Реферат: Методические рекомендации по выполнению лабораторного и научно-исследовательского практикума для студентов всех форм обучения специальностей 240901 «Биотехнология» и260204 «Технология бродильных производств и виноделие»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ


Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Алтайский государственный технический университет

имени И.И. Ползунова»


Бийский технологический институт (филиал)


М.Э. Ламберова, Ю.А. Кошелев, Т.И. Войнаровская


ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE


Методические рекомендации по выполнению лабораторного

и научно-исследовательского практикума для студентов всех форм

обучения специальностей 240901 «Биотехнология»

и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие»


Бийск 2007


УДК 576.8.(075.8)


Ламберова, М.Э. Оценка эффективности культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae: методические рекомендации по выполнению лабораторного и научно-исследовательского практикума для студентов всех форм обучения специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» / М.Э. Ламберова, Ю.А. Кошелев, Т.И. Войнаровская.


Алт. гос. тех. ун-т, БТИ.  Бийск.

Изд-во Алт. гос. тех. ун-та, 2007.  69 с.


Настоящие методические рекомендации содержат общие сведения о классификации, морфологических, физиологических свойствах дрожжей; методики проведения аэробного и анаэробного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на синтетической питательной среде, содержащей минеральные соли и сахарозу; методики приготовления реактивов и проведения анализа сахаров и этилового спирта в питательной среде и культуральной жидкости. Приведены методы подбора оптимальных условий оживления и культивирования, подсчета числа жизнеспособных клеток дрожжей и посторонней микрофлоры в исходных дрожжах и в конечной суспензии, оценки стерильности и состава питательной среды и эффективности аэробного и анаэробного культивирования в соответствии с производственными нормативными документами.


Рассмотрены и утверждены на

заседании кафедры «Биотехнология».

Протокол № 81 от 16 ноября 2006 г.


Рецензент: к.т.н. зав. кафедрой перерабатывающей

промышленности лицея 22 Е.Н. Широкова (г. Бийск)


 Ламберова М.Э., Кошелев Ю.А., Войнаровская Т.И., 2007

 БТИ АлтГТУ, 2007

Введение


Дрожжи различных таксономических групп играют положительную и отрицательную роль в подавляющем числе пищевых и бродильных производств. Особенно широкое применение имеют хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

Лабораторный и научно-исследовательский практикумы по специальности 240901 «Биотехнология» по курсам: общая биология и микробиология; особенности микроорганизмов в производственных процессах; биохимия; химия и технология пищевых производств; теоретические основы биотехнологии; общая биотехнология; технология продуктов брожения, а также по специальности 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» по курсам: микробиология; биохимия; пищевая химия; введение в технологию пищевых производств; особенности микроорганизмов в производственных процессах; общая технология отрасли; технология органических кислот; технология дрожжей; технология отрасли (спирт, пиво, вино) и другим предполагают реактивацию и культивирование дрожжей в аэробных и анаэробных условиях на питательных средах с углеводами и оценку эффективности прироста дрожжевой биомассы и продуктов жизнедеятельности дрожжей, имеющих практическую значимость (этиловый спирт, органические кислоты, углекислый газ и др.), оценку качества посевного материала дрожжей, его специфическую стерильность, количественный подсчет клеток дрожжей и посторонней микрофлоры на поверхности агаризованной питательной среды, определение в питательной среде содержания сахарозы, этанола и углекислого газа, а также характеристику эргостерина, биосинтез его в клетке продуцентов, промышленный и лабораторный методы получения эргостерина из биомассы дрожжей.

В данных методических рекомендациях суммированы все необходимые методики и приведен алгоритм действий, предусмотренных производственной нормативной документацией.


^ 1 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ


1.1 Задание


Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae провести в аэробных и анаэробных условиях на питательной среде: сахароза + минеральные соли.

В результате определить следующие показатели:

- убыль субстрата сахарозы из питательной среды в результате их утилизации дрожжами;

- прирост биомассы дрожжей;

- количество выделившегося этанола в питательной среде;

- количество выделившегося углекислого газа;

- эффективность образования биомассы по субстрату;

- эффективность образования этанола по субстрату;

- эффективность образования углекислого газа по субстрату;

- наличие эргостерина в биомассе дрожжей.


^ 1.2 Оценка жизнеспособных клеток дрожжей в сравнении

с количеством посторонней микрофлоры


Перед началом эксперимента необходимо проверить жизнеспособность и чистоту культуры дрожжей.


^ 1.2.1 Приготовление агара питательного


3,8 г готового сухого препарата агара питательного размешиваем в 100 мл дистиллированной воды и нагреваем до полного растворения агара на водяной бане. Фильтруем в колбу на 250 мл, закрываем ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком, стерилизуем автоклавированием в течение 20 минут при температуре 120 С. Среду охлаждаем до температуры 4550 С и разливаем, помещаем в термостат на 48 часов при температуре 37 С для проверки стерильности.


