Реферат: Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации



ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ



медико-биологическАЯ оценкА безопасности наноматериалов


Методические указания

МУ 1.2. 2635-10


Москва

2010




Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. – 123 с.

.


1. Авторский коллектив: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Г.Онищенко), Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян, И.В.Гмошинский, С.А.Хотимченко, И.В.Аксенов, Е.А.Арианова, В.В.Бессонов, В.М.Верников, М.М.Гаппаров, Р.В.Распопов, В.В.Смирнова, А.А.Шумакова, О.Н.Тананова, О.И.Передеряев), Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия (И.А.Дятлов, В.П.Холоденко, В.А.Чугунов, Е.Н.Кобзев, И.А.Ирхина, В.Б.Родин, И.И.Мартовецкая, Е.В.Тимошинова, Н.В.Александрова), Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (А.Л.Гинцбург, Б.С. Народицкий, М.М.Шмаров, Д.Ю.Логунов, Л.Н. Нестеренко, Н.А. Зигангирова, Ю.М. Романова, А.Ф. Мороз, М.В. Мезенцева, Д.В. Щебляков, И.Л. Тутыхина, Л.В. Черенова, А.И. Тухватулин, И.Ю. Грибова), Государственное учебно-научное учреждение Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (М.П.Кирпичников, К.В.Шайтан, А.П.Бонарцев, А.В.Феофанов, Т.Г.Сазонтова, Ю.В.Архипенко, Д.В.Багров), Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН (К.Г.Скрябин, О.А.Зейналов, Н.В.Равин, С.П.Комбарова), Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН (В.О.Попов, Б.Б.Дзантиев, А.В.Жердев, Н.В.Голуб), Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП ВНИИМС)(С.А Кононогов.,С.С.Голубев), ООО «Интерлаб» (А.Н.Веденин, Г.В.Казыдуб).


2. Разработаны в рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 - 2010 годы».


3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 мая 2010 г.


4. Введены в действие с 24 мая 2010 г.


5. Введены впервые.


УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации


_____________________ Г.Г.Онищенко

« _24_ » 05 2010 г.

Дата введения: « _24_ » 05 2010 г.


^ 1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ


МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ НАНОМАТЕРИАЛОВ

Методические указания

МУ 1.2.2635-10
____________________________________________________ ^ I. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания устанавливают требования к медико-биологической оценке безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения на основе тестов на культурах клеток, семенах высших растений и лабораторных животных

1.2. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются в ходе установления безопасности наноматериалов на стадиях их производства, оборота, использования и утилизации в Российской Федерации в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с данными процессами.

1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства измерений и адаптации имеющихся методов и средств измерений в ходе оценки безопасности наноматериалов искусственного происхождения.

1.4. Методические указания предназначены для специалистов органов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящих исследования по оценке безопасности наноматериалов.
^ II. ВВЕДЕНИЕ
Наноматериалы и наночастицы, являющиеся продуктом современных нанотехнологий, обладают комплексом уникальных свойств, которые открывают широкие перспективы их промышленного применения. Одновременно это создаёт риск возможных неблагоприятных воздействий наноматериалов на организм человека, сельскохозяйственных животных и растения, компоненты природных биоценозов. В ближайшей перспективе следует ожидать резкого увеличения объёмов производства во всём мире, и, в частности, в России, ряда приоритетных наноматериалов, в частности таких, как наночастицы оксидов, нитридов и карбидов кремния, титана, цинка, железа, церия, алюминия, вольфрама, металлические наночастицы железа, меди, кобальта, никеля, алюминия, серебра, золота, металлов платиновой группы, кремния, селена, квантовые точки, углеродные нанотрубки, фуллерены, наночастицы биополимеров и рекомбинантных вирусов. Это с неизбежностью приведёт к поступлению значительных количеств наноматериалов в окружающую среду, их накоплению в компонентах биоты и абиотических средах с последующей возможной передачей человеку.

В настоящее время накоплен значительный экспериментальный материал относительно токсичности некоторых наноматериалов для живых организмов. Однако, большинство исследований по изучению биологических эффектов наночастиц и наноматериалов выполнено с помощью разнообразных, недостаточно стандартизированных методик и тест систем, причём полученные при этом результаты часто не сопоставимы. В связи с этим, большое значение приобретает разработка единой системы стандартных тестов, позволяющих оценивать безопасность новых искусственных наноматериалов по их воздействию на показатели жизнедеятельности стандартизированных биологических систем.

Биологические системы, применение которых возможно для выявления вредных воздействий антропогенных веществ, к числу которых относятся искусственные наноматериалы, весьма разнообразны. В настоящее время их подразделяют на семь подгрупп в соответствии с основными биологическими дисциплинами: микроорганизмы, растения, простейшие организмы, клеточные и субклеточные элементы, различные гидробионты, организмы высших животных. Биотестирование – один из приемов исследования в области токсикологии, используемый с целью установления степени токсического действия химических, физических и биологически неблагоприятных факторов среды, потенциально опасных для человека и компонентов экосистем. Биотестирование не отменяет систему аналитических и аппаратурных методов контроля за содержанием наноматериалов в природной среде, а дополняет ее качественно новыми биологическими показателями, так как с точки зрения оценки рисков сами по себе определения концентраций токсикантов имеют относительную ценность. Важно знать не только уровни экспонирования, но и вызываемые ими биологические эффекты. Кроме того, в отличие от физико-химического анализа, биологические методы позволяют оценить обобщенную, или интегральную, реакцию на действие неблагоприятных факторов, характеризуя направленность и скорость происходящих в организмах изменений.

Не существует универсальной тест-системы, способной обнаружить все возможные эффекты искусственных наноматариалов одинаково хорошо. Поэтому на практике все более широкое применение находят наборы тестов, включающих использование различных тест-организмов (бактерий, водорослей, простейших, ракообразных, рыб, растений и ряд других). В настоящее время наибольшее внимание, с точки зрения оценки интегральной токсичности почв и вод, привлекают биотесты с использованием культур микробных клеток и клеток высших животных, растений, ракообразных, физиологических и поведенческих реакций у высших животных.

В связи с вышеизложенным в качестве биотестов для оценки потенциального вредного воздействия искусственных наноматериалов на живые организмы, входящие в состав природных экосистем, предлагаются микроорганизмы: биолюминесцентный тест на фотобактериях, почвенные микроорганизмы: бактерии Pseudomonas fluorescens и Bacillus subtilis, дрожжи Candida lipolytica), семена высших растений.

Настоящие методические указания разработаны в целях внедрения единого, научно обоснованного, стандартизированного количественного подхода к оценке безопасности искусственных наноматериалов. Разработка методических указаний осуществлена в рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на период 2008-2010 гг.»
^ III. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
3.1. Проведение исследований по медико-биологической оценке безопасности наноматериалов определяются правилами надлежащей лабораторной практики.

3.2. Требования к стандартным и исследуемым наноматериалам.

3.2.1. Для верификации, стандартизации и калибровки методов, применяемых при медико-биологической оценке безопасности наноматериалов используются стандартные образцы наноматериалов (стандарты).

3.2.2. Каждый стандартный образец наноматериала должен быть охарактеризован по показателям химического состава (включая наличие примесей), размеру и форме частиц, удельной площади поверхности, типу кристаллической структуры. Указанные характеристики определяются с использованием методов масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, трансмиссионной электронной микроскопии, определения изотерм адсорбции инертных газов, рентгенофазового (рентгенодифракционного) анализа. В случае стандартных образцов фуллеренов следует использовать метод обращённофазовой ВЭЖХ.

3.2.3. Каждый стандартный образец наноматериала должен быть снабжён «Паспортом безопасности наноматериалов», который должен быть составлен в соответствии с ГОСТ 30333-2007.

3.2.4. Стандартные образцы наноматериалов должны быть упакованы для защиты при транспортировке от загрязнения или порчи.

3.2.5. Хранение стандартных образцов наноматериалов осуществляется отдельно от остальных применяемых веществ с соблюдением условий хранения, указанных в «Паспорте безопасности» на протяжении всего срока годности образца.

3.2.6. Хранение и использование стандартных образцов наноматериалов осуществляется в соответствии с утвержденным протоколом исследования.

