Реферат: Пособие для врачей и врачей-лаборантов Москва

Министерство здравоохранения

и социального развития

Российской Федерации
ФГУ Эндокринологический научный центр


СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ГОРМОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАТОЛОГИИ НАДПОЧЕЧНИКОВ


Под редакцией И .И. Дедова


Пособие для врачей и врачей-лаборантов


Москва

2010


Министерство здравоохранения

и социального развития

Российской Федерации

Российская ассоциация эндокринологов
ФГУ Эндокринологический научный центр


«УТВЕРЖДАЮ»

Главный эндокринолог Министерства здравоохранения

и социального развития Российской Федерации

Президент Российской ассоциации эндокринологов

Академик РАН и РАМН И.И. Дедов


^ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ

ГОРМОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ

ПАТОЛОГИИ НАДПОЧЕЧНИКОВ


Москва

2010


Рабочая группа:


Дедов И.И. акад. РАН и РАМН, директор ФГУ ЭНЦ, главный эндокринолог

Министерства здравоохранения и социального развития РФ

^ Гончаров Н.П. д.м.н., проф., руководитель лаборатории биохимической

эндокринологии и гормонального анализа ФГУ ЭНЦ

Марова Е.И. д.м.н., проф., заслуженный врач РФ, отделение нейроэндокринологии и остеопатий

^ Кация Г.В. д.м.н., главный научный сотрудник лаборатории биохимической

эндокринологии и гормонального анализа ФГУ ЭНЦ

Колесникова Г.С. д.б.н., главный научный сотрудник лаборатории биохимической

эндокринологии и гормонального анализа ФГУ ЭНЦ

^ Тодуа Т.Н. к.м.н., врач-лаборант лаборатории биохимической

эндокринологии и гормонального анализа ФГУ ЭНЦ


Оглавление
Оглавление 4

Введение 6

Адренокортикотропный гормон (АКТГ). Общие сведения. 8

Кортизол (гидрокортизон). Общие сведения. 9

Определение общего кортизола в сыворотке крови 10

Определение свободного биологически активного кортизола. 12

Определение свободного кортизола в моче 17

Показания к определению кортизола и АКТГ. 19

Изменение показаний концентрации кортизола в биологических жидкостях при патологии. 20

Функциональные тесты для оценки состояния гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы 21

Заключение. 27

Литература 28

Список сокращений 28














Введение

Центральное место в системе гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников занимают стероидные гормоны коркового слоя коры надпочечников, которые, обладая широким спектром биологического действия, обеспечивают основополагающие процессы жизнедеятельности. Они регулируют белковый, углеводный, жировой и водно-солевой обмены, оказывают непосредственное влияние на состояние иммунной системы и поддержание метаболического гомеостаза. Им, наряду с ЦНС, принадлежит важная роль в обеспечении резистентности организма к стрессорным воздействиям, сохранении его устойчивости и способности адаптироваться к постоянно меняющимся условиям внешней среды. Поэтому нарушения функции в системе гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников на любом уровне приводит к серьезным эндокринным заболеваниям.

Кортиколиберин (КРГ) является основным регулятором секреции АКТГ, обеспечивая быструю активацию синтеза АКТГ. В тех случаях, когда происходит длительная активация системы, включается второй нейропептид – вазопрессин.

Стероиды коры надпочечников синтезируются под непосредственным влиянием АКТГ. Последний, посредством активации системы цАМФ, усиливает транскрипцию генов для стероидогенных ферментов, адренодоксин-редуктазы и адренодоксина. Однако, при синтезе альдостерона, АКТГ является лишь дополнительным фактором, а основным регулятором является ангиотензин II, который представляет собой ключевое звено ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, осуществляющей водно-солевой обмен и регулирующей кровяное давление.

Отличительной чертой коры надпочечников высших животных и человека является распределение по зонам ее морфологических и функциональных характеристик. В поверхностной (клубочковой) зоне синтезируется основной минералокортикоид – альдостерон, в средней (пучковой) – главный глюкортикоид кортизол, а в клетках внутреннего слоя (сетчатой зоне) происходит синтез андрогенов – дегидроэпиандросте-рона и андростендиона.

