Реферат: Українська академія аграрних наук

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ ПТАХІВНИЦТВА


На правах рукопису


Шаповалов Сергій Олегович


УДК 57.05: 577.121: 591.3: 636.082.474


ОСОБЛИВОСТІ становлення антиоксидантного захисту та вплив Мікотоксинів на організм птиці в онтогенезі


03.00.04 – фізіологія людини і тварин


Дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук


Науковий керівник: Іонов Ігор Анатолійович,

доктор сільськогосподарських наук


Харків – 2003

ЗМІСТ




Стор.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ І ТЕРМІНІВ ……….……

2

ВСТУП ...........................................................................................................……

5

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ..............................................................……

12

1.1

Окислювально-відновний гомеостаз в організмі тварин і птиці і його біологічне значення ..................................................…………………...

12

1.2

Антиоксидантна система захисту клітинних структур в організмі тварин .......................................................................................…………...

15

1.2.1

Біологічна роль антиоксидантних ферментів ..................................……

15

1.2.2

Антиоксидантний ефект вітамінів А, Е, С в організмі тварин і птиці

19

1.3

Формування антиоксидантної системи птиці в онтогенезі .............…...

26

1.4

Вплив мікотоксинів на організм птиці та їхнє потомство .............…….

31

1.4.1

Особливості антиоксидантного статусу організму при мікотоксикозах і способи його корекції ...........................................……………………...

34

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА …………………………………………

39

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ ..................................……

39

2.1 Схема досліджень ...............................................................................…….

40

2.2 Методи досліджень ............................................................................….…

45

2.3 Характеристика використаних реактивів .........................................…….

49

РОЗДІЛ 3. ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ..............................……

50

3.1

Вікові та тканинні особливості функціонування антиоксидантної системи у птиці в ембріогенезі ...........................................……………

50

3.1.1

Динаміка вмісту вітамінів А, Е, С в організмі ембріонів різних видів птиці ..........................................................................................…………..

50

3.1.2

Тканинні особливості активності антиоксидантних ферментів у ембріонів різних видів птиці ............................................................…...

57

3.1.3

Видові особливості розвитку ферментативної антиоксидантної системи ембріонів сільськогосподарської птиці ...................…………

63

3.2

Видові особливості розвитку антиоксидантної системи дорослої птиці ……………………………………………………………………...

68

3.3

Вплив мікотоксинів на антиоксидантну систему ембріонів курей і дорослї птиці ........................................................................……………..

70

3.3.1

Вплив Т-2 токсину, зеараленону, аурофузарину на інтенсивність ПОЛ і активність антиоксидантних ферментів ....................……….…

71

3.3.2

ВітаміВітамінна забезпеченість організму курей при мікотоксикозах ..…….

75

3.3.3

Стан клітинних мембран при мікотоксикозах .........................…….….

77

3.4

Вплив Т-2 токсину на перекисне окиснення ліпідів в умовах in vitro

81

3.5

Засоби підвищення антиоксидантного статусу організму курей при Т-2 токсикозі ......................................................................……………...

88

3.5.1

Застосування пробтіотиків при Т-2 токсикозі ..................................….

88

3.5.2

Використання підвищених доз вітамінів Е, С та селену при Т-2 токсикозі .......................................................................................….…...

94

3.5.3

Вплив мікроелементних композицій на антиоксидантний статус курей при Т-2 токсикозі .....................…………………………….…….

101

РОЗДІЛ 4. УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ ………………

120

ВИСНОВКИ ........................................................……………………

…………………...

130

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ .....................................................……

132



^ СПИСОК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ І ТЕРМІНІВ

АК - аскорбінова кислота

АФК - активні форми кисню

АО-система - антиоксидантна система

ВРО - вільно-радикальне окиснення

ДАК - дегідроаскорбінова кислота

ДК - дієнові кон'югати

МДА - малоновий діальдегід

О˙– - супероксидний аніон-радикал

ПНЖК - поліненасичені жирні кислоти

ПОЛ - перекисне окиснення ліпідів

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК - тіобарбітурова кислота

GSH - глутатіон відновлений

GSHG - глутатіон окиснений

GSH-R - глутатіонредуктаза

GSH-S-T - глутатіон-S-трансфераза

GPx - глутатіонпероксидаза

Hb - гемоглобін

NAD - нікотинамідаденіндинуклеотид окиснений

NADH - нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений

NADP+ - нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат окиснений

NADPH - нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат відновлений

R - вільний радикал

ROOH - гідропероксид


^ ВСТУП

Актуальність теми. Проблема підвищення адаптивності організму і регуляції гомеостазу залишається однією з головних в сучасній біології. Інтенсивність вільнорадикальних процесів в організмі і вплив на них різних факторів свідчить про те, що їх роль знаходить найбільший прояв у тих біологічних системах, де швидкість метаболізму найбільш висока. Показано, що зсув балансу антиоксиданти-прооксиданти у бік останніх відбувається для різних, так званих, “критичних” етапів онтогенезу тварин, зокрема птиці [116], під впливом різних факторів: ксенобіотиків [29], мікотоксинів [213], важких металів [44], канцерогенів [13] оксидативного стресу [46], інфекційних та запальних процесів [4], а також старінні [156]. Метаболічні порушення значною мірою впливають на протікання фізіологічних процесів, а стан антиоксидантної системи виступає в ролі одного з найбільш інтегральних критеріїв якості навколишнього середовища. У зв'язку з цим, розкриття сутності функціональних змін в організмі та пошук засобів впливу на клітинний гомеостаз є важливою проблемою.

Основним шляхом попередження порушень є забезпечення високої активності системи антиоксидантного захисту організму [42]. Функціонування антиоксидантної системи поряд із системами детоксикації, репарації, імунною системою закріплено генетично і має кілька шляхів реалізації, зокрема, підвищенню активності антиоксидантної системи сприяє застосування природних антиоксидантів – вітамінів А, Е, С та каротиноїдів [42, 228], мікроелементів [61], а також пробіотиків - добавок живих мікроорганізмів, здатних знижувати негативну дію ксенобіотиків та ендогенних метаболітів, що активують процеси окиснення [100]. З огляду на темпи забруднення навколишнього середовища ксенобіотиками, в тому числі мікотоксинами, більшість з яких негативно впливають на метаболізм, підвищуючи рівень продуктів перекисного окиснення ліпідів у тканинах, проведення досліджень є актуальним. Також велике практичне значення має підтримка високого рівня антиоксидантного захисту організму в ембріональному періоді його розвитку і ранньому постнатальному онтогенезі, коли відбувається закладка захисних систем організму. Дані про динамічність стану прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в організмі сільськогосподарських тварин, особливо птиці, дуже обмежені як кількістю публікацій, так і досліджених показників. Нестійка (рухлива) рівновага між перекисним окисненням ліпідів (ПОЛ) і активністю антиоксидантних механізмів притаманна всім рівням організації живих систем. Вона зміщена вправо в стані фізіологічного спокою, звичайної життєдіяльності. Під впливом сильних подразників процеси біологічного окиснення зміщують рівновагу вліво, у напрямку активації ПОЛ [235]. Продуктивні якості сільськогосподарської птиці обумовлюються різноманітними факторами, у тому числі і негативними, до яких можна віднести ряд різних ксенобіотиків, ендогенних метаболітів, що активують вільнорадикальні процеси, зокрема перекисне окиснення ліпідів біомембран [235]. Активація систем перекисного окиснення ліпідів в організмі спостерігається не тільки при патологічних, а і при нормальних фізіологічних процесах, зокрема, при підвищенні інтенсивності обміну речовин (висока несучість птиці, швидкий приріст маси тіла курчат-бройлерів та ін.). Одночасно, перекисне окиснення ліпідів є важливим моментом в етіології розвитку цілого ряду захворювань людини і тварин [119]. Підвищена інтенсивність вільнорадикального окиснення ліпідів призводить до таких порушень, як дестабілізація мембран, інактивація ферментів, інгібування ділення клітин, що відразу ж позначається на продуктивності птиці, і в першу чергу відтворних якостях [120]. На даний час все більше підтвердження знаходить гіпотеза, що активація ПОЛ є початковою ланкою відповіді організму на стрес-фактор [10]. Крім того, підвищення активності перекисного окиснення ліпідів є пусковим механізмом дії більшості мікотоксинів [213].