3.2.7. Перед проведением тестирования наноматериалов необходимо получить основные физико-химические характеристики наноматериалов, которые включают:

- химический состав наноматериалов (содержание основного вещества, содержание примесей и токсичных компонентов);

- содержание растворителей или носителей (если они использовались);

- рекомендуемый состав среды для получения дисперсий наночастиц;

- размеры и форма наночастиц;

- стабильности наночастиц при хранении.

3.3. Требования к используемому оборудованию.

3.3.1. Организации, проводящие исследования по медико-биологической оценке безопасности наноматериалов, должны быть оснащены необходимым оборудованием, прошедшим метрологический контроль и калибровку в установленном порядке.

3.3.2. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения калибровки и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание.

3.3.3. Для каждого прибора, используемого в исследованиях, в журнале фиксируются следующие сведения: наименование прибора, наименование производителя, страну происхождения, модель прибора, серийный (заводской) номер, дату получения и постановки на учет в лаборатории, дату запуска в эксплуатацию, инвентарный номер, место расположения прибора.

3.3.4. Сотрудник, ответственный за использование и за техническое обслуживание прибора, должен делать записи о плановом обслуживании оборудования, датированные и заверенные подписью ответственного лица, записи о любых повреждениях, отказах, ремонте прибора, датированные и заверенные подписью сотрудника.

3.3.5. Лаборатории, проводящие исследования по медико-биологическому тестированию безопасности наноматериалов методами, связанными с использованием радиоактивных изотопов, должны быть аккредитованы и иметь санитарный паспорт для работы с источниками ионизирующего излучения. Хранение, использование радиоизотопов и утилизация контаминированных ими материалов осуществляется в соответствии с СанПиН 2.6.1.2523-09 «Нормы радиационной безопасности (НРБ-99/2009)».

3.4. Требования к используемым тест-системам

3.4.1. Характеристики тест-систем, используемых в экспериментах, должны быть паспортизованы и иметь документированный сертификат гарантированного срока использования. Условия проведения исследований на тест-системах должны выполняться строго по инструкции производителя или специально разработанного СОПа и исключать воздействие внешних факторов, способных повлиять на качество получаемых данных.

3.5. Планирование и проведение исследований.

3.5.1. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов проводится по утвержденному плану с ведением протокола и составлением отчета, в который заносятся все результаты исследований.

3.5.2. Медико-биологическое тестирование наноматериалов, требующее использования лабораторных животных, поводятся только на здоровых животных, прошедших карантин.

3.5.3. Животные, используемые в экспериментах, должны иметь ветеринарный сертификат. Преимущественно должны использоваться свободные от патогенной микрофлоры SPF линейные виды.

3.5.4. Для обеспечения индивидуального наблюдения в процессе выполнения исследования животные должны быть идентифицированы. Способ идентификации животного документируется. Все клетки, вольеры, контейнеры, предназначенные для содержания животных, также подлежат маркировке.

3.5.5. Помещения для лабораторных животных должны обеспечивать изоляцию (карантин) поступающих животных, больных животных и животных, подозреваемых в носительстве инфекций; позволять осуществлять раздельное содержание различных видов животных и животных одного вида, соответствовать санитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям. Животные, предназначенные для исследования различных наноматериалов, пространственно изолируются друг от друга.

3.5.6. Корма, оборудование и инвентарь для ухода за животными необходимо хранить в помещениях, изолированных от мест содержания животных.

3.5.7. Исследования безопасности наноматериалов на животных проводятся в соответствии с установленными правилами. Исполнителем должен быть обеспечен контроль за соблюдением правовых и этических норм использования лабораторных животных в соответствии с утверждённым протоколом.

3.5.8. Корма и вода для животных должны обеспечивать пищевые потребности в соответствии с протоколом исследования и действующими нормативными документами.

3.5.9. Результаты медико-биологического тестирования безопасности наноматериалов заносятся в протокол, в котором отражены цели работы и методы, используемые в работе. Протокол исследования утверждается руководителем организации, проводящей исследования, и включает: цель и задачи исследования, имеющиеся сведения о тестируемом наноматериале (физические, химические, биологические, токсикологические свойства), используемые стандарты, схему проведения медико-биологического тестирования и её обоснование, методы введения наноматериала в биологические объёкты, применяемые дозы наноматериала, методы исследования, определяемые показатели, результаты исследований, метрологическую характеристику анализа, статистическую обработку результатов исследования, заключение, список используемой литературы.

3.5.10. Вносимые изменения в протокол исследования и отклонения от протокола (незапланированные события, непредвиденные обстоятельства и т.д.) записываются, пронумеровываются, подписываются руководителем исследования, датируются в приложении с указанием причин и утверждаются руководителем организации.

3.6. Требования к оформлению отчета.

3.6.1. По окончании медико-биологического тестирования безопасности наноматериалов на модельных биологических тест-системах оформляется отчет, в котором должны быть представлены: название, адрес организации, даты начала и завершения исследований, цель и задачи исследования; характеристика тестируемого наноматериала, включая имеющиеся сведения о физических, химических, биологических, токсикологических свойствах; перечень протестированных образцов наноматериала и применяемых стандартов, метод введения наноматериала в биологические объекты, схема проведения исследования, описание методов статистической обработки результатов, результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой, обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы.

3.6.2. Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации.

3.7. Система обеспечения качества медико-биологического тестирования безопасности наноматериалов.

3.7.1. Контроль за качеством проведения медико-биологического тестирования безопасности наноматериалов включает в себя оформление перечня исследований, проводимых в организации, с указанием для каждого исследования руководителя и заказчика, названия определяемого наноматериала, даты начала и состояния каждого исследования на текущий момент времени, оценку протоколов и методов исследования на соответствие правилам лабораторной практики, мониторинг текущих исследований, отчет о проведенных проверках и рекомендации по устранению недостатков.

3.7.2. Для осуществления контроля качества руководитель организации, проводящей медико-биологическое тестирование безопасности наноматериалов, назначает, в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, ответственных лиц за мониторинг исследования из числа сотрудников, не участвующих в исследовании.

3.8. Стандартные операционные процедуры (СОП).

3.8.1. СОП разрабатываются организацией, проводящей медико-биологическую оценку безопасности наноматериалов, на все производственные операции, включая: поступление, идентификацию, маркировку, отбор, обработку, проб, использование и хранение исследуемых проб, хранение и аттестацию стандартов; обслуживание и калибровку измерительных приборов и оборудования; ведение биологических тест-систем и их поддержание в функциональном состоянии; приготовление реактивов, ведение записей, отчетов и их хранение; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизация наноматериалов, содержащих их образцов и использованных компонентов биологических тест-систем (если это необходимо); осуществление программы по обеспечению качества, и утверждаются руководителем организации.

3.8.2. Соблюдение СОП осуществляется в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования.

3.8.3. Отклонения от СОП должны быть документально оформлены, подписаны руководителем исследования и утверждены руководителем организации.

3.8.4. Организация, проводящая исследование по медико-биологической оценке безопасности наноматериалов, обязана:

-иметь утвержденный порядок приема и учета поступления анализируемых проб и стандартов наноматериалов;

- проводить учет анализируемых проб и стандартов наноматериалов при поступлении, расходовании, возврате заказчику или их утилизации;

- принимать меры по обеспечению идентификации исследуемых веществ (название, химическая формула, номер серии, дата выпуска, условия хранения и срок годности) и их стабильности на протяжении всего исследования. Для образцов наноматериалов на этикетке дополнительно должны указываться размер, форма частиц, при необходимости, удельная площадь поверхности и кристаллическая структура.

3.9. Меры конфиденциальности.

3.9.1. Сотрудники, принимающие участие в проведении медико-биологического тестирования безопасности наноматериалов, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе исследования, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.9.2. Организация, проводящая исследования по медико-биологической оценке безопасности наноматериалов, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.
^ IV. Медико-биологическое тестирование безопасности наноматериалов на культурах клеток высших животных 4.1. Требования к используемым культурам клеток
Используемые в экспериментах перевиваемые культуры клеток должны быть получены из организаций, сертифицированных по соответствующему профилю. На хранение и ведение культур клеток и тканей должны составляться инструкции или СОП, гарантирующие качество клеточных и тканевых культур. Перед использованием культуры клеток должны быть протестированы на жизнеспособность и функциональною активность и иметь соответствующий стандарт, указанный в методике.

Работы по исследованию токсичности и биологической активности наноматериалов на первичных и перевиваемых культурах тканей in vitro, а также на первичных культурах макрофагов в системе ex vivo должны проводиться по утвержденным инструкциям и СОП. Эти документы должны регламентировать каждый этап эксперимента, соответствовать требованиям проведения безопасных работ с данным видом материалов.
^ 4.2. Схема введения наноматериалов животным и сроки наблюдения
Группы мышей обрабатывают исследуемым наноматериалом для определения острой токсичности аэрозольно, подкожно, внутривенно, перитонеально, внутрижелудочно (в зависимости от предполагаемого пути попадания наноматериала). Исследования проводят на 1, 10 и 30-е сутки после введения наноматериалов на животных.

Для изучения хронической иммунотоксичности животных подвергают воздействию наноматериала ежедневно на протяжении 21 дня. Исследования проводят на 1-е, 30-е и 60-е сутки после окончания введения наноматериалов.
^ 4.3. Подготовка аэрозольно обработанных наноматериалами животных
В экспериментах по воздействию наночастиц в аэрозольном состоянии используются морские свинки, линейные белые мыши для последующего получения и изучения in vitro их альвеолярных макрофагов. Животные обрабатываются аэрозольно в затравочной камере. Затравочная камера должна иметь объем не менее 100 дм3 и позволять одновременно обработать до 10 морских свинок или до 60 мышей, которых предварительно помещают в специальную корзину. Аэрозоль генерируется из водной или водно-органической дисперсии наноматериала калиброванным стеклянным распылителем, представляющем конструктивно трубку Вентури с объемом распыляемой жидкости до 7 см3. Система снабжается HEPA-фильтрами на входе воздушного потока, на выходе воздух фильтруется через HEPA-фильтр с термообработкой выходящего воздуха при температуре 840 °С. Камера имеет возможность регулирования времени ингаляции аэрозоля, времени распада облака. Работает по заранее выбранной программе в автоматическом режиме.

Перед экспериментом необходимо провести подбор рецептур жидкости для распыления предлагаемого для исследования наноматериала, исходя из его физико-химических свойств и токсичности самой жидкости. После обработки животные выдерживаются в условиях вивария необходимое количество времени и далее поступают либо на гистологические эксперименты, либо из них получают альвеолярные макрофаги с целью изучения их функций в условиях in vitro в культуре тканей. Последним исследованиям придается особое значение, так как на макрофагах одного и того же животного возможно исследовать действие различных веществ в разных концентрациях и оценить различные функции (фагоцитоз, бактерицидную активность, цитотоксичность, окислительный взрыв).
^ 4.4. Приборы и оборудование
4.4.1. Средства измерения:

- весы лабораторные электронные, погрешность при измерении не более 0,001 г, Sartorius, Германия или аналогичные;

-весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-2001;

-pH-метр лабораторный МР220, Mettler-Toledo GmbH, Швейцария или аналогичный;

4.4.2. Оборудование:

-цитофлюориметр FACSCalibur, BD – 2 – лазерный с возможностью одновременной детекции 4-х различных флюорохромов или аналогичный;

-плашечный термостатируемый универсальный сканер флюоресцентных сигналов, Victor, Perkin Elmer или аналогичный;

-планшетный спектрофотометр Titertek Multiscan Plus или аналогичный;

-планшетный сцинтилляционно-люминесцентный счетчик Top Сount, Paсkard, США или аналогичный;

-термостат, поддерживающий рабочую температуру + 28-45оС с отклонением от заданной + 1оС по ТУ 64-1-1382-72;

-ламинарный шкаф марки ЛШ1 фирмы Вiokom или аналогичный отечественный ламинарный шкаф БОВ-001-АМС (вариант СПШ), Россия;

- центрифуга со скоростью вращения ротора до 3000 об/мин для пробирок вместимостью 15 см3 СМ 6.03 ELMI (Латвия) или аналогичная;