Распределение процессов биосинтеза стероидов по зонам коры надпочечников детерминировано различиями в локализации специфических ферментных систем, обеспечивающих сложный процесс стероидогенеза. Ферментные системы, участвующие в биосинтезе стероидных гормонов, представлены во всех трех зонах коры надпочечников. Исключение составляют два фермента: 18-гидроксилаза, обеспечивающая синтез альдостерона, присутствует только в клубочковой зоне, а 17-гидроксилаза/17,20-десмолаза является основным ферментом пучковой зоны. В целом ряде патологических ситуаций активность ферментных систем стероидогенеза нарушается, что приводит к нарушению соотношения секретируемых стероидов и развитию патологических состояний с различными клиническими проявлениями.

Секреция АКТГ и кортикостероидов подчиняется четкой суточной динамике. Суточные изменения концентрации кортизола в крови представляют собой кривую с резкими подъемами и падениями. Такой «зубчатый» характер кривой обусловлен импульсной секрецией гомона в течение суток. Максимальные по амплитуде импульсы секреции имеют место утром, а минимальные – вечером и ночью. Таким образом, наивысший уровень секреции кортизола в крови регистрируется утром, затем наблюдается постепенное снижение до минимального уровня в вечернее и ночное время. Нормальный суточный ритм гормонов свидетельствует о целостности функционирования всех звеньев системы гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников, тогда как любые его нарушения отражают те или иные поломки в системе регуляции.

Суточный ритм обеспечивается рядом факторов: внутренний водитель ритма надпочечников, который определятся их иннервацией; внутренний водитель ритма гипоталамуса, где происходит синтез и секреция кортиколиберина, контролирующего ритмическую продукцию АКТГ в гипофизе; пищевой цикл; смена дня и ночи, фазы сна Суточные ритмы АКТГ и кортизола могут изменяться не только в результате гормональных нарушений в системе гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников, но и под влиянием как психоэмоциональных, так и разнообразных внешних физических факторов. В связи с существованием четкого суточного ритма содержания гормонов в крови, в ряде патологических ситуаций однократному определению концентрации гормона следует предпочесть определение его суточного профиля.

Современные возможности гормонального анализа позволяют определять все основные надпочечниковые стероиды, включая 18-гидроксикортикостерон, кортикостерон, 11-дезоксикортикостерон, 18-гидрокси-11-дезоксикортикостерон, альдостерон, прегненолон, прогестерон, 17-гидроксипрегненолон, 17-гидроксипрогестерон, 11-дезоксикортизол, кортизол, а также дегидроэпиандростерон, его сульфатную форму и андростендион. Ряд стероидов можно определить без предварительного их хроматографического выделения, но в оптимальном варианте этот этап необходим до проведения реакции иммуноанализа. Необходимость определения вышеназванного спектра стероидов требуется для выяснения характера ферментативного нарушения стероидогенеза, например, при врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН), хотя в рутинной диагностике основным маркером является уровень 17-гидроксипрогестерона, позволяющий выявить наиболее распространенную форму этого заболевания, обусловленную дефицитом 21-гидроксилазы.
^ Адренокортикотропный гормон (АКТГ). Общие сведения.
АКТГ образуется в результате протеолитического расщепления проопиомеланокортина (ПОМК), состоящего из 241 аминокислотного остатка. ПОМК служит источником для образования еще нескольких соединений: - и -меланоцитстимулирующие гормоны (-МСГ и -МСГ), β-эндорфины, - и -липотропные гормоны.

АКТГ состоит из 39 аминокислотных остатков, продуцируется кортикотрофами передней доли гипофиза. Он стимулирует синтез и секрецию глюкокортикоидов (прежде всего, кортизола) корой надпочечников. Его трансформация происходит преимущественно в печени и в небольшом количестве - в почках. Биологическая активность АКТГ связана с амино-концевым фрагментом молекулы. Именно поэтому синтетические аналоги АКТГ1-24, АКТГ1-23 и АКТГ1-20 в молярной концентрации имеют такую же биологическую активность, как и целая молекула нативного АКТГ1-39. В крови общей циркуляции он не связывается с другими белками, поэтому период его полужизни не превышает 10 минут. Его трансформация происходит преимущественно в печени и в почках (в небольшом количестве). Биологическая активность АКТГ исчезает быстрее, чем его иммунная активность.

Импульсные периоды секреции кортизола клетками коры надпочечников возникают под влиянием АКТГ, секреция которого гипофизом также изменяется в течение суток (максимальное содержание утром и минимальное  вечером). Количество секреторных импульсов секреции АКТГ в большинстве случаев совпадает с таковым для кортизола, причем подъем концентрации АКТГ в крови опережает начало повышения содержания кортизола приблизительно на 10 мин.