Найбільш вірогідний механізм антиоксидантної профілактики стресу – зменшити первинну продукцію ПОЛ. Таким чином, контроль за антиоксидантним статусом організму птиці дозволити своєчасно профілактувати порушення обміну речовин, попереджати розвиток багатьох патологічних процесів і, відповідно, зниження продуктивності, а також підвищити ефективність вакцинацій і резистентність до інфекційних захворювань. Ефективним шляхом запобігання активації процесів перекисного окиснення ліпідів та стимуляції антиоксидантної системи є використання різних біологічно активних речовин, антиоксидантів та пробіотиків у раціоні птиці. Дія ксенобіотиків на організм сільськогосподарської птиці достатньо не вивчена. Тому актуальним є одночасне вивчення особливостей стану як антиоксидантної системи, так і інтенсивності перекисного окиснення ліпідів, що характеризує про-антиоксидантну рівновагу, у тканинах птиці в динаміці надходження ксенобіотиків до організму. Крім того, вивчення динаміки ферментативного та неферментативного антиоксидантного захисту організму в ембріогенезі, ранньому постнатальному онтогенезі і корекція вільнорадикальних порушень при дії мікотоксинів має важливе практичне значення в плані підвищення продуктивних якостей птиці і зниження негативного впливу токсинів корму. Вивчення цих питань має теоретичне і практичне значення для розуміння механізмів регуляції гомеостазу організму.

Доцільними є дослідження антиоксидантної системи основних видів сільськогосподарської птиці (курей, індиків, качок, гусей, перепелів), які відрізняються як живленням та інтенсивністю розвитку, так і протіканням різних фізіологічних процесів.

Підсумовуючи вищезазначене, для розробки засобів, спрямованих на підвищення антиоксидантного статусу організму сільськогосподарської птиці, необхідно провести, перш за все, вивчення динаміки активності ключових антиоксидантних ферментів та ряду нативних антиоксидантів в ембріогенезі і у дорослої птиці, дослідження аліментарного впливу різних ксенобіотиків, що потребує проведення відповідних експериментів. Висвітлення окремих ланок цього впливу є актуальним і важливим з точки зору пізнання механізмів антиоксидантного захисту та розвитку мікотоксикозів птиці. Отримані результати дозволять проводити прогнозування біологічних порушень при надходженні ксенобіотиків до організму і обґрунтовувати нові напрямки наукових досліджень, стануть теоретичною основою для розробки засобів, спрямованих на інтенсифікацію детоксикуючих ефектів.


Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Дана робота є складовою частиною досліджень, виконаних згідно з планом науково-дослідних робіт відділу фізіології, біохімії та живлення птиці Інституту птахівництва УААН протягом 1995-2000 рр. у межах виконання завдань: “Вивчити особливості розвитку антиоксидантної системи в сільськогосподарської птиці в ембріогенезі та ранньому постнатальному онтогенезі”, № державної реєстрації 0197V009424.
^ Мета і завдання дослідження. Метою роботи було визначення видових та тканинних особливостей становлення антиоксидантної системи сільськогосподарської птиці (курей, індиків, качок, гусей, перепелів) в онтогенезі, вплив мікотоксинів присутніх в кормі на її функціонування, а також пошук шляхів підвищення антиоксидантного статусу організму.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

вивчити вікову і тканинну динаміку вмісту вітамінів А та Е в ембріогенезі та ранньому постнатальному онтогенезі курей, індиків, качок, гусей, перепелів;

вивчити динаміку активності антиоксидантних ферментів в ембріогенезі

та у дорослої сільськогосподарської птиці різних видів;

виявити особливості процесів перекисного окиснення ліпідів у тканинах птиці різних видів;

вивчити вплив мікотоксинів на антиоксидантну систему ембріонів і дорослих курей;

визначити можливість зниження токсичної дії мікотоксинів в організмі курей завдяки підвищенню антиоксидантного потенціалу їх організму.

^ Обєкт дослідження: кури, качки, гуси, індики, перепели та їх ембріони, кров, печінка, мозок та інші внутрішні органи.

Предмет дослідження: показники системи ПОЛ, А-, Е- та С-вітамінної забезпеченості організму птиці в динаміці.

^ Методи досліджень: ге­матологічні дослідження були проведені на аналізаторі «Sysmex» (Японія). Стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу вивчали на автоматичній установці «Kinetic Shapemeter SH-01» (Німеччина). Електричні параметри електоромеханічної стабільності еритроцитарних мембран визначали на електроцитоаналізаторі «ЕЦА-02» (Україна).

^ Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне вивчення динаміки активності антиоксидантних ферментів в ембріогенезі в різних видів сільськогосподарської птиці, вмісту продуктів ПОЛ і жиророзчинних вітамінів. Показано, що на заключних етапах ембріогенезу перед виводом молодняку птиці підвищується активність антиоксидантних ферментів і накопичення основного жиророзчинного антиоксиданту клітини – -токоферолу.

У результаті проведених досліджень встановлено, що мікотоксини, які вивчалися, є активатором перекисних процесів. Встановлено кореляційний звязок при мікотоксикозах курей між рівнем продуктів ПОЛ в організмі птиці та активністю антиоксидантних ферментів і вмістом вітамінів А, Е, С та каротиноїдів. Розроблено методику оцінки антиоксидантних властивостей різних форм вітамінів А, Е, каротиноїдів, мікроелементів та дослідження процесів перекисного окиснення ліпідів при дії Т-2 токсину в умовах in vitro на клітинах ембріонального мозку. Встановлена мінімальна концентрація Т-2 токсину, яка здатна активувати процеси ліпопероксидації в умовах in vitro. Дані, які висвітлюють одночасно інтенсивність ПОЛ і показники антиоксидантної системи крові курей у динаміці аліментарного мікотоксикозу, отримані вперше. Визначена спроможність, завдяки використанню підвищених доз вітамінів Е, С та селену на фоні Т-2 токсикозу курей, запобігати активації ПОЛ та їх різну біологічну активність щодо окремих ланок антиоксидантної системи крові та інших тканин. Вперше отримано нові дані про те, що за допомогою мікроелементних композицій - препарату «Біотам» як профілактичного засобу, так і в умовах розвитку Т-2 токсикозу, в значній мірі підвищується антиоксидантний статус організму, стабілізується стан клітинних мембран. Використання пробіотиків при Т-2 токсикозі сприяє значному поліпшенню біохімічних показників організму курей.

^ Теоретичне і практичне значення роботи. Одержані результати розширюють і поглиблюють сучасні уявлення про вікові, видові та тканинні особливості вільнорадикальних процесів, їх знешкодження та корекцію в організмі сільськогосподарської птиці. Встановлені характерні зміни стану показників проантиоксидантної рівноваги та функціонального стану печінки при дії різних мікотоксинів дають підстави використовувати їх як критерії оцінки ступеню розвитку токсикозу та детоксикаційної можливості вітамінних та мікроелементних препаратів. Одержані результати поглиблюють та розширюють розуміння механізмів токсичної дії мікотоксинів як стимуляторів ПОЛ, що надійшли аліментарним шляхом до організму сільськогосподарської птиці, і можуть бути основою для розробки науково обґрунтованих схем детоксикації за допомогою різних кормових добавок. Розроблено просту і швидку методику оцінки антиоксидантних властивостей біологічно активних речовин при Т-2-токсикозі в умовах in vitro. На основі одержаних результатів рекомендується використовувати при Т-2 токсикозі добавки підвищених доз вітаміну Е, С та селеніту натрію, мікроелементної композиції “Біотам” та пробіотиків: молочнокислих бактерій - Lactobacilus sp. та дріжджів Saccharomyces cerevisiae у вигляді добавок до раціону.

^ Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота містить результати досліджень, одержаних здобувачем при виконанні науково-дослідних робіт згідно з тематичним планом науково-дослідної установи, що підтверджується робочими програмами і звітами про науково-дослідницькі роботи. У закінченій дисертаційній роботі особисто здобувачеві належать: проведення порівняльного вивчення динаміки активності антиоксидантних ферментів, вмісту продуктів ПОЛ і жиророзчинних вітамінів в ембріогенезі і ранньому постнатальному онтогенезі в різних видів сільськогосподарської птиці; пошук критеріїв для поглиблення оцінки мікотоксикозів за умов аліментарного надходження токсинів; детальне вивчення досягнень науки в цьому питанні; оцінка детоксикаційної дії вітамінів, мікроелементів, пробіотиків на кров та печінку птиці, на підставі яких проведено аналіз і узагальнено одержані результати про патогенез мікотоксикозів та ступінь детоксикаційних ефектів різних біологічно активних речовин; виконання біохімічних досліджень; формулювання висновків. Дослідження гемолізу еритроцитів крові та електромеханічної стабільності еритроцитарних мембран проводилися спільно з к.б.н. Узленковою Н.Є. (Інститут медичної радіології АМН, м. Харків), що знайшло відображення в спільних публікаціях. Препарат “Біотам” розроблено разом з д.х.н. Григор'євою А.С. та к.х.н. Канахович Н.Ф. (Інститут фармакології та токсикології АМН, м. Київ). Токсини були люб'язно надані співробітниками лабораторії мікотоксикології Інституту птахівництва УААН д.в.н. Котиком А.М. та к.б.н. Труфановою В.А.

^ Апробація результатів дисертації. За основними положеннями дисертаційної роботи зроблено доповіді на:

Міжнародній конференції "Біологічні основи живлення сільськогосподарських тварин” (м. Львів, 1998);

7-й науково-практичній конференції Балтійських країн з птахівництва (м. Рига, Латвія, 1999);

Всеросійській конференції молодих вчених та аспірантів з птахівництва (м. Сергіїв Посад, Росія, 1999) ;

IV-у міжнародному симпозіумі "Біологічні механізми старіння” (м. Харків, 2000);

V-й міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми інтенсивного розвитку тваринництва” (м. Горки, Білорусь, 2000);

Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми виробництва екологічно чистої продукції на межі 3-го тисячоліття” (м. Житомир, 2000);

XXI Міжнародному конгресі з птахівництва (м. Монреаль, Канада, 2000);

Науково-практичній конференції молодих вчених “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (м. Київ, 2000);

Міжнародній науковій конференції ветеринарної медицини Дніпропетровського аграрного університету (м. Дніпропетровськ, 2001);

III та IV - й Українській конференції по птахівництву з міжнародною участю (м. Алушта, 2001, 2003).

Результати наукових досліджень доповідалися на засіданнях вченої ради, ради молодих вчених в Інституті птахівництва УААН (1998-2001 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковано в 10 статтях у наукових виданнях, 9 матеріалах і тезах доповідей конференцій. У наукових працях особистий внесок здобувача полягає в проведенні експериментальних досліджень на 90% (постановка досліду, взяття проб на аналіз, вимірювання активності ферментів, вмісу вітамінів, продуктів ПОЛ, глутатіону в біологічному матеріалі, статистична обробка результатів та їх аналіз, формулювання висновків).

РОЗДІЛ 1

Огляд літератури

^ 1.1. Окислювально-відновний гомеостаз в організмі тварин і птахів і його біологічне значення

На сьогодні стало загальновизнаним, що процесам ПОЛ належить істотна роль у регуляції метаболізму мембранних ліпідів, зміні фізико-хімічних властивостей і проникності біологічних мембран у фізіологічних умовах. Крім цього також встановлено, що процеси ПОЛ є одними з найбільш сильних модифікаторів біологічних мембран при цілому ряді патологічних станів організму [22, 23, 26]. Експериментально було доведено і теоретично сформульовано положення про непреривне протікання вільнорадикального окиснення ліпідів у нормі, тобто, вільнорадикальне (перекисне) окиснення постійно протікає у нормі у всіх тканинах живих організмів, і ці процеси при їхній низькій інтенсивності є одними з типів нормальних метаболічних процесів [21, 39]. При цьому утворення і нейтралізація вільних перекисних радикалів - провідний уніфікований адаптаційно-компенсаторний процес, а в деяких випадках - механізм, що відповідає за утворення і розвиток цілого ряду патологічних процесів, координацію імунної та антиоксидантної систем організму, регуляцію інтенсивності і спрямованості метаболічних реакцій [107]. Центральною ланкою вільнорадикальної реакції є утворення вільних ліпідних радикалів - R˙ і гідроперекисного радикалу - RO˙. Для протікання цих процесів необхідні такі умови [15]:

Наявність субстратів окиснення.

Наявність у середовищі молекулярного кисню (O2).

Утворення в тканині активних форм кисню -оксидрадикалів (О2˙–,˙OH, 1О2, Н2O2), що є сильнішими окислювачами, ніж О2.

Наявність металів змінної валентності, головним чином Fe2+, які каталізують реакцію відновлення О2 до його активних форм, а також наявність відновників цих металів (NADPH, аскорбінової кислоти та ін.).

Субстратами процесів ПОЛ в мембранах є поліненасичені жирні кислоти (ПНЖК).

Особливість і відмінність радикальної реакції в ненасичених жирних кислотах від радикальних реакцій у білках, вуглеводах, нуклеїнових кислотах полягають у тому, що, один раз почавшись, вона не припиняється, і її практично неможливо зупинити. Первинний активний радикал R. не зникає, а регенерується і продовжує ланцюг. Відкриття вільнорадикальних реакцій перекисного окиснення у тканинах і рідких середовищах організму належать Б.Н.Тарусову. Він встановив, що найбільш ефективно реакції перекисного окиснення розвиваються в ліпідвміщуючих структурах, насамперед у біологічних мембранах при впливі іонізуючої радіації [62, 63]. Незважаючи на неповноту сучасних знань про роль ПОЛ у фізіологічних умовах, у даний час установлено, що вільнорадикальні реакції ПОЛ, підтримувані спеціальними регуляторними системами на низькому стаціонарному рівні, беруть участь у звичайних метаболічних процесах і регуляції функцій клітини. Так, гальмуючи, чи, навпаки, прискорюючи ПОЛ, можна впливати на склад клітинних мембран, їхню структурну організацію та функціональну активність клітини. Таким чином, ПОЛ - не тільки універсальний модифікатор властивостей біологічних мембран, але й важливий фізіологічний регулятор їхньої структури та функції. На рис. 1.1 показано взаємодію системи генерації вільних радикалів і антиоксидантної системи. Донедавна розглядалася переважно патогенна функція активних кисневих метаболітів, що реалізується за допомогою активації процесів ПОЛ у біомембранах. При цьому вважалося, що як у нормі, так і при різних порушеннях фізіологічних реакцій необхідно інгібірувати активні кисневі метаболіти і активність ПОЛ [12]. Дослідження останніх років виявили участь активних кисневих метаболітів у регуляції тонусу судин [217], клітинної проліферації, синтезі простагландинів [117]. У зв'язку з цим стає питання: чи доцільно у визначених ситуаціях інгібування активних кисневих метаболітів?




