Реферат: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей

и благополучия человека


3.1.2 ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ


Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов


Методические указания


МУ 3.1.2…


Москва 2009

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации

__________________________________________________________________


3.1.2 ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ


Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов


Методические указания


МУ 3.1.2…


Издание официальное


Москва 2009

Термины и сокращения

СП – санитарно-эпидемиологические правила

ТИФА – твердофазный иммуноферментный анализ

МУ – методические указания

МФА – метод флуоресцирующих антител

РНГА – реакция непрямой гемагглютинации

РИД – реакция иммунодифузии

РЛА - реакция латекс-агглютинации

РСК – реакция связывания комплемента

ИФА – иммуноферментный анализ

ПЦР – полимеразная цепная реакция

МПК – минимальная подавляющая концентрация

ГЗТ – реакция гиперчувствительности замедленного типа

КОЕ – колониеобразующие единицы


^ Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 2009. - 66 с.


1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю. В. Демина, Н.Д. Пакскина), ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (В.В. Алексеев, А.В. Липницкий, М.А. Гришина, В.А. Антонов, Г.А. Ткаченко, Н.В. Вьючнова, Е.Н. Кочубеева, В.С. Лесовой, И.В. Новицкая, Т.А. Гришкина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от _______ № __).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко _________ 200__ г.

4. Введены в действие с «__» ______ 200__ г.

5. Введены впервые


Исполнители от Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека:

Демина Ю. В.

Пакскина Н.Д.


Исполнители от ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора:

Алексеев В.В.

Липницкий А.В.

Гришина М.А.

Антонов В.А.

Ткаченко Г.А.

Вьючнова Н.В.

Кочубеева Е.Н.

Лесовой В.С.

Новицкая И.В.

Гришкина Т.А.

^ Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 2009. - 66 с.


1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю. В. Демина, Н.Д. Пакскина), ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (В.В. Алексеев, А.В. Липницкий, М.А. Гришина, В.А. Антонов, Г.А. Ткаченко, Н.В. Вьючнова, Е.Н. Кочубеева, В.С. Лесовой, И.В. Новицкая, Т.А. Гришкина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от _______ № __).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко _________ 200__ г.

4. Введены в действие с «__» ______ 200__ г.

5. Введены впервые

Содержание




стр.

1 Область применения

9

2 Нормативные ссылки

9

3 Общие положения

10

3.1 Краткие сведения о возбудителях глубоких микозов

10

3.1.1 Морфологические и культурально-биохимические свойства Coccidioides spp.

13

3.1.2 Морфологические и культурально-биохимические свойства Histoplasma capsulatum

18

3.1.3 Морфологические и культурально-биохимические свойства Blastomyces dermatitidis

22

3.1.4 Морфологические и культурально-биохимические свойства Paracoccidioides brasiliensis

23

4 Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования

25

4.1 Взятие материала от человека

25

4.2 Взятие материала из объектов окружающей среды и сырья растительного происхождения

26

4.3 Направление материала на исследование

28

5 Порядок проведения исследований

29

5.1 Микроскопия и гистологическое исследование

патологического материала

29

5.1.1 Coccidioides spp.

29

5.1.2 H. capsulatum

30

5.1.3 B. dermatitidis

31

5.1.4 P. brasiliensis

31

5.2 Культуральный (микологический) метод

32

5.2.1 Coccidioides spp.

32

5.2.2 H. capsulatum

33

5.2.3 B. dermatitidis

33

5.2.4 P. brasiliensis

34

5.3 Биологический метод

34

5.4 Иммуно-серологические методы исследования

36

5.4.1 Кокцидиоидомикоз

36

5.4.2 Гистоплазмоз

38

5.4.3 Бластомикоз

40

5.4.4 Паракокцидиоидомикоз

41

5.5 Молекулярно-генетические методы исследования

41

5.5.1 Обеззараживание проб для исследования методом ПЦР

41

5.5.2 Выделение ДНК

42

5.5.3 Проведение ПЦР для специфической индикации и идентификации возбудителей особо опасных микозов

45

5.6 Идентификация культур на основе фенотипических признаков

45

5.6.1 Получение микрокультур

45

6 Выдача заключений по результатам лабораторного исследования на особо опасные микозы

46

7 Режим работы в лабораториях, работающих с микромицетами II группы патогенности (опасности)

48

8 Профилактика особо опасных микозов

50

Приложение 1 (справочное). Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации возбудителей особо опасных микозов

51

Приложение 2 Приготовление рабочих растворов и реагентов для проведения ПЦР

54

Приложение 3 (справочное) Лечение особо опасных микозов

57


Приложение 4 Схема лабораторной диагностики глубоких

микозов

65



^ 1 Область применения


1.1 Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, имеющих разрешение на работу с микроорганизмами II группы патогенности, независимо от организационно-правовой формы.

1.2 В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на инфицированность возбудителями особо опасных микозов, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию микромицетами II группы патогенности.


2 Нормативные ссылки

Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». – М., 2003.

2.2 Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». – М., 1996

2.3 Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. Методические указания МУ 1.3.1794-03 . – М., 2004.

2.4 Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. Методические указания МУ 3.5.5.1034-01. - М., 2001.

2.5 Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики. Методические рекомендации. - МЗ РФ, ЦНИИЭ. – М., 2004.

2.6 Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. Методические рекомендации МР 0100/0556-04-34, Москва.-2005 г.


^ 3 Общие положения


3.1 Краткие сведения о возбудителях особо опасных микозов

Возбудители особо опасных микозов – это первичные грибные патогены. К ним относят грибы рода ^ Coccidioides (C.immitis, C.posadasii), Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis и Paracoccidioides brasiliensis. Общим для всех особо опасных микозов является то, что они принадлежат к категории «респираторных», т.е. основной путь инфицирования – аэрогенный.

В соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами возбудители кокцидиоидомикоза (C.immitis и C.posadasii), гистоплазмоза (H.capsulatum), бластомикоза (B.dermatitidis) и паракокцидиоидомикоза – (P.brasiliensis) относятся ко второй группе патогенности (опасности).

Существующее таксономическое положение этих возбудителей представлено в таблице 1.

Таблица 1

Таксономическая систематика возбудителей особо опасных микозов

Царство

Fungi

Отдел

Ascomycota

Класс

Euascomycetes

Порядок

Onygenales

Семейство

Onygenaceae




Род

Coccidioides

Вид

анаморфа*

телеоморфа**

^ Coccidioides immiis [Rixford

and Gilchrist, 1896];

Coccidioides posadasii [Fisher, Koenig, White et Taylor, sp. nov.]

не установлена




Род

Histoplasma

Вид

анаморфа*

телеоморфа**

^ Histoplasma capsulatum var. capsulatum [Darling, 1906];

H. capsulatum var. duboisii [Dubois and Vanbreuseghem, 1956]

Ajellomyces capsulatum

[Kwon-Chung Vc.Ginnis and Katz , 1979]




Род

Blastomyces

Вид

анаморфа*

телеоморфа**

^ Blastomyces dermatitidis [Cilchrist abd Stokes, 1898]

Ajellomyces dermatitidis

[Mc. Donough and Lewis, 1968]




Род

Paracoccidioides

Вид

анаморфа*

телеоморфа**

^ Paracoccidioides brasillensis [Splendore de Almeida, 1930]

не установлена


Примечание: * - бесполое состояние гриба;

** - половая или совершенная форма гриба


Возбудители особо опасных микозов диморфны: во внешней среде они существуют в виде мицелиальной (сапробной) формы, а в организме человека и животных из мицелиальных элементов образуются тканевые (паразитические) формы гриба.

Первичные грибные патогены занимают дискретные экологические ниши. Наиболее вирулентные из них - возбудители кокцидиоидомикоза C.immitis и C.posadasii обитают в почвах юго-запада США, в Мексике и в других странах Центральной и Южной Америки. H.capsulatum var. capsulatum регистрируется во многих странах мира, но его высокоэндемичные очаги расположены в США вдоль реки Миссисипи. Вариант гриба - H. capsulatum var. duboisii встречается, в основном, в Африке. Возбудитель бластомикоза B. dermatitidis выявляется в почвенных микроочагах многих стран мира, но обитает преимущественно в юго-восточных, центральных и средне-западных штатах США, а также в Канаде, Мексике, странах Центральной и Южной Америки. Почвенные очаги P.brasiliensis ограничены Центральной и Южной Америкой, причем наибольшее распространение возбудитель паракокцидиоидомикоза имеет в бассейне реки Амазонки.

Пыльные бури, интен­сивное земледелие, археологические раскопки, проведение полевых военных учений способствуют повышению числа инфицированных и, соответственно, клинически выраженных случаев. Пребывание в эндемичной зоне туристов обусловливает вынос инфекции на другие территории, в том числе за пределы эндемичных очагов. Однако, передача особо опасных микозов от человека человеку не происходит, образование новых почвенных очагов не зафиксировано, по­этому вне эндемичных зон болезнь не укореняется.

Истинную встречаемость в мире особо опасных микозов сложно опре­делить в связи с трудностью их диагностики, однако предполагается, что ежегодная инфицированность этими возбудителями людей в эндемичных районах составляет сотни тысяч человек.

Необходимо подчеркнуть, что аэрогенный способ заражения особо опасными микромицетами является естественным, поэтому использование аэрозоля спор этих грибов обеспечивает заражение большого количества людей. Инфекциозность спор очень высокая, однако развитие первичной легочной инфекции напрямую зависит от инфицирующей дозы возбудителя.

Входными воротами инфекции являются легкие. Внедрение возбудите­лей особо опасных микозов приводит к формированию очага воспаления. Первичный процесс в легких у большинства инфицированных заканчивается самопроизвольным выздоровлением с рубцеванием гранулёмы. У большинства больных выздоровление не сопровождается какими-либо оста­точными явлениями в легких, но у 2-5 % регистрируются узелки или полос­ти.

При гематогенной диссеминации ^ Coccidioides spp. чаще пора­жаются кожа, кости, суставы, оболочки головного мозга, а также селезенка, печень, почки, надпочечники.

Диссеминированный гистоплазмоз встречается очень редко и развива­ется у больных с иммунодефицитом, детей и ослабленных пожилых лиц. Для диссеминированной формы африканского гистоплазмоза характерно дли­тельное течение с преобладанием поражений костей и ко­жи.

При бластомикозе наиболее характерна диссеминация в кожу. Часто отмечается поражение костей, реже — органов мочевыводящей и половой систем, центральной нервной системы.

При паракокцидиоидомикозе вторичная диссеминация с поражением различных органов отмечается у 79 % взрослых больных. Наиболее харак­терны поражения слизистых оболочек и кожи, а также шейная лимфоаденопатия.

Человек не обладает естественным иммунитетом к данным грибам, поэтому восприимчивость населения считается всеобщей. Эффективность иммунного ответа на инфицирование грибами зависит от защитых факторов макроорганизма, важная роль в которых принадлежит факторам Т-клеточного иммунитета.

Гуморальные (комплементсвязывающие, преципитирующие) антитела не являются показателями защиты, а лишь характеризуют ответную реакцию иммунной системы на попадание в организм антигенов грибов. Более того, выраженный гуморальный ответ в виде специфических иммуноглобулинов (особенно IgG) свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания.

Продолжительность болезни широко варьирует от нескольких недель до одного года. Описаны формы продолжительностью 4-8 и даже 16 лет. Длительность и интенсивность лечения зависят от формы заболевания, в особо тяжелых случаях прием антифунгальных препаратов – пожизненный.

Установление лабораторного диагноза микозов связано с длительным процессом культивирования грибов и их идентификации путем доказательст­ва диморфизма (получение мицелиальной и тканевой фаз).

^ 3.1.1 Морфологические и культурально-биохимические свойства Coccidioides spp.

Грибы рода Coccidioides характеризуются продукцией нитчатых (мицелиальных) форм в период развития сапробной фазы во внешней среде (преимущественно, в почве) или при выращивании в условиях пониженной температуры (ниже 30 0С) на питательных средах. Конверсия в дрожжеподобную форму (сферулы) происходит во время паразитической фазы, т.е. после внедрения в организм животного (человека) или при инкубации на обогащенных питательных средах в условиях повышенной температуры (34-41 0С) и наличия углекислого газа.

Мицелиальная форма Coccidioides характеризуется образованием септированных гиф и толстостенных артроконидий (артроспор) диаметром 2-4 мкм, которые образуются по длине гиф внутри самого мицелия. Артроконидии обычно разделены «пустыми» тонкостенными, хрупкими клетками-разобщителями, образуемыми путем аутолиза чередующихся конидий внутри гифы. Таким способом артроконидии легко высвобождаются в воздух при нарушении верхних слоев почвы и ветре. При ингаляции в легкие или в редких случаях после чрезкожной имплантации в ткани каждая артроконидия трансформируется в новую многоядерную, округлую структуру, называемую сферулой. Сферулы увеличиваются в размерах и формируют толстую наружную стенку. По мере роста сферула начинает разделяться внутри путем инвагинации и образования разделяющих бороздок, что приводит к продукции многочисленных одноядерных эндоспор. Сферулы варьируют в размерах от 60 до 100 мкм и более в диаметре, тогда как размеры эндоспор остаются в пределах 2-5 мкм. Зрелые сферулы могут содержать от 800 до 1000 эндоспор, которые высвобождаются в ткани при разрыве сферулы. В своей паразитической фазе каждая эндоспора вырастает в новую сферулу.

Сферулы могут быть получены in vitro на специальных питательных средах (например, среда Конверса) в атмосфере повышенного содержания углекислого газа. Добавление к специальным питательным средам поверхностно-активных веществ, а также биотина, тирозина, фенилаланина, триптофана и пирокатехина ускоряет созревание сферул. Тем не менее, культуральные сферулы, как правило, гораздо меньше тканевых (до 30 мкм, реже 50 мкм) и содержат небольшое количество эндоспор.

Спороносный аппарат состоит из прямоугольных или бочонкообразных, длиной 3-6 мкм, диаметром 2-3 мкм артроспор (артроконидий), образующихся из концевых ветвей мицелия в процессе уплотнения отдельных клеток. Иногда по ходу мицелия или на его концах встречаются крупные (диаметром 8-24 мкм) хламидоспоры. Однако, этот тип спороношения не характерен для рода Coccidioides. Скорость образования артроспор на плотных средах варьирует от 4-5 до 15 дней и больше; встречаются слабо спорулирующие штаммы. В подходящих условиях из артроспоры в течение 1 сут развивается ветвящийся, септированный мицелий с характерным спорообразованием в дальнейшем.

Культуры рода Coccidioides хорошо растут на плотных и жидких средах с углеводами, на овощных и синтетических средах. При температуре 37 0С на щелочных (рН 7,2-7,4), богатых белками субстратах вырастают кожистые, почти лишенные воздушного мицелия мягкие, желтовато-коричневого цвета колонии. На более кислых средах (рН 6,5-6,8) при 28-30 0С хорошо развивается воздушный мицелий; колонии выглядят пушистыми, беловатыми, а на высоте спорообразования – мучнистыми. В некоторых колониях наблюдают концентрические зоны пушистого мицелия. Вариации колоний гриба были описаны как внутри одного штамма на разных средах, так и между разными штаммами на одной и той же среде.

В качестве источников питания возбудитель кокцидиоидомикоза использует моно-, ди- и полисахариды, окисляя, но не сбраживая их. Растет на средах с солями молочной и уксусной кислот, но при этом рост сильно угнетен; лимонную, щавелевую и виннокаменную кислоты практически не усваивает; клетчатку не разлагает. Хорошо развивается на средах, содержащих олеиновые кислоты, свиной жир, оливковое масло; использует этиловый спирт. Растет на белковых субстратах, свернутой сыворотке, на кровяном агаре, нередко с гемолизом; усваивает пептон и многие аминокислоты: аспарагин, цистин, аланин; глицерин и др.; растет на средах с мочевиной, сульфатом или хлоридом аммония. Протеолитическая активность гриба довольно яркая: он интенсивно разжижает желатин и казеин, свернутую лошадиную сыворотку; пептонизирует и коагулирует молоко. Не восстанавливает нитраты в нитриты; не образует индола и сероводорода. Гриб растет на минеральных питательных средах с различными источниками азотистых веществ и углерода; развивается на водных вытяжках из различных образцов почвы, растет на овощах и увлажненных кусочках дерева. Дрожжевой экстракт как единственный источник питания в агаровых средах стимулирует рост и более раннее образование артроспор.

Гриб устойчив к воздействию практически всех антибактериальных антибиотиков. Это свойство используют в практической микологии для освобождения от микробной флоры подлежащих исследованию объектов внешней среды и материала от больных.

Оптимальным рН для гриба является 6,8, но диапазон, при котором он растет, варьирует от 6,5 до 7,4. Температура инкубации также может колебаться от комнатной до 41 0С, оптимум – 25-30 0С, однако, даже при 4 0С отмечается медленный рост гриба и созревание артроспор.

В мицелиальной фазе роста гриб является аэробом, но может расти и в условиях недостатка кислорода (факультативный анаэроб). В тканях организма хозяина при отсутствии атмосферного кислорода тканевая форма гриба проявляет свойства микроаэрофила, для которого достаточно того количества кислорода, которое доставляется в ткани гемоглобином крови. При культивировании тканевой формы гриба in vitro предпочтительной является инкубация в атмосфере, содержащей от 20 до 40 % углекислого газа.

Грибы рода Coccidioides включены в число потенциальных агентов биотерроризма. В то же время, значимость возбудителей кокцидиоидомикоза как агентов биотерроризма снижается в связи с тем, что большинство случаев инфицирования заканчивается выздоровлением, инкубационный период (обычно 10-16 дней) слишком продолжительный, не существует вакцин для защиты тех, кто может использовать эти микромицеты в качестве объектов биотеррора. Тем не менее, существует мнение о возможности использования артроконидий Coccidioides как векторов доставки опасных биотоксинов.

Факторы патогенности гриба до сих пор изучены недостаточно. Физические и химические свойства самой клетки гриба (артроспоры) обеспечивают возможность ее проникновения глубоко в альвеолы, а наличие «усиков, орнамента» у спор способствует их фиксации на клетках альвеолярного эпителия.

Наличие в клеточной стенке мицелия и артроспор большого количества хитина и липидов при сравнительно большой величине клеток обеспечивает гидрофобность клеточной стенки гриба, что затрудняет захват и переваривание (в связи с отсутствием в организме млекопитающих фермента хитиназы) фагоцитированных клеток. Эти же факторы обусловливают длительную персистенцию гриба в тканях. Вследствие незавершенности фагоцитоза скорость репродукции гриба в организме (конверсия в сферулы) превышает скорость его переваривания. Кроме того, в составе клеточной стенки тканевой фазы возбудителя кокцидиоидомикоза обнаружены адгезины, которые являются одним из факторов вирулентности этого гриба. Клеточная стенка содержит белки, обладающие иммуносупрессивным действием, что приводит к подавлению синтеза гуморальных антител.

Протеолитические ферменты Coccidioides, в частности протеиназы, использующие в качестве субстратов коллаген, эластин и лецитин, способствуют внедрению и распространению возбудителя, вызывая локальные разрушения тканей, подавляя иммунные реакции макроорганизма, а также лизируя оболочки зрелых сферул и окружающую ткань во время высвобождения эндоспор. Кроме того, в экстрактах клеток гриба обнаружена активность изоцитратлиазы и малатсинтетазы – основных ферментов глиоксилатного цикла, которые способствуют прорастанию артроспор при вегетативном цикле размножения гриба. Клеточная стенка Coccidioides содержит ряд гидролаз, которые обеспечивают конверсию артроспор в сферулы в организме млекопитающих.

Грибы рода Coccidioides, как и другие диморфные микромицеты, способны выделять белки, которые связывают половые гормоны, прежде всего эстроген.

Истинных токсинов у гриба не найдено, однако токсические свойства мицелиальной и тканевой форм гриба выявлены при его введении внутрибрюшинно белым мышам в смеси с 5 % муцина. У возбудителя кокцидиоидомикоза обнаружено цитолитическое, цитотоксическое действие на клеточные элементы крови, лейкоциты периферической крови; токсическими для белых мышей при введении с муцином оказались культуральный фильтрат гриба и полисахарид, извлеченный из него, различные типы кокцидиоидинов (мицелиальный и сферульный). Установлены токсические свойства входящих в состав Coccidioides липидов, экстрагированных этанолом, которые вызывали гибель белых мышей. Токсичными оказались и липиды, извлеченные смесью этанол-хлороформ.

^ 3.1.2 Морфологические и культурально-биохимические свойства Histoplasma capsulatum

В естественных условиях обитания, а также в лабораторных условиях при 25-27 °С гриб растет в виде септированного, многоклеточного мицелия диаметром от 1 до 5 мкм. Молодой мицелий гомогенный, по мере старения в нем становятся видны вакуоли и жировые включения. Через 5-10 дней после посева в зависимости от штамма, состава питательной среды и условий культивирования начинается споруляция. Образующиеся споры бывают двух типов: макро- и микроконидии. Макроконидии – крупные (до 15-25 мкм) шиповатые или бугристые, сферические или грушевидные споры. Они образуются в воздушной части мицелия обычно на конце его коротких отростков, но могут быть сидящими на конце длинной гифы. Бугорки или шипики макроконидий имеют длину от 1 до 5-8 мкм. В субстратной части мицелия преобладают макроконидии, не имеющие бугристости. В слое мицелия, вросшем в агар, иногда отмечается образование спор, тело которых окружено ободком субстанции. Это так называемые нимбоспоры.

Другим типом спор, образуемых H.capsulatum, являются микроконидии. Это обычно гладкостенные споры сферической, грушевидной или сигарообразной формы, 2-6 мкм в диаметре, расположенные на короткой боковой гифе терминально. Иногда в культуре можно наблюдать небольшое количество микроконидий, которые в точности воспроизводят по внешнему виду макроконидии, за исключением размера.

Споруляция H.capsulatum зависит от штамма, условий выращивания и состава питательной среды. Одни штаммы продуцируют преимущественно макроконидии, другие на этой же среде – микроконидии. У некоторых штаммов градация размера от микро- к макроконидии изменяется так постепенно, что четкого разграничения между ними сделать нельзя. Штамм, который продуцирует гладкие макрокониидии на одной среде, может образовывать бугристые – на другой. В общем, преобладают мелкие споры, диаметром менее 5 мкм. Они наиболее легко проникают в альвеолы и, конверсируя в дрожжевую фазу, вызывают заболевание. Все первичные изоляты H.capsulatum можно разделить на 2 типа: Albus – белый, с преобладанием гладких макроконидий и широким воздушным мицелием и Brown – коричневый, с массой типичных окрашенных бугорчатых макроконидий. Последние – характерный специфический признак H.capsulatum. Промежуточные типы (С и Д) встречаются реже.

Почти все штаммы гриба при первичном выделении из клинического материала образуют типичные бугристые макроконидии, что очень важно с точки зрения диагностики. При длительном культивировании музейных штаммов гриба на одной и той же питательной среде происходит потеря этого морфологического признака. Это затрудняет идентификацию выросших культур. Предложены разнообразные способы стимулирования продукции бугристых макроконидий. Среди них наиболее часто используют пересев культуры на картофельный агар с 2 % глюкозы, агар Сабуро с фосфорно-кислыми солями натрия или калия. Цельная кровь, температура инкубации выше 30 0С отрицательно влияют как на рост, так и споруляцию мицелиальной фазы. Оптимальным является рН 6,5-7,5. Споруляция может быть усилена добавлением к питательным средам углеводов и источников азота. На среде с углеводами в присутствии аспарагина наблюдается обильное макроконидиальное спороношение, в присутствии KNO3 отмечается наличие спор обоих типов, в присутствии же сульфата аммония преобладают гладкостенные макроконидии и микроконидии. Восстановление формирования типичных бугристых макроконидий может быть достигнуто пересевом культуры на среды, содержащие экстракты из перьев птиц, в стерильную почву или пассажем культуры через организм восприимчивых животных (мыши, золотистые хомячки).

Дрожжеподобная фаза гриба in vitro может быть получена лишь выращиванием при 37 0С на специальных питательных средах, содержащих цистеин. Колонии гриба имеют беловатую, желтоватую или кремовую окраску. Они выпуклой формы, имеют пастообразную консистенцию. Поверхность колоний гладкая, морщинистая, церебриформная, в зависимости от возраста культуры. Зрелые колонии обычно формируются спустя 7-10 сут после посева из клинического материала. Под микроскопом – клетки молодой культуры дрожжеподобной фазы. Это овальные тельца овоидной формы 1,5-2,0 х 3,0-3,5 мкм. У активно растущих клеток один полюс заострен. Почки могут образовываться на одном из двух полюсов, реже аполярно. Из каждой материнской клетки могут образовываться до 3 почек, они повторяют ее форму, имеют ясно выраженную оболочку, но меньше размером.

Дрожжеподобная фаза гриба, полученная in vitro, не совсем идентична форме, паразитирующей в тканях хозяина. Клетки последней меньше, чем полученные в культуре. Величина клеток, в зависимости от способа окраски, варьирует от 1 до 4 мкм в диаметре.

Мицелиальная фаза гриба слабо активна в биохимическом отношении. Она очень медленно (и не всегда) разжижает желатин, не разлагает целлюлозу, не гидролизует альбумин, не изменяет молоко, не образует сероводорода, ацетона или индола, но восстанавливает нитраты в нитриты и гидролизует жиры.

Дрожжеподобная фаза при росте на углеводах не образует ни кислоты, ни газа, но восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индола, не гидролизует крахмал, целлюлозу и не действует на молоко. В общем, дрожжевая фаза более требовательна к составу питательной среды, чем мицелиальная. Зависимость ее от содержания в среде серусодержащих аминокислот позволяет заключить, что она не способна к синтезу этих веществ, являющихся для нее факторами роста.

Ферментативная активность возбудителя гистоплазмоза вряд ли может быть использована в практических целях. Тем не менее, на основании изучения группы гидролитических ферментов показано, что возбудитель гистоплазмоза не обладает плазмокоагулирующей способностью, не проявляет фибриногенолитической активности, но медленно гидролизует азоколл – денатурированный коллаген, который широко используется для определения протеолитической активности таких ферментов, как трипсин, панкреатин и коллагеназа.

Патогенность ^ H. capsulatum, в первую очередь, обусловлена химическим строением клеточной стенки. Наличие в клеточной стенке мицелия и спор гриба большого количества хитина и липидов обеспечивает гидрофобность клеточной стенки возбудителя, что затрудняет захват и переваривание (из-за отсутствия в организме млекопитающих фермента хитиназы) фагоцитированных клеток гриба, и обусловливает незавершенность самого фагоцитоза с вытекающими из этого последствиями (как и при кокцидиоидомикозе). Полисахариды, входящие в состав клеточной стенки H. capsulatum, в частности α-1,3-глюкан также играют важную роль в патогенезе гистоплазмоза.

Одним из главных факторов патогенности ^ H. capsulatum, так же, как и у других диморфных грибов, является способность к образованию тканевой формы, которая более устойчива к действию антимикотиков. Наиболее значимыми стимулами конверсии H. capsulatum в дрожжевую фазу считаются сульфгидрильные группы, представленные цистеином или другими аминокислотами в составе различных белков.

Особенный интерес представляют механизмы защиты гриба от лизиса внутри макрофагов. Клетки ^ H. capsulatum способствуют снижению кислотности среды внутри фаголизосомы до уровня, подавляющего активность кислых гидролаз, но при этом не влияющего на количество ионов железа, необходимых для роста возбудителя.

Кроме того, в составе клеточной стенки возбудителя гистоплазмоза обнаружены адгезины, которые являются одним из факторов патогенности этого гриба. Клеточная стенка также содержит белки, обладающие иммуносупрессивными свойствами, что приводит к подавлению ответных иммунологических реакций.

Истинных токсинов у возбудителя гистоплазмоза не найдено, однако вирулентность обеих фаз гриба повышается при его внутрибрюшинном введении белым мышам в смеси с 5 % муцина. У возбудителя гистоплазмоза обнаружено цитолитическое, цитотоксическое действие на клеточные элементы крови, лейкоциты периферической крови.

Размер спор возбудителя гистоплазмоза играет немаловажную роль в патогенезе заболевания. Микроконидии проникают глубоко в альвеолы, тогда как макроконидии чаще выводятся из дыхательных путей их мерцательным эпителием. Наличие у конидий шипов способствует их фиксации на клетках альвеолярного эпителия.

^ 3.1.3 Морфологические и культурально-биохимические свойства Blastomyces dermatitidis

В природных условиях и при комнатной температуре (20-25 °С) на среде Сабуро с глюкозой вырастают колонии ^ 5.1 Микроскопия и гистологическое исследование патологического материала 5.1.1 Coccidioides spp.
Микроскопию исследуемого материала от больных проводят чаще в препаратах по типу «раздавленной капли». Для окраски микробиологических препаратов применяют калькофлуор белый, возможно использование 10% гидроксида калия для просветления патологического материала. Однако гриб, ввиду наличия толстой светопреломляющей оболочки, может быть виден и в нативных препаратах. Дополнительные методы окраски, как правило, применяются при гистологическом исследовании, при этом чаще всего используется гематоксилин-эозин. Иногда для четкой визуализации сферул требуются специфические виды окраски, такие как серебрение по Гомори-Грокотт и PAS-реакция.

В патологическом материале грибы рода Coccidioides обнаруживаются в виде сферул, которые представляют собой крупные, круглые образования, напоминающие спорангии фикомицетов. Стенка их толстая, двухконтурная. Размеры сферул варьируют от 10 до 200 мкм, в среднем, 60-80 мкм. В зависимости от стадии развития сферулы могут быть пустыми или содержащими эндоспоры (2-4 мкм в диаметре).

При микроскопировании материала, полученного из окружающей среды, гриб выглядит как тонкий, септированный, ветвящийся мицелий, боковые ответвления которого дают начало одноклеточным бочковидным артроконидиям (3-4 х 3-6 мкм), чередующимся с пустыми клетками-дизъюнкторами.

^ 5.1.2 H. capsulatum

Микроскопическое исследование патологического материала в диагностике гистоплазмоза имеет вспомогательное значение ввиду отсутствия специфических признаков тканевой формы возбудителя. Гриб в патологическом материале имеет вид мелких (2-3 мкм в диаметре) почкующихся клеток овальной или яйцевидной формы. Почки (2-3) располагаются, как правило, по полюсам родительской клетки. После обработки патологического материала по общим правилам, с целью его просветления, готовят препарат по типу «раздавленной капли» и просматривают в микроскопе под иммерсией. Однако ввиду малых размеров тканевой фазы возбудителя и его внутриклеточного расположения, гриб в неокрашенных препаратах обнаруживают редко. Исключением является материал, взятый со стенок каверн, в которых гриб находится в мицелиальной фазе. В таких препаратах можно обнаружить тонкий септированный мицелий и типичные бугристые или шиповидные макроконидии размером до 10-20 мкм.

Более обнадеживающие результаты могут быть получены при исследовании материала (мазки крови, осадок спинномозговой жидкости, пунктаты печени, селезенки, лимфоузлов, костного мозга), окрашенного одним из гематологических красителей: краской Романовского-Гимза, Лейшмана, Райта, Май-Грюнвальда. При микроскопии гриб виден в цитоплазме фагоцитов в виде мелких базофильных телец, окруженных бесцветным ореолом, который раньше принимали за капсулу.

^ 5.1.3 B. dermatitidis

При микроскопическом исследовании патологического материала следует обращать внимание на почкующиеся клетки, для которых характерна прочная связь между родительской и дочерней клетками с помощью широкого основания. Фактически может появляться вторая и третья почки до того как отделится первая, так что иногда можно видеть глыбки из 1-4 клеток. От грибов рода Candida возбудитель бластомикоза отличается большей величиной клеток и отсутствием псевдомицелия, от возбудителя паракокцидиоидомикоза – отсутствием почкообразования в виде "короны", от воз­будителя кокцидиоидомикоза – отсутствием сферул, от возбудителей актиномикоза - отсутствием друз.

При кожной форме вскрывают милиарный абсцесс и острым скальпелем выдавливают каплю гноя. Смешивают его с равным коли­чеством 10-15% гидроксида натрия или калия на предметном стек­ле, накрывают покровным стеклом и исследуют под малым и большим увеличением микроскопа. Внешний вид гриба в дрожжевой фазе, в том числе и в патологическом материале, описан выше.

Для лаборато