- встряхиватель вибрационный типа вортекс со скоростью вращения до 3000об/ мин;

- шейкер планшетный термостатируемый;

- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678-85;

- мембранные установки для получения деионизованной воды по ОСТ 11-029.003-80;

- облучатель бактерицидный настенный ОБН-150;

- автоклав ВК-75, завод медоборудования, Тюмень, Россия;

- аппарат для приготовления деионизованной воды Direct-Q 5, Millipore, США или аналогичный;

- баня водяная с электрическим подогревом, ГСП-2, завод РЭМО, Львов, Украина или аналогичная;

- дистиллятор ДЭ-4-2, завод медоборудования, г. Саранск, Россия;

- морозильная камера бытовая, обеспечивающая температуру -18 С, Stinol, Россия;

- шкаф сушильный ШС-80-01 СПУ, ОАО «Смоленское СКТБ СПУ» или аналогичный;

- CO2-инкубатор Nuaire CF AUTOFLOW или аналогичный;

- харвестер для переноса клеток на фильтр;

- инвертированный микроскоп Биолам П2-1, ЛОМО, С-Петербург, Россия или аналогичный;

- регулируемые автоматические пипетки (0,5-10, 10-100, 100-1000, 500-5000 мм3), Ленпипет, Россия или аналогичные.
^ 4.5. Материалы и реактивы
4.5.1. Лабораторная посуда и вспомогательные материалы:

- пробирки пластиковые стерильные с крышкой вместимостью 15 см3, Costar, США, или аналоги;

- наконечники пластиковые объемом 1-200 мм3;

- наконечники пластиковые объемом 200-1000 мм3;

- перчатки резиновые ГОСТ 3-88;

- колбы плоскодонные конические разной вместимости ГОСТ 1770-74;

- цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 см3 ГОСТ 1770-74;

- колбы мерные (50, 100, 200, 500, 1000 см3) по ГОСТ 1770-74;

- лабораторный штатив по ТУ 64-1-2669-73;

- микроцентрифужные пробирки (1,5 см3), "Eppendorf", Германия;

- пластиковые флаконы для культур клеток объемом 25 см3, Corning Costar, США или аналогичные;

- пластиковые планшеты для культур клеток 96-луночные, Corning Costar, США или аналогичные;

- стерильные пластиковые пипетки градуированные, Corning Costar, США или аналогичные;

- пробирки для цитометрического анализа FALCON, BD;

- пробирки TRUCount BD;

- камера Горяева для счета форменных элементов крови, модель 851, Россия;

- фибростеклянные фильтры для сбора клеток, Wathman.

4.5.3. Реактивы:

- cреда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) сухая (Sigma);

- среда РПМИ-1640 сухая (Sigma);

- среда 199 сухая (Sigma);

- раствор Хенкса без фенолового красного (Sigma);

- Фиколл (Sigma);

- Верографин, 76 % раствор в ампулах (Sigma);

- фетальная сыворотка теленка (FCS) (Sigma);

- L-глутамин (Sigma);

- трипсин (Sigma);

- раствор Версена (Sigma);

- гентамицина сульфат, 4% раствор для инъекций в ампулах (Sigma);

- тест-система для определения лактатдегидрогеназы CytoTox 96, Промега, США или аналогичная;

- тест-система для определения мышиного фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-) методом иммуно-ферментного анализа (ИФА), Amersham Biosciences, США, или аналогичная;

- тест-система для определения мышиного интерферона – гамма (ИНФ-) методом ИФА, Amersham Biosciences, США или аналогичная;

- тест-система для определения человеческого интерферона – гамма методом ИФА, Вектор-Бест, Россия, или аналогичная;

- тест-система для оценки фагоцитоза методом проточной флуорометрии Phagotest, BD;

- тест-система для оценки активности АТФ методом проточной флуорометрии ATP Determination Kit;

- люминол (5-` amino-2,3-dihidro-1,4-phthalasinedione) (Fluko);

- человеческий сывороточный альбумин (Sigma);

- гепарин (Sigma);

- раствор желатина в ампулах (Sigma);

- сцинтилляционная жидкость для жидкостного сцинтилляционного счёта Top Count, Packard, США или аналог;

- 3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) (Sigma);

- нитросиний тетразолий (НСТ) (Sigma);

- конконавалин А (КонА) (Sigma);

- липополисахарид (ЛПС) Escherichia coli (Sigma);

- [H3] тимидин, НПО Изотоп, Россия;

- моноклональные антитела к CD3 PerCP, CD19 PE, CD4 APC, CD8 FITC (Sigma);

- моноклональные антитела к CD3 PerCP, CD19 PE, CD69 FITC (Sigma);

- изотипический контроль IgG1-FITC (Sigma);

- FACS Lysing Solution, BD (Sigma);

- азид натрия (Sigma);

- параформальдегид (Sigma);

- тритон Х-100 (Sigma);

- ДНК-аза (Sigma);

- РНК-аза (Sigma);

-коллагеназа (Sigma);

- 7-AАD (7-амино-актиномицин D) (Sigma);

- пропидия йодид (Sigma)

- CD45 FITC (Sigma);

- бромистый этидиум (Sigma);

- ортофенилендиамин (ОФД) (Sigma);

- форболмиристилацетат (ФМА) (Sigma);

- 1-флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) (Sigma)

- зимозан (Sigma);

- диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma);

- натрия додецилсульфат (ДСН) (Sigma);

- краситель трипановый синий (Sigma);

- буфер HEPES (Sigma);

- ТРИС-HCl (Sigma);

- лимонная кислота чда по ГОСТ 2158-76;

- этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) двунатриевая соль (Sigma);

- натрия цитрат чда по ГОСТ 22280-76;

- аммоний хлористый чда по ГОСТ 3773-72;

- натрия фосфат однозамещенный чда по ГОСТ 245-75;

- натрия фосфат двузамещенный чда по ГОСТ 4172-76;

-натрий хлористый хч по ГОСТ 4233-77;

-калий фосфорнокислый однозамещенный чда по ГОСТ 4198-75;

-натрий бикарбонат безводный (Sigma);

-едкий натр по ГОСТ 2263-79 (хч);

-соляная кислота 1Н по ГОСТ 3118-77 (хч);

-серная кислота 1Н по ГОСТ 4278-76 (хч);

-вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72 (хч);

-перекись водорода 33%-ная ГОСТ 177-88;

-спирт этиловый технический по ГОСТ 17299-78 (чда);

- гексенал (Sigma);

- пенициллин (Sigma);

- стрептомицин (Sigma);
^ 4.6. Приготовление растворов и сред
Состав применяемых питательных сред представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Состав питательных сред

Компоненты

Количество

Среда РПМИ-1640

Сухая среда РПМИ-1640 (Sigma)

10,4 г

Деионизированная вода

До 1000 см3

Полная питательная среда (ППС) на основе РПМИ-1640

Сухая среда РПМИ-1640 (Sigma)

10,4 г

натрий бикарбонат безводный

2 г

Буфер HEPES

5,96 г

L- глутамин

0,146 г

Фетальная сыворотка телёнка (FCS)

50 см3

Деионизированная вода

До 1000 см3

Полная питательная среда (ППС) на основе DMEM

Сухая среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM) (Sigma)

9,99 г

натрий бикарбонат безводный

2 г

Буфер HEPES

5,96 г

L- глутамин

0,146 г

Фетальная сыворотка телёнка (FCS)

100 см3

Деионизированная вода

До 1000 см3

Среда 199

Сухая среда 199 (Sigma)

9,9 г

Деионизированная вода

До 1000 см3


Таблица 2

Состав растворов

Компоненты

Количество

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ)

калий фосфорнокислый однозамещенный

0,21 г

натрий хлористый

9 г

натрия фосфат двузамещенный

0,726 г

Деионизированная вода

до 1000 см3

Цитратный буфер (pH 5,0)

Лимонная кислота

7,3 г

натрия фосфат двузамещенный

11,86 г

Дистиллированная вода

до 1000 см3

Раствор трипсин/Версена

Раствор трипсина в ФСБ (Sigma)

5 г

Раствор Версен (Sigma)

0,2 г

натрий хлористый

0,85 г

Деионизированная вода

до 1000 см3

Лизирующий буфер для эритроцитов

аммоний хлористый

8,3 г

Tris-HCl

1,21 г

Деионизированная вода

до 1000 см3

Градиент плотности фиколл-верографин плотностью 1,077

Фиколл

9,66 г

Верографин, 76 % раствор в ампулах (Sigma)

20 см3

Дистиллированная вода

132 см3


Лизирующий буфер для теста МТТ

Додецилсульфат натрия

10 г

Соляная кислота 1Н

1 см3

Дистиллированная вода

До 100 см3

Натрий-цитратный буфер (рH5,5)

цитрат натрия

25,5 г

Дистиллированная вода

До 100 см3

Раствор люминола

люминол

17,7 мг

Человеческий сывороточный альбумин

50 мг

Буфер HEPES (Sigma)

596 мг

Дистиллированная вода

До 100 см3
^ 4.7. Получение и культивирование клеточных культур 4.7.1. Получение первичных клеточных культур
Выделение перитонеальных макрофагов мыши

Клетки выделяют из перитонеальной полости мышей за сутки до начала эксперимента. Перитонеальные макрофаги мыши получают с помощью промывания брюшной полости раствором фосфатно-солевого буфера. Мышей эвтаназируют ингаляцией СО2, затем асептически вскрывают брюшину и промывают брюшную полость 4-6 см3 ФСБ, используя пинцет и пипетку. Для исключения адгезии клеток к пластику пробирку с суспензией перитонеальных клеток держат на ледяной бане. Суспензию клеток перитонеальной полости мыши центрифугируют при 250 g 10 мин, затем убирают надосадочную жидкость, лизируют эритроциты добавлением 1 см3 деионизованной воды на 15 секунд с тщательным перемешиванием. Восстанавливают солевой баланс раствора добавлением 1 см3 2-х-кратного ФСБ, снова центрифугируют и убирают надосадочную жидкость. После этого добавляют ППС на основе DMEM, подсчитывают количество клеток в камере Горяева, доводят концентрацию до 3-5106 клеток/см3, высевают в плоскодонный 96-луночный планшет для культур тканей и оставляют на 24 часа до формирования монослоя.

Выделение альвеолярных макрофагов морской свинки

Суспензию интерстициальных легочных клеток получают по методу [Holt et al., 1985] в модификации [Lyadova et al., 1998]. После анестезии гексеналом (5 мг/мышь) кровеносную систему через правый желудочек сердца перфузируют раствором Версена с антибиотиками (100 ед/см3 пенициллина и 100 мкг/см3 стрептомицина) до молочно-белой окраски легочной ткани. Для удаления бронхоальвеолярных клеток легкие несколько раз промывают этим же раствором через канюлированный надрез в трахее. Легочные доли измельчают глазными ножницами до кусочков размером 1-2 мм3 и помещают в ППС на основе среды RPMI 1640, содержащую 150 ед/см3 коллагеназы, 50 ед/см3 ДНК-азы и антибиотики (гентамицин 100 мкг/см3 или пенициллин 100 мкг/см3), из расчета 5 см3 среды/мышь. После инкубации в течение 90 минут в СО2-инкубаторе полученный дезинтеграт для улучшения моноклеточности интенсивно пипетируют. Суспензию клеток трижды промывают ФСБ с антибиотиками (гентамицин 100 мкг/см3 или пенициллин 100 мкг/см3), ресуспендируют в среде 199 с 10% FCS и антибиотиками (гентамицин 100 мкг/см3 или пенициллин 100 мкг/см3), а затем инкубируют в культуральных флаконах Costar (75 см3) в СО2-инкубаторе (60 мин) из расчета 20-30×106 легочных клеток в 8-10 см3 на флакон.

Дальнейшую отмывку от неприлипших клеток и перевод макрофагов из монослоя в суспензию проводят в среде DMEM без антибиотиков так же, как описано выше для перитонеальных макрофагов.

Получение спленоцитов мыши

Клетки получают в день эксперимента. Мышей эвтаназируют ингаляцией СО2, затем асе