^ О Р Г А Н І З М


Природні

антиоксиданти



Ферментативна

антиоксидантна система



Низькомолекулярні антиоксиданти



Фермент-

імітуюча дія


Репараційна

система



Металозалежна система






Ксенобіотики


Токсини


Мікотоксини


Авітамінози:


Стрес


Ендотоксини


Хвороби:





^ Важкі метали
Температура
УФ

А, Е, С


Мікроелементози:



вірусні





^ Фактори ініціації та генерації

вільних радикалів


Аліментарні

фактори


Екологічні

фактори


Ендогенні

фактори

Гіпероксія
Радіація
^ Zn, Se, Mn, Mo

Гіпервітамінози



бактеріальні


Алергії


Рис. 1.1. Взаємодія антиоксидантної системи і системи генерації вільних радикалів




1.2. Антиоксидантна система захисту клітинних структур

в організмі тварин

Захист організму тварин від деструктивної дії продуктів перекисного окиснення ліпідів забезпечує антиоксидантна система. У процесі еволюції в організмі тварин виникли захисні системи проти активних форм кисню і вільних радикалів, які діляться на дві групи: неферментативну (сполуки фенольного ряду, сірковмісні сполуки, антиоксидантні вітаміни) та ферментативну (каталаза, супероксиддисмутаза, глутатіонпероксидаза, глутатіон-S-трансфераза). Кожний з наведених компонентів антиоксидантної системи діє у тісному взаємозв'язку між собою і забезпечує регуляцію перекисних процесів в організмі тварин. Стосовно до теми дисертаційної роботи в огляді літератури розглядається роль вітамінів Е, С і А, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази, глутатіонтрансферази, каталази і супероксиддисмутази у регуляції процесів ПОЛ в клітині.

^ 1.2.1. Біологічна роль антиоксидантних ферментів.

Супероксиддисмутаза (СОД) (КФ 1.15.1.1); каталізує реакцію:

О2˙– + О2˙– + 2Н+  1 О2 + Н2О2

У результаті цієї реакції утворюється пероксид водню, здатний інактивувати СОД [126, 135]. Тому СОД локалізована і функціонує звичайно разом з каталазою, яка ефективно розкладає Н2О2. Активний центр ферменту містить атоми металів зі змінною валентністю. У залежності від структури ферменту і металу, що входить в активний центр ферменту, виділяють Сu, Zn-СОД (знаходиться у цитоплазмі, у меншій кількості - в мітохондріях та ядрах; інгібірується ціанідами). У матриксі мітохондрій присутня марганцевовміщуюча СОД (Мn-СОД). У загальному об’ємі супероксиддисмутазної активності частка Мn-СОД невелика і складає близько 15% [169]. Fe-СОД у еукаріотів міститься лише в невеликій кількості у мітохондріях. Введення Сu та Zn у вигляді високодисперсних порошків змінює активність СОД, особливо виражені антиоксидантні властивості має Zn-СОД [36]. СОД відноситься до числа дуже стійких ферментів.

При рН-11,4 і температурі 24 °С СОД зберігає активність 24 од., а в 86 % етанолі через 3 год. зберігається 90 % її активності [146].

Таким чином, Мn,Сu,Zn-СОД - найважливіші антиоксидантні ферменти, що здійснюють інактивацію супероксидного радикалу і відповідно зменшують загальний токсичний ефект кисню, його активних форм.

Каталаза (КФ 1.11.1.6) - гемопротеїд, який каталізує реакцію:

Н2О2 + Н2О2 О2 +2Н2О

Реакція протікає у дві стадії: спочатку утворюється комплекс ферменту з однією, потім - із другою молекулою пероксиду водню. Каталаза здатна реагувати і з іншими донорами водню; у цьому випадку комплекс ферменту з однією молекулою пероксиду реагує із субстратами подібно пероксидазі [103]:

Каталаза + Н2О2 + RH  R' + 2Н2О + Каталаза

Швидкість каталізу винятково велика: одна молекула каталази в секунду розкладає до 44 тис. молекул пероксиду водню; пероксидазна активність каталази істотно нижче [70]. Основна функція каталази в клітині - розкладання пероксиду водню, що утвориться при дисмутації супероксидного аніон-радикалу [133]. Найбільш висока активність каталази відзначена у гепатоцитах, у пероксисомах останніх фермент складає до 40 % усього білка [209]. Таким чином, СОД і каталаза, функціонуючи разом, інактивують активні форми кисню, що утворюються як у процесі нормальної життєдіяльності клітин, так і в умовах значної активації ПОЛ, у тому числі патологічно обумовленої. Однак найбільш ефективно ПОЛ активується в ліпідних (фосфоліпідних) структурах біомембран і супроводжується утворенням ліпідних пероксидів, які недостатньо усуваються системою СОД - каталаза. Крім того, навіть в умовах успішної дезактивації супероксиду (СОД) і пероксиду водню (каталаза) існує небезпека утворення особливо високо реактивного радикалу 'ОН за реакцією Хабер-Вайсса [158].

Н2О2 + О2˙– ОН– + О2 +˙ОН

Час життя 'ОН настільки мізерний, що його ферментна інактивація, мабуть, неможлива; потрібні інші механізми захисту. Очевидно, наявності цих двох ферментів недостатньо для повного й ефективного антиоксидантного захисту. Глутатіонзалежна антиоксидантна система включає три глутатіонзалежні ферменти: глутатіонпероксидаза (GPx), глутатіонредуктаза (GSH-R) і глутатіонтрансфераза (GSH-S-T). Центральне місце системи - трипептид глутатіон, що має і власну антиоксидантну активність і функціонує у якості кофактора донора водню, метаболіту і субстрату з ферментами системи також із СОД та каталазою. З функціональної точки зору в антиоксидантній системі глутатіону можна виділити чотири ланки:

1) забезпечення функціонування системи - GSH-R;

2) детоксикації пероксидних сполук - GPx і каталаза;

3) антирадикального захисту - СОД і GSH;

4) детоксикації електрофільних сполук - GSH-S-T.

Глутатіонредуктаза (GSH-R) (К.Ф. 1.6.4.2) каталізує реакцію:

2 NADPH + GSНG  2 NADP + 2GSH

Центральне місце цього ферменту в метаболізмі глутатіону та всієї його системи зв'язане з тим, що він здійснює єдиний відомий механізм відновлення GSH з його окисленої форми GSНG. Інші ферменти, крім глютатіонсинтетаз, є споживачами відновленого глютатіону. GSH-R - класичний цитозольний фермент усіх еукаріотичних клітин. Основне біологічне значення GSH-R полягає у підтримуванні високого рівня GSH і низького GSHG і, отже, високого відношення GSH/GSHG [168, 250], що дозволяє значно зменшити потребу в синтезі GSH. Важливість і ефективність функціонування GSH-R підкреслюється трьома основними фактами: 1) швидкість відновлення GSHG у більшості тканин вище, ніж синтезу GSH [28]; 2) у клітині рівень GSH є переважним; 3) GSH-R утилізує більше NADPH, ніж інші реакції. Робота GSH-R завжди сполучена з ферментами, що окисляють GSH у GSHG у результаті відновлення як перекисів (GPx і GSH-S-T), так і дисульфідів.

Глютатіонпероксидаза (GPх) (К.Ф.11.1.9), каталізує реакцію:

2GSH + Н2О2 GSНG + 2 Н2О

GPX – селенопротеїн, GPх знешкоджує не тільки Н2О2, але й органічні, у тому числі ліпідні, пероксиди, що утворюються в організмі при активації ПОЛ [72, 133, 157].

2GSH + ROOH GSНG + 4ROOH

Фермент локалізовано переважно у цитозолі клітин, у незначній кількості він знаходиться також у мікросомах [133]. Функціонує спільно з GSH-R, захищаючи клітини від генеруючого поза їхньою дією пероксиду водню [155]. Активний центр GPх містить чотири ковалентно зв'язаних атоми Se у формі селеноцистеїну. При нестачі Se у раціоні харчування зменшується рівень GPх у клітинах, що знижує стійкість тварин до окисного ураження [139] і може призводити до розвитку аналогічної авітамінозу Е вільнорадикальної патології (білом’язова хвороба), для якої характерні некроз та ожиріння печінки, руйнування еритроцитів [214]. Спорідненість GPх до Н2О2, вище, ніж у каталази, тому перша ефективніше працює при низьких концентраціях субстрату, у той же час як у захисті клітин від окисного стресу, викликаного високими концентраціями Н2О2, ключова роль належить каталазі [139, 214].

Глутатіонтрансфераза (GSH-S-T) (К.Ф.2.5.18), каталізує реакції типу:

RX + GSH  НХ + GSR

GSH-S-T локалізовані переважно у цитозолі клітин; у печінці людини вони складають 2-4% від загальної кількості цитозольного білка [73]. Основна функція GSH-S-T - захист клітин від ксенобіотиків і продуктів ПОЛ за допомогою їхнього відновлення, приєднання до субстрату молекули GSH чи нуклеофільного заміщення гідрофобних груп. На відміну від Se-вмісної GPх, для якої кращими субстратами є гідрофільні гідропероксиди з малим розміром молекули, GSH-S-T не взаємодіє з Н2О2 і в той же час ефективно відновлює гідрофобні гідропероксиди з великим об’ємом молекули: гідроперекиси поліненасичених жирних кислот, фосфоліпідів, а також гідропероксиди мононуклеїдів та ДНК, беручи тим самим участь у їхній репарації [73]. Крім того, GSH-S-T кон’югує з GSH, чим сприяє виведенню з організму токсичних продуктів ПОЛ. Таким чином, GSH-S-T є важливим компонентом антиоксидантного захисту, що функціонує на стадії видалення метаболітів, що утворюються при окисному стресі, [73, 93].

Глутатіон. Очевидно, що глутатіон відіграє найважливішу роль у життєдіяльності. Функції його широкі і різноманітні: 1) захист від активних сполук О2; 2) відновлення й ізомеризація дисульфідів; 3) вплив на активність ферментів та інших білків; 4) підтримування функцій мембран; 5) коферментні функції; 6) участь в обміні ейкозаноїдів; 7) резерв цистеїну; 8) вплив на біосинтез ДНК і, можливо, білка; 9) метаболізм ксенобіотиків; 10) підвищення резистентності клітин до шкідливих впливів; 11) вплив на проліферацію [65]. Пероксидний стрес, тобто надлишкове накопичення у клітині активних форм О2, у тому числі H2O2, стимулює функціонування GPх і в результаті призводить до нагромадження GSHG і його посиленого експорту з клітин. Так, надходження GSHG у жовч зростає у 2-20 разів. У плазмі крові є всі три основні форми глутатіону. Основним, але не єдиним джерелом GSH є печінка [105, 206]. Зміни концентрації GSH у тканинах відбуваються при дуже багатьох станах і впливах. Голод знижує вміст GSH у печінці пацюків та мишей у 2-3 рази, але не змінює концентрацію GSHG [206, 182, 101]. Різні види стресу знижують концентрацію GSH у тканинах і збільшують у крові GSH, особливо GSHG [160]. Глутатіон - це головний низькомолекулярний тіол (90-95%) у більшості клітин [182]. Концентрація GSH у різних видах клітин - 1-10 мМ. Антиоксидантні властивості відновленого глутатіону визначаються як безпосередньою взаємодією з активними формами кисню й обмінних реакцій з дисульфідними зв'язками, так і функціонуванням ряду ферментів глутатіонового циклу, з яких основні - глутатіонпероксидаза і глутатіон-S-трансфераза. Є повідомлення про здатність GSH безпосередньо реагувати з H202 [205]. Глутатіоновий статус тканини відіграє важливу роль при гіпероксичних станах. Коли концентрація О2- у системі виявляється нижче, ніж вміст GSH, відбувається обрив ланцюгів і регенерація радикалів у вихідну молекулу RH. Відношення сумарного вмісту відновленої та окисленої форм глутатіону позитивно корелює з інтенсифікацією окиснення ліпідів [237]. Накопичення GSHG у печінці розглядається як індикатор окисного стресу [165]. Навпаки, підвищення вмісту відновленої форми свідчить про розвиток адаптивної відповіді тканини на окисний стрес [236]. Окисний стрес, індукований введенням курям хлоридів важких металів викликав у кістковому мозку адаптаційні зміни, що виражаються в активації глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази і підвищенні рівня GSH. Загальновизнано, що GSH необхідний для нормального функціонування еритроцитів та кровотворної тканини. У крові виявляється досить високий вміст GSH, 96% якого знаходиться у відновленій формі. При цьому в нормі практично весь GSH асоційований з форменими елементами, а в плаз