Таким образом, время сбора образцов крови имеет принципиальное значение, оптимальный вариант 08.00 – 10.00 ч.

В настоящее время повысилась надежность методов иммунноанализа АКТГ в плазме крови. Базальный его уровень колеблется в широком диапазоне – от 20 до 80 пг/мл. Выбор оптимального коммерческого набора – очень важный момент в работе лаборатории. Большие колебания концентрации АКТГ диктуют необходимость параллельного определения и кортизола.


^ Сравнительная характеристика методов определения АКТГ.

Характеристика метода

Название метода, результаты измерения




• Иммунорадиометрический анализ (Immunotech, Франция)

•• Электрохемилюминисцентный анализатор Elecsys (Hoffmann-La Rоche, Швейцария)

Чувствительность

• 1,2 пг/мл

•• 1,0 пг/мл

Специфичность

• 0,1% перекреста с α-МСГ

•• 1,65 перекреста с ПОМК

Исследуемый материал

Плазма с ЭДТА (0,2 мл 5% раствора на 5 мл крови)

Выраженный суточный ритм

Объем плазмы для анализа

0,5 мл

Подготовка анализа

Немедленно центрифугировать с охлаждением, использовать пластиковые или силиконированные стеклянные пробирки

Подготовка пациента

Не требуется

Нормальные величины

• 7-55 пг/мл (утро)

•• 10-60 пг/мл (утро); 0-30 пг/мл (вечер)

Диагностическое значение

↑ Первичная надпочечниковая недостаточность (болезнь Аддисона), врожденная дисфункция коры надпочечников, АКТГ-эктопический синдром, синдром Нельсона, посттравматические и постоперационные состояния

↓ Вторичная надпочечниковая недостаточность, рак или аденома коры надпочечников, гипопитуитаризм, прием глюкокортикоидов



^ Кортизол (гидрокортизон). Общие сведения.
Кортизол представляет собой С-21 стероид с активными функциональными гидроксигруппами в 11, 17 и 21 положениях. В настоящее время определение кортизола в образцах плазмы или сыворотки крови, полученных в утренние и вечерние часы, является первичным подходом для оценки состояния глюкокортикоидной функции надпочечников в рутинной диагностике. У здоровых людей перепад между концентрацией кортизола в утренние и дневные часы достигает 50%, а между утренним и вечерними - 350% .

Кора надпочечников секретирует кортизол в свободной форме. Попадая в кровоток, кортизол связывается с белками плазмы крови. Более 90% кортизола связывается со специфическим транспортным белком – транскортином (КСГ) и в небольшом количестве – с альбумином. В связанном состоянии кортизол теряет биологическую активность, и лишь свободный кортизол обеспечивает его активирующий эффект а на ткани-мишени взаимодействую со специфическим рецепторным аппаратом.

^ Определение общего кортизола в сыворотке крови
Концентрация кортизола в крови определяется как уровнем активности системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники, так и его метаболическим клиренсом. Содержание свободной биологически активной фракции кортизола не превышает 3%. Изменение связывающей способности транскортина под влиянием как экзогенных, так и внутренних факторов, может существенно влиять на концентрацию общего кортизола в крови, изменяя его метаболический клиренс. Поэтому во многих случаях определение количественных параметров общего кортизола не отражают клиническую картину заболевания.

По общепринятым представлениям, транспортные белки служат резервуаром для гормонов и тем самым увеличивают продолжительность их жизни. Благодаря этому механизму регулируется как скорость их метаболизма, так и доступность к рецепторам тканей мишеней. Свободный кортизол ответственен также за механизм регуляции секреции глюкокортикоидов по принципу отрицательной обратной связи.

Важно отметить, что в физиологических условиях уровень свободного кортизола коррелирует с уровнем общего кортизола. Однако при повышении уровня общего кортизола свыше 680 нмоль/л связывающая емкость транскортина достигает своего предела и тем самым нарушается взаимное соответствие показателей общего и свободного кортизола. Увеличение концентрации последнего в несколько раз превышает интенсивность прироста общего кортизола в крови.

Существует несколько “прямых” методов, позволяющих оценить количество кортизола, которое продуцируется надпочечниками в течение суток. Один из них  метод разведения стабильного изотопа (масс-спектрография). В разных работах сообщается об уровне продукции кортизола у здоровых людей от 8,0 до 25,0 мг/день (5,7-6,8 мг/м2/день). При синдроме и болезни Кушинга она возрастает до 30,99,3 мг/день, а при надпочечниковой недостаточности его продукция резко падает.

^ Общий кортизол. Сравнительная характеристика методов.

Характеристика метода

Название метода, результаты измерения




• Автоматический люминесцентный анализатор Vitros ECi (Ortho Clinical Diagnostics, Великобритания)

•• Электрохемилюминесцентный анализатор Elecsys (Hoffmann-La Roche, Швейцария)

••• Радиоиммунологический метод (ВОЗ, ЭНЦ)

•••• Автоматизированная система Autodelfia (Финляндия)

••••• Иммуноферментный метод (IBL, Германия)

Чувствительность метода

• 3 нмоль/л

•• 0,5 нмоль/л

••• <20,0 нмоль/л

•••• 15,0 нмоль/л

••••• 0,4 нмоль/л

Исследуемый материал

Сыворотка или плазма

09.00–11.00 ч (выраженный суточный ритм и реакция на стресс)

Специфичность

• Перекрест с 11-дезоксикортизолом – 1,3%. кортикостероном - 10,2%, кортизоном – 1,3%, преднизолоном – 31,6%

•• Перекрест с кортикостероном - 5,8%, 11-дезоксикортизолом - 41%, 21-дезоксикортизолом - 45%

•••• Перекрест с преднизолоном 62,7%, с кортизоном 34,7%, кортикостероном – 27,7%

••••• Перекрест с преднизолоном 57,0%, с кортизоном и кортикостероном – 2.5%

Подготовка пациента

Не требуется

Нормальные величины

• Утро 123-626 нмоль/л, вечер 46-389 нмоль/л

•• Утро 171-536 нмоль/л, вечер 64-327 нмоль/л

••• Утро 160-660 нмоль/л

•••• Утро 201-681 нмоль/л

••••• Утро 138-689 нмоль/л, вечер 55-331 нмоль/л

Диагностическое значение

 Болезнь Иценко–Кушинга, аденома и рак надпочечников, синдром эктопической продукции АКТГ

 Болезнь Аддисона, вторичная надпочечниковая недостаточность, ятрогенная надпочечниковая недостаточность, ВДКН


Как видно из представленной таблицы, все используемые методы обеспечивают достаточно приемлемый диапазон колебаний его нормативного уровня, что важно для интерпретации результатов, полученных в разных лабораториях.

При оценке клинической значимости количественных параметров уровней кортизола необходимо всегда помнить, что он является стрессорным гормоном и повышение его уровня является следствием активации системы гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников. Такие состояния как острое заболевание, травма, хирургическое вмешательство, депрессия, особенно большая, алкоголизм, страх, голодание, анорексия невроза, хроническая почечная недостаточность сопровождаются повышением уровня кортизола.

Определение общего кортизола без учета связывающей емкости транскортина может приводить в некоторых случаях к диагностическим ошибкам. Так, например, это может иметь место при беременности, при использовании гормональных контрацептивов, содержащих эстрогены. В этом случае существенное увеличение уровня циркулирующего кортизола обусловлено не активацией его синтеза и секреции, а связано с повышением емкости транскортина. Тем самым увеличивается период полужизни кортизола и уменьшается скорость его инактивации и выведения из организма. Необходимо иметь в виду, что нормализация уровня кортизола после родов или прекращения приема контрацептивов может занимать несколько недель.

Увеличение концентрации транскортина может быть также при гиперфункции щитовидной железы, диабете, при ряде заболеваний кроветворной системы. Cнижение концентрации этого транспортного белка наблюдается при гипотиреозе, заболеваниях печени, нефротическом синдроме, множественной миеломе, ожирении. Нельзя забывать, что любое изменение концентрации транскортина ведет и к изменению уровня общего кортизола в крови.

Следует иметь в виду, что прием L-дофа или пирогенных препаратов может стимулировать выброс АКТГ, тогда как прием амфитамина стимулирует выброс кортизола. Повышение уровня кортизола можно наблюдать при стрессорных ситуациях, после наркоза, при беременности, ожирении, гипертиреозе, тогда как гипотиреоз, цирроз печени, гепатит приводят к снижению концентрации кортизола в крови, моче и слюне.

^ Определение свободного биологически активного кортизола.
Определение свободного кортизола в крови возможно только трудоемким методом равновесного диализа, который нельзя использовать в диагностической практике.

Альтернативной биологической жидкостью является слюна.

Более 50 лет тому назад было показано, что клеточная мембрана (барьер) слюнных желез, не пропускает в слюнные протоки биологические молекулы с МВ > 400Да. Молекулярный вес всех стероидов < 400 Да и в результате только свободные формы стероидов проникают в слюнной проток.(кортизол, тестостерон, эстрадиол и др.), а гормоны, связанные с альбумином или глобулинами, транспортными белками стероидов, не проникают. Концентрация свободных биологически активных молекул стероидных гормонов в слюне очень низкая и не превышает 3-5% от общей концентрации стероидов, циркулирующих в крови.

В настоящее время в ЭНЦ разработан ультрачувствительный метод определения свободного кортизола в слюне, основанный на технологии иммуноанализа с использованием принципа усиленной люминисценции. Этот неинвазивный метод рутинно используется в странах Европы и США в комбинации с измерением общего кортизола в крови и свободной формы гормона в моче. Определение свободного кортизола в слюне является наиболее оптимальным, позволяя у каждого пациента собрать материал в любых заданных временных интервалах, не подвергая пациента стрессу.

Как и содержание общего кортизола в крови, концентрация свободного кортизола в слюне подчиняется суточному ритму. В дневные часы этот показатель снижается на 54%, а в вечерние часы на 89% (рис. 1 ).

Необходимо помнить, что градиент концентрации кортизола в крови и слюне составляет более 10 раз, и поэтому контаминация слюны кровью (микротрещины или язвочки десен и ротовой полости) может искажать результаты определения свободного кортизола в слюне. Такие пробы должны быть исключены из анализа.


^ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОГО КОРТИЗОЛА В СЛЮНЕ.


Принцип метода

Конкурентный иммунохемилюминесцентный анализ




Формат

Плашка 12 стрипов по 8 лунок каждый




Образцы

20 мкл слюны или сыворотка, разведенная не менее чем 1:50




Стандарты

7 стандартов, готовых к использованию: 0. 0.3. 0.6. 2.0.
6.0. 15.0 и 40 нг/мл




Инкубации

3 часа при температуре 18 - 22 °С. на шейкере;




Субстрат

Люминол




Ожидаемые значения



Время после пробуждения




0 -1.5 часа

1.5 – 3 часа

3-6 часов

6-9 часов

9-12 часов

1.84 – 14.5 нг/мл

1.30 – 10. 2 нг/мл

0.76 -5.68 нг/мл

0.65 – 4.68 нг/мл

0.33-3.33 нг/мл




Чувствительность

0.15 нг/мл

Точность

Внутри
одной серии: 2.9 —7.7 %

В диапазоне 0.96— 8.7 нг/мл

Между
сериями: 6.2 — 11.5 %

В диапазоне 0.75 — 6.82 нг/мл

Специфичность

Перекрестная реактивность (по методу Абрахама)

Кортикостерон

Кортизон

Преднизон

2.5%

2.0%

1.0%



При измерении свободных форм стероидов в слюне необходимо было ответить на вопрос - зависит ли их концентрация от скорости выделения слюны в протоки. Для этого были проведены специальные исследования со стимуляцией слюноотделения и сбором образцов слюны по 50 мкл каждые 30 сек. Последующие измерения концентрации кортизола показали отсутствие разницы в его содержании до и после активации слюноотделения. И тем самым, была доказана независимость его уровня в общей слюне от скорости ее выделения, что имеет принципиальное значение при интерпретации результатов.

По уровню кортизола в слюне с частым ее забором можно проследить за физиологическими колебаниями активности гипоталамо-гипофизарной-адреналовой системы на протяжении дня, месяца, года и т. д., тогда как по уровню кортизола в крови это сделать намного сложнее. На рис 1 приведена иллюстрация суточной динамики свободного кортизола в слюне у молодых мужчин и женщин в возрасте до 40 лет.



часы

Нмоль/л

Рис. 1 Динамика св. кортизола в слюне у здоровых мужчин и женщин на протяжении дня. Примечание: • - индивидуальные показатели; Медиана - сплошная линия; 10,90 процентили - пунктирные линии


Исследование слюнной жидкости для определения кортизола существенно снижает затраты, т.к. в большинстве случаев не требует госпитализации больного. Однократный визит к врачу с получением четкой письменной инструкции о правилах и временном интервале сбора слюны дома, позволяет избежать стрессорных ситуаций, связанных с посещением госпиталя, взятием крови из вены и т. д., кроме этого снижаются транспортные расходы, а так же расходы на преаналитическом этапе, которые зачастую превышают стоимость самого гормонального теста. Стоимость теста кортизола в слюне не превышает его определения в крови.

Определение свободного кортизола в слюне является методом выбора при первичном обследовании пациентов с подозрением на БИК. Наиболее информативны вечерние показатели содержания св. кортизола в слюне, которые более чем ы 3 раза превышают показатели здоровых людей. ( Рис. 2). В мировой практике определение св. кортизола в слюне в утреннее и вечернее время рассматривается как “золотой” стандарт в оценке глюкокортикоидной функции надпочечников.


Контроль

БИК

Нмоль\л

Р=0.000*

Р=0.000*

08:30-09:30 ч.

22:.00 -23:00 ч. ч.ч. ч.


Р
2
ис. 2 Средние показатели ( Ме,10-,90-ый процентиль) уровня свободного кортизола в слюне в утренние и вечерние часы у пациентов с БИК до лечения и у здоровых людей.

Определение кортизола в слюне радикально облегчает проведение функциональных тестов с АКТГ, дексаметазоном, инсулином и исключает влияние стресса на гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему, обусловленного многократным забором крови. И, самое главное, содержание кортизола в слюне отражает концентрацию свободной, физиологически активной фракции гормона, циркулирующего в крови, тогда как его определение в сыворотке крови отражает уровень общего кортизола, т. е. связанного с транскортином и альбумином. Изменение его концентрации не всегда является следствием изменения функции системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Во многих случаях изменение концентрации общего кортизола в крови обусловлено нарушением связывающей способности транскортина, на продукцию которого в печени оказывает влияние ряд фармакологических препаратов, включая аспирин, а также изменение гормонального гомеостаза. Кортизолсвязывающий глобулин (транскортин) и альбумин исследуемой плазмы могут конкурировать с антисывороткой к кортизолу в иммунологической реакции и, тем самым, создавать “неспецифический эффект” с искажением полученных результатов. Эти проблемы требуют затратных технологических решений, чтобы уменьшить обозначенные помехи. Слюнная жидкость не содержит в значимых количеств белка и тем самым является оптимальным биологическим материалом, позволяющим избежать указанную проблему. Кроме этого, определение кортизола в слюне, равно как и других стероидов, позволяет избежать проблему матрикса в иммуноанализе и готовить калибрующую кривую стандарта не в безстероидной плазме (при их определении в плазме), а в буферном растворе. Это принципиально уменьшает стоимость технологии и повышает точность и надежность работы метода. Кроме того, в случае гемолиза крови регистрируются искажения результатов, что создает дополнительные диагностические трудности, особенно проблемные для современных прямых автоматизированных систем определения стероидных гормонов.

Мониторинг терапии надпочечниковой недостаточности производными гидрокортизона.

Наибольший интерес представляет возможность использования свободного кортизола в слюне для мониторинга терапии глюкокортикоидными препаратами, поскольку неинвазивоность получения образцов слюны дает возможность проводить частый сбор образцов в различных временных режимах и тем самым проследить индивидуальную факрмакокинетику вводимого препарата. Уровень свободного кортизола в слюне является чувствительным маркером подавления секреции эндогенного кортизола при терапии метипредом и может быть использован для индивидуального мониторинга терапии синтетическими глюкокортикоидами (СГК).

Необходимо отметить, что во всех случаях, при оценке адекватности заместительной терапии могут возникать определенные трудности в интерпретации результатов, особенно по уровню общего кортизола в крови и в меньшей степени уровню свободного кортизола в слюне и в моче. Эти трудности связаны с рядом факторов:

наличие перекрестных реакций в процессе иммуноанализа кортизола с близкими по структуре СГК. При этом в зависимости от химического строения препарата и его фармакокинетики изменяется интенсивность и динамика его интерферирующего эффекта.

обоснованность выбора времени забора образцов крови и слюны после приема препарата. Для этого необходимо учитывать способ введения препарата, время его полураспада, степень связывания с транскортином и альбумином плазмы, состоянием ЖКТ, печени, почек. Перечисленные факторы определяют продолжительность и оптимальный временной режим терапии глюкокортикоидными препаратами. Все это обуславливает необходимость индивидуального мониторинга за динамикой свободного кортизола в период отработки доз вводимого препарата и последующего мониторинга адекватности используемого режима лечения.



^ Определение свободного кортизола в моче
Более 20 лет тому назад в диагностической практике ЭНЦ начали использовать метод определения свободного кортизола, экскретируемого с мочой. Несмотря на то, что только 1% кортизола в свободной форме выделяется с мочой, он обозначен как наиболее информативный тест в оценке глюкокортикоидной функции и является наиболее информативным маркером для диагностики гипер- и гипокортицизма.

Определению свободного кортизола в моче предшествует этап экстракции мочи этиловым эфиром или метиленхлоридом, а затем определяется любым из методов – РИА или ИФА, либо методом жидкостной хроматографии.

Определение стероида в порциях мочи, собранной через каждые 4 ч, позволяет выявить наличие суточного ритма. У пациентов с адреналовой недостаточностью экскреция свободного кортизола резко снижена как в утренние, так и в вечерние часы. Достаточно информативно и определение кортизола в моче, полученной за короткий период времени, при расчете его концентрации на объем мочи. Это дает возможность использовать данный метод в амбулаторных условиях, как и метод определения свободного кортизола в слюне.

Для оценки правильности сбора мочи и соблюдения адекватной диеты желательно параллельно определять экскрецию креатинина. Содержание креатинина в суточной моче достаточно стабильно для каждого пациента (варьирует не более чем на 10%) и составляет до 2 г в сутки. Поэтому в некоторых случаях более правильно определять отношение концентрации свободного кортизола на 1г креатинина в суточной моче

Определение свободного кортизола в суточной моче позволяет провести более точную дифференциацию между здоровыми лицами и пациентами с синдромом Кушинга. Кортизол, выделяемый в мочу в неизмененном виде, относится к фракции свободного кортизола. Между свободным кортизолом в моче и несвязанным, а потому биологически-активным кортизолом, содержащимся в крови, как правило, существует прямая пропорциональная зависимость.

У здоровых людей суточная экскреция свободного кортизола колеблется от 120 до 400 нмоль/24 ч при определении радиоиммунологическим методом, от 60 до 413нмоль//24 ч при использовании анализатора Витрос.

^ Свободный кортизол в моче. Сравнительная характеристика методов.

Характеристика метода

Название метода, результаты измерения




• Автоматический люминесцентный анализатор Vitros ECi (Ortho Clinical Diagnostics, Великобритания)

•• РИА (ЭНЦ )

Чувствительность

• 3,0 нмоль/л

•• <10,0 нмоль/л

Исследуемый материал

Моча (с известным суточным объемом, тщательно перемешанная)

Объем мочи для анализа

1 мл

Подготовка анализа

Предварительная экстракция образцов мочи диэтиловым эфиром

Подготовка пациента

Не требуется

Нормальные величины

• 60–413 нмоль/сут

•• 120–400 нмоль/л

Диагностическое значение

 Болезнь Иценко–Кушинга, аденома и рак надпочечников, синдром эктопической продукции АКТГ

 Болезнь Аддисона, вторичная надпочечниковая недостаточность, ятрогенная надпочечниковая недостаточность, ВДКН

Повышенное потребление жидкости с увеличением суточного объема мочи часто приводит к завышению уровня свободного кортизола в суточной моче.


Нормативные показатели концентрации кортизола и АКТГ у здоровых людей и больных с гиперкортицизмом (разброс, 10-90 перцентили) по данным лаборатории биохимической эндокринологии и гормонального анализа ЭНЦ

Показатель, время определения

Ед. измерения

Болезнь Иценко-Кушинга

Синдром Кушинга

Здоровые доноры

Кортизол (кровь) - 8.00

нмоль/л

406,2-1364,5

454,1-1563,9

283,6-604,6

Кортизол (кровь) – 23.00

нмоль/л

441,4-1408,2


369,8-1368,6

25,3-140,1

Кортизол (слюна) – 8.00

нмоль/л

26,3-54,5

-

8,1-24,7

Кортизол (слюна)– 23.00

нмоль/л

15,3-29,8

-

0,6-3,3

Св. кортизол (сут. моча)

нмоль/сут

570,6-1768,5

-

98,1-267,7

Св. кортизол/1г креатинина

мкг/г

236,2-928,2

-

29,7-121,3

АКТГ – 8.00

пг/мл

29,7-205,1

2,0-21,2

22,7-72,1

АКТГ-23.00

пг/мл

20,3-168,2

1,0-21,5

3,0-45,2

Примечание:

определение кортизола в сыворотке и моче проводили с помощью автоматизированной системы Vitros ECi (Ortho-Clinical Diagnostics, Великобритания),

определение кортизола в слюне – люминисцентный метод коммерческими наборами фирмы IBL (Германия),

определение АКТГ – радиоиммунный метод фирмы CIS-bio International (Франция);

«-« - нет данных

^ Показания к определению кортизола и АКТГ.
Измерение уровня АКТГ в плазме крови, совместно с измерением кортизола, используется для выявлений возможных нарушений функциональной активности системы гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников.

Гиперкортицизм

1. АКТГ-зависимый синдром Иценко-Кушинга (до 90% всех случаев гиперкортицизма)

- болезнь Иценко-Кушинга, вызываемая опухолью гипофиза или гиперплазией кортикотрофов аденогипофиза

- АКТГ-эктопический синдром, вызываемый опухолями эндокринной и неэндокринной систем, секретирующими КРГ и/или АКТГ (клетки карциномы, локализованных в легких, средостении, тимусе, бронхах и т.п.).

2. АКТГ-независимый синдром Кушинга (встречается в 15-20% всех случаев)

- опухоль коры надпочечника (доброкачественная = кортикостерома или злокачественная = кортикобластома)

- микроузелковая дисплазия коры надпочечников

- макроузелковая гиперплазия коры надпочечников

3. Функциональный гиперкортицизм может наблюдаться при ожирении, гипоталамическом синдроме, сахарном диабете, алкоголизме, заболеваниях печени, беременности, депрессии

4. Экзогенный гиперкортицизм, связанный с длительным применением синтетических кортикостероидов при различных заболеваниях (например, бронхиальная астма,ревматоидный артрит и другие коллагенозы).

Гипокортицизм

Гипопитуитаризм с изолированным дефицитом АКТГ или пангипопитуитаризм

Хроническая (первичная) недостаточность коры надпочечников (болезнь Аддисона)



^ Изменение показаний концентрации кортизола в биологических жидкостях при патологии.
В большинстве случаев болезнь Иценко-Кушинга биохимически характеризуется повышением концентрации АКТГ и кортизола в крови, особенно во вторую половину дня и ночью. Секретируемое за сутки количество АКТГ в 19 раз, а кортизола – в 7 раз выше, чем в норме. Возрастание продукции кортизола происходит благодаря комбинированному влиянию нескольких факторов: увеличение числа импульсов с высокой секреторной активностью, и повышением количества секретируемого в эти периоды секреции, увеличение базальной, внеимпульсной секреции кортизола. В результате у большинства больных БИК или отсутствует суточный ритм АКТГ и кортизола в крови, или значительно сглажен (перепад между утренним и вечерним уровнем составляет лишь 35-40%)

У пациентов с диагнозом болезни Иценко-Кушинга содержание свободного кортизола в слюне до лечения в утренние, дневные и вечерние часы значимо превышало аналогичные показатели у здоровых людей. ( Рис 2)

Результаты динамики свободной фракции гормона в слюне также демонстрируют нарушения суточного ритма свободного кортизола у пациентов с БИК до лечения. Содержание свободного кортизола в слюне в вечернее время снижается в среднем на 50% , в отличие от характерного для здоровых людей падения концентрации на 80-90% . В диагностике БИК чувствительность метода определения свободного кортизола в слюне в 22:00-23:00 ч по нашим данным и данным зарубежных авторов составляет 100%. Именно поэтому данный тест является наиболее информационным в постановке диагноза.

При ожирении суточный ритм АКТГ и кортизола в крови сохраняется, а экскреция свободного кортизола с мочой не увеличивается, что важно для проведения дифференциальной диагностики при подозрении на синдром Кушинга.

При первичной надпочечниковой недостаточности, в зависимости от степени её выраженности, уровень АКТГ обычно превышает 200 пг/мл, но может достигать 1000 пг/мл и выше, уровень кортизола при этом значительно снижен. При синдроме Кушинга, обусловленным опухолью, которая секретирует избыточные количества кортизола, и при микро- или макроузелковой гиперплазии надпочечников, концентрация АКТГ достаточно низка и может составлять менее 20 пг/мл в утренние часы. При гиперсекреции АКТГ аденогипофизом (болезнь Иценко-Кушинга) его плазменный уровень п