^ 1.2.2 Приготовление стерильных разведений клеточной

суспензии


Берем 0,1 г сухих дрожжей и заливаем 2 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживаем 1 час при комнатной температуре.
В другом случае берем 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей 75%-ной влажности, добавляем 5 мл стерильной дистиллированной воды. Затем (в любом из двух случаев) стерильной пипеткой отбираем 1 мл дрожжевой суспензии, переносим в пробирку, куда доливаем 9 мл стерильной воды. Тщательно перемешиваем содержимое пробирки продуванием воздуха через пипетку. Отбираем из этой пробирки 1 мл суспензии и переносим в пустую стерильную чашку Петри. Еще 1 мл из этой же пробирки переносим в следующую пробирку с 9 мл стерильной воды и т.д. Таким образом засеваем три чашки Петри, получая разведения анализируемой суспензии дрожжей в соотношениях: 1:10; 1:100; 1:1000. Помещаем чашки вверх дном в термостат при 37 С на 48 часов и проводим подсчет выросших колоний, описываем их цвет, форму, профиль, размеры и микроскопируем.

Проводим микроскопирование каждого вида выросших колоний. Для этого готовим мазки, взяв 23 изолированные колонии каждого вида, вносим на обезжиренное этиловым спиртом предметное стекло в каплю дистиллированной воды, подсушиваем, фиксируем их в пламени спиртовки и окрашиваем по Граму:

- на фиксируемый мазок накладываем фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым раствором генциана фиолетового, и выдерживаем 23 минуты;

- не промывая водой, на мазок наносим на 23 минуты раствор Люголя;

- последний, также не промывая водой, сливаем, мазок обрабатываем 96%-ным этиловым спиртом в течение 3040 секунд;

- хорошо промываем дистиллированной водой;

- дополнительно окрашиваем раствором фуксина (4050 секунд);

- промываем водой, высушиваем, микроскопируем под иммерсией, зарисовывая и описывая результаты.

Число жизнеспособных клеток дрожжей считаем по формуле:

Х = N/P, (1)

где N  число колоний дрожжей, шт.;

Р  выбранное разведение.

Отношение количества клеток посторонней микрофлоры к числу жизнеспособных клеток дрожжей вычисляем по формуле:

^ Y=X'/X100%, (2)

где Х'  число клеток посторонней микрофлоры (определяется аналогично Х).

Процент содержания посторонней микрофлоры не должен превышать 10 %, тогда посевной материал можно использовать в дальнейшем процессе.

Если результаты сравнительного подсчета посторонней микрофлоры по отношению к жизнеспособным клеткам дрожжей в посевном материале неудовлетворительные, проводим его дополнительную обработку. Для этого берем 0,1 г сухих дрожжей (или 1 г прессованных дрожжей 75%-ной влажности), заливаем 5 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживаем при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем подкисляем суспензию серной кислотой до рН = 2,0, выдерживаем в течение 10 мин и устанавливаем рН = 4,0. Делаем три разведения (1:10, 1:100 и 1:1000), засеваем в три чашки Петри с агаром питательным, которые ставим вверх дном в термостат на 48 часов при температуре 37 С. Затем подсчитываем, описываем и микроскопируем выросшие колонии (см. раздел 2).


^ 1.2.3 Приготовление питательной среды


Солевой состав:

K2HРО4·3Н2О  0,06550 г;

NH4Cl  0,10000 г;

MgSO4·7H2O  0,02000 г;

FeSO4·7H2O  0,00100 г;

СаСl2  0,00075 г;

Вода дистиллированная  100 мл;

Сахароза  5 г.


В колбу на 250 мл вносим навески всех солей и 50 мл дистиллированной воды, закрываем ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком и автоклавируем при температуре 120 С в течение 20 минут.

В другую колбу на 100 мл вносим навеску сахарозы 5 г и 50 мл дистиллированной воды. Закрываем колбу ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком и автоклавируем при температуре 112 С в течение 20 минут. Затем оба раствора выдерживаем 48 часов в термостате для проверки стерильности, затем стерильно сливаем вместе перед спиртовкой и снова выдерживаем 48 часов в термостате для проверки стерильности готовой жидкой синтетической питательной среды с целью культивирования дрожжей в аэробных или анаэробных условиях.


^ 1.3 Количественное определение сахаров в питательной среде после автоклавирования и культивирования


1.3.1 Приготовление растворов для анализа


1. Раствор сернокислой меди (СuSО4·5H2O) 8%-ный. После приготовления раствор фильтруем.

2. Щелочной раствор сегнетовой соли (С4Н4О6КNa·5Н2О). Едкого натра NaOH 15 г растворяем в мерной колбе на 50 мл дистиллированной водой, все время смешивая до полного растворения, сюда же добавляем 20 г сегнетовой соли, смешиваем до растворения и добавляем воду до метки. Фильтруем в склянку из темного стекла. Храним раствор в темноте.

3. Фелингова жидкость является смесью равных объемов растворов 1 и 2. Готовим непосредственно перед использованием.

4. Раствор марганцевокислого калия. 5 г КМnО4 растворяем в одном литре кипяченой дистиллированной воды, фильтруем в склянку из темного стекла. Через пять дней устанавливаем титр раствора.

Для этого в стеклянном бюксе высушиваем в сушильном шкафу при температуре 120 С щавелевокислый натрий в течение 2 часов. После остывания бюкса из него в химические стаканы или колбы для титрования берем три навески щавелевокислого натрия по 0,200,25 г, приливаем туда же по 50 мл дистиллированной воды и 12 мл конценитрированной Н2SO4. Смесь нагреваем до 70 С, и горячую смесь титруем из бюретки 0,5%-ным раствором КМnО4 до слабо-розового окрашивания. Количество миллилитров, соответствующее 1 мл КМnО4, вычисляем по формуле:

C = B·K/M, (3)

где В  навеска щавелевокислого натрия, мг;

М  количество раствора КМnО4, пошедшего на титрование, мл;

К  коэффициент пересчета (К=0,9483).

Подставив полученные при титровании данные, находим С, затем вычисляем Сср.

0,5%-ный раствор КМnО4 перед титрованием пробы питательной среды разводим в пять раз и получаем 0,1%-ный раствор.

5. Раствор сернокислого окисного железа. 5 г сернокислой окисной соли железа Fe2(SO4)3 растворяем в мерной колбе на 100 мл дистиллированной водой, сюда же добавляем 11 мл концентрированной Н2SО4 (1,84 г/см3). Раствор не должен обладать восстанавливающими свойствами, поэтому к нему по каплям добавляем раствор КМnО4 до появления чуть слабо-розового оттенка. Затем объем раствора доводим до метки.

^ 1.3.2 Ход анализа


В центифужные пробирки вносим по 4 мл питательной среды. Добавляем 4 мл жидкости Фелинга и содержимое перемешиваем. Жидкость должна быть голубой. Если ее цвет стал бурым, это означает, что не хватило жидкости Фелинга и нужно взять меньше питательной среды. Пробирки ставим на 10 мин на кипящую водяную баню до выпадения красно-бурого осадка закиси меди. Затем пробирки охлаждаем в воде, содержимое их центрифугируем при 2000 об/мин в течение пяти минут. Надосадочную жидкость декантируем и край пробирки подсушиваем фильтровальной бумагой. Следить, чтобы осадок не сливался!

Сразу после сливания жидкости к осадку добавляем 2 мл горячей дистиллированной воды, осадок встряхиваем, постукивая пальцами по дну пробирки. Затем приливаем 57 мл горячей воды, обмывая ею стенки пробирки, и снова центифугируем, а затем сливаем жидкость. Промывание водой производим 34 раза. После промывания осадка в пробирке немедленно приливают 2 мл горячей дистиллированной воды. К взмученному палочкой осадку приливают 3 мл раствора сернокислого оксида железа, продолжая помешивать палочкой до полного растворения осадка закиси меди (палочку оставляем в пробирке).
В результате раствор в пробирке становится зеленоватым. Не вынимая палочки, раствор титруем до бледно-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 минуты, 0,1%-ным раствором КМnО4, который готовим из 0,5%-ного раствора перед титрованием. Параллельно ставим контроль. Для этого вместо питательной среды берем 4 мл дистиллированной воды. Ход дальнейшей работы тот же, что и с питательной средой. Содержание общего количества сахаров (в процентах) рассчитываем по следующей формуле:

S = (a – b)·(c/5) V 100/(KBV1), (4)

где а  количество раствора КМnО4, пошедшего на титрование питательной среды, мл;

b  количество раствора КМnО4, пошедшего на титрование контрольной пробы, мл;

с/5=10; 13/5=2,026 (определение описано выше);

К  коэффициент пересчета, равный 1,9;

^ В  масса сахарозы, мг;

V  общий объем питательной среды, мл;

V1 объем среды, взятый на анализ, мл;

100  коэффициент для пересчета в проценты.


^ 1.4 Культивирование дрожжей в аэробных условиях


1.4.1 Подготовка посевного материала дрожжей


В пробирку помещаем 0,5 г сухих дрожжей, туда же заливаем
5 мл стерильной дистиллированной воды, оставляем на 1 час при комнатной температуре (или 5 г прессованных дрожжей заливаем 5 мл стерильной дистиллированной воды), затем подкисляем концентрированной серной кислотой до рН = 2,0 и выдерживаем 10 минут; после этого доводим рН до 4,0, добавив несколько капель раствора NаОН. Центрифугируем суспензию дрожжей при 2000 об/мин в течение
10 минут. Взвешиваем осадок, который представляет собой оживленные дрожжи.


^ 1.4.2 Посев клеток на проверенную стерильную

питательную среду


В стерильных условиях помещаем подготовленный посевной материал дрожжей (инокулят) в проверенную в термостате жидкую питательную среду, колбу закрываем ватно-марлевой пробкой и закрепляем на термостатированной качалке, установив следующий режим: cкорость 130 об/мин, амплитуда 2, температура 37 С. Ежедневно колбу взвешиваем. Результаты взвешивания записываем. Культивирование прекращают, когда вес колбы стабилизируется и перестанет меняться.


^ 1.4.3 Оценка прироста биомассы дрожжей


Культуральную жидкость разделяем на центрифуге (10 минут, 2000 об/мин) на жидкую часть и осадок биомассы дрожжей, который затем взвешиваем. По разнице начальной и конечной массы дрожжей 100%-ной влажности (если исходная влажность дрожжей отличалась от 100 %, предварительно сделать пересчет массы) определяем прирост биомассы дрожжей в процессе их аэробного культивирования (X).


^ 1.4.4 Определение убыли сахаров в питательной среде


Содержание сахаров в культуральной жидкости определяем по методике, описанной ранее (см. п. 1.3). Затем убыль сахаров находим по разнице между начальной и конечной величиной (S).


^ 1.4.5 Определение экономического коэффициента

по приросту биомассы дрожжей


Расчет экономического коэффициента по приросту биомассы дрожжей провести по формуле:

YX/S = X/S, (5)

где X – прирост биомассы дрожжей после культивирования, г;

S – убыль сахаров в культуральной жидкости в результате культивирования дрожжей, г.

^ 1.5 Культивирование дрожжей в анаэробных условиях


1.5.1 Подготовка посевного материала


Подготовка посевного материала дрожжей осуществляется по 1.4.1.


^ 1.5.2 Посев клеток на проверенную среду


В колбу помещаем дрожжи, закрываем герметично корковой пробкой, в центр которой с помощью иголки для шприца вставлена пластиковая трубочка, другой конец последней опускаем в стакан, куда через трубочку выходит образующийся СО2. Заполненную установку ставим в термостат с температурой 37 С. Ежедневно колба взвешивается до тех пор, пока вес не перестанет меняться.

Затем проводим оценку прироста биомассы дрожжей по 1.4.3 и убыль сахаров в культуральной жидкости по 1.4.4 и рассчитываем экономический коэффициент YX/Sпо 1.4.5.


^ 1.5.3 Определение количества выделившегося СО2


Диоксид углерода, образующийся при брожении, определяем по разности масс колбы до брожения и после него с учетом прибыли биомассы и убыли сахаров.


^ 1.5.4 Качественное определение образовавшегося спирта


Установка для перегонки спирта приведена на рисунке 1.

В колбу 3 наливаем 6070 мл культуральной жидкости. Перегоняем две трети содержимого колбы в приемник.

Качественное определение спирта основано на окислении этанола до уксусной кислоты и воды смесью бихромата калия с серной кислотой:

3СН3СН2ОН+2К2Сr2О7+8Н2SO4=3СН3СООН+2Сr(SO4)2+Н2SО4+11Н2О.

Отбираем 510 мл перегнанной жидкости, капаем несколько капель концентрированной Н2SО4 и помещаем туда же несколько кристаллов бихромата калия. Смесь ставим на плитку, нагреваем.




1  плитка; 2  водяная баня; 3  круглодонная колба;
4  насадка Вюрца; 5  термометр; 6  холодильник Либиха;
7  алонж; 8  приемник


Рисунок 1  Установка для перегонки спирта


Через некоторое время смесь меняет цвет с желто-коричневого на зеленый и ощущается запах яблочного уксуса. Это указывает на наличие спирта. Весовым или массовым способом определяем количество образовавшегося этанола (Р).


^ 1.5.5 Определение экономического коэффициента

образования этанола


Расчет экономических коэффициентов образования этанола провести по формулам:

YР/S = Р/S, (6)

где Р – прирост этанола после анаэробного культивирования, г;

S – убыль сахаров в культуральной жидкости в результате анаэробного культивирования дрожжей, г;

YР/Х = Р/Х, (7)

где Р – прирост этанола после анаэробного культивирования, г;

Х – прирост биомассы дрожжей в результате анаэробного культивирования, г.

Аналогично рассчитывают экономические коэффициенты по образовавшемуся углекислому газу.


^ 1.6 Получение эргостерина из биомассы дрожжей


1.6.1 Характеристика эргостерина


Эргостерин [ мол. масса 396,66].

Эргостерин является провