Лекция: МГЭ прокариот и эукариот: транспозоны и ретротранспозоны (хар-ка и механизм транспозиции).

МГЭ- это последовательности нуклеотидов, которые могут перемещаться по геному.

^ МГЭ прокариот: IS-элементы (длина 700-1500 п.н) содержат инвертированные повторы, ген транспозазу.

Транспозоны- последовательность ДНК, способная перемещаться внутри генома. Встраиваясь в геном, могут вызывать мутации.

Различают простые (ген транспозаза и доп. Гены):

и сложные (доп. гены):

МГЭ прокариот перемещаются по принципу копирование, встраивание (кол- во копий увеличивается).

^ МГЭ эукариот: ДНК-транспозоны (p-элементы дрозофил) — перемещаются по принципу вырезание, встраивание (кол- во копий не увеличивается). Полинтрон (до 15 тыс. п.н.)- кодируют до 10 белков, один из которых ДНК-полимераза, которая в качестве праймера использует белок. Содержит инвертированные повторы. Перемещается по принципу копирование, встраивание. Хелитроны — на концах нет инвертированных повторов, перемещаются по принципу копирование, встраивание. Копирование осуществляется по принципу «катящегося кольца» (сигма-тип). Ретротранспозоны — похожи на ретровирусы, но утратили способность образовывать вирусные частицы. Различают: с LTR(с длинными концевыми повторами) и без LTR.

Функции МГЭ: Биологические мутагены; могут изменять активность близлежащих генов; могут встраиваться в различные участки гомологичных хромосом.
^ 53. Принципы генной инженерии. Ферменты, используемые в генной инженерии.

Генная инженерия – это набор специальных методов для создания генно-инженерных конструкции.

Принципы: Конструирование рекомбинантных молекул ДНК; Перенос ДНК в клетки реципиенты; Селекция и отбор трансформированных клеток; Клонирование рекомбинантной ДНК в клетках хозяина.

Ферменты: эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигазы, обратная транскриптаза, концевая трансфераза, Taq-полимераза, ДНК-полимераза 1 (фрагмент Кленова), РНКаза H .
^ 54.Создание рекомбинантных ДНК (понятия вектор, вставка). Принципы молекулярного клонирования в составе генетического вектора.

Концепция создания рекомбинантной ДНК: вектор-вставка.
Вставка – это чужеродная ДНК, встроенная в вектор

Вектор – это молекула ДНК, которую используют для переноса рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина с целью ее размножения и клонирования.

Для вставки используют: геномную ДНК, выделенную из клеток; гены, синтезированные в пробирке; копии ДНК, полученные с помощью фермента обратной транскриптазы на РНК- матрице.

Характеристика вектора:вектор должен содержать точку начала репликации (origin) для самостоятельной репликации в клетке-хозяине; вектор должен иметь два селективных маркера для отбора и клонирования трансформированных клеток хозяина. В качестве векторов используют: плазмиды, вирусы, космиды (плазмиды, которые содержат cos-сайты фага l), бактериофаги, Yac(yeast artificial chromosomes) – искусственные хромосомы дрожжей.

Принципы молекулярного клонирования:

Клонирование – это получение большого количества копий определенного гена в результате его размножения в клетках в составе рекомбинантной ДНК

Клонирование фрагмента ДНК включает несколько последовательных этапов:

1) встраивание клонируемого (чужеродного) фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (образование химерной молекулы — рекомбинантной ДНК);

2) проникновение этой конструкции в бактериальную клетку-хозяина;

1. 
   идентификация клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, и их отбор (как правило, осуществляется на селективной среде);
2. 
   получение необходимого количества клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (собственно клонирование). При необходимости индуцируют экспрессию клонированного гена в клетках-хозяевах и получают кодируемый им белок.