специальные красители. Так, например, для выявления жира применяется судан-3 и шарлах красный. Первый окрашивает жир в желтый, а второй - в оранжевый цвет. Осмиевая кислота окрашивает жиры в черный цвет. Эластические волокна при обработке орсеином окрашиваются в коричневый цвет, резорцин фуксином в темно-синий цвет, а пикро-фуксин окрашивает их в желтый цвет. Для выявления нервных элементов, клеточных границ и органоидов в различных тканях применяется импрегнация (пропитывание) раствором азотистокислого серебра, осмиевой кислоты, хлорного золота, основанная на восстановлении свободных металлов и осаждении их на исследуемых структурах.

Просветление и заключение. Сохранение прозрачности, окраска и структурная целостность постоянного гистологического препарата обеспечивается просветлением и заключением препарата в специальные среды. Средой для заключения служат смола канадской основы (канадский бальзам) и пихтовая смола, употребляющиеся в виде густых растворов этих смол в ксилоле. Применение их при предварительном обезвоживании абсолютным спиртом и просветлении ксилолом. При отсутствии смол можно пользоваться дамарным лаком (60% раствор смолы деревьев рода произрастающих в Индии) или раствором канифоли в спирте, который получают из различных видов сосны. В тех случаях, когда по условиям обработки препарат не может соприкасаться со спиртом, ксилолом и т.п. (например, окраски на жиры) его заключают в среды (глицерин, глицерин-желатин), которые, кроме того, обладают просветляющими свойствами. Например, широко распространенными методами окраски препаратов является окраска гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.


^ Особенности методики приготовления постоянных гистологических препаратов некоторых органов и тканей


I. Обработка и окрашивание костной ткани. Наличие в межклеточном веществе костной ткани солей кальция придает ей твердость, затрудняющую приготовление препаратов. Поэтому обработка костной ткани включает приготовление срезов после специальной предварительной подготовки объекта - декальцинацией в водном растворе азотной кислоты 5-7% концентрации, кроме того, одним из способов получения препаратов из костной ткани является приготовление тонких костных пластинок (шлифов) из клубочков нефиксированной костной ткани путем стачивания последних. Наиболее распространенным методом окраски срезов декаль-цинированой кости является окраска по Шморлю (тионином с пикриновой кислотой), после чего общий фон срезов приобретает коричневый или болотный цвет, а костные клетки и их отростки окрашиваются в красный.

II. Приготовление тотальных препаратов. В тех случаях, когда необходимо изучить микроскопическую структуру объекта, имеющего пленочное строение (серозные, мозговые оболочки), готовят целостные тотальные препараты. Для этого участок пленки во избежание складок расправляют и фиксируют на ровной поверхности. По окончании фиксации материал обрабатывают обычным способом или, если объект сам по себе достаточно тонок и имеет естественную окраску, можно ограничиться лишь фиксацией, просветлением и заключением его (например, при выявлении пигментных клеток твердой и мягкой мозговых оболочек) или фиксацией, окрашиванием (препарат мелких сосудов мягкой мозговой оболочки).

III. Приготовление и окраска мазков крови. Для морфологического исследования клеток крови и подсчета лейкоцитарной формулы готовят мазок крови. Он должен отвечать следующим условиям: 1) начинаться на расстоянии 1 см от края предметного стекла и заканчиваться не доходя до края противоположной стороны на 2-3 см; 2) препарат должен быть равномерной толщины, а не волнообразным; 3) слой крови не должен достигать краев стекла. В противном случае в мазке эритроциты будут лежать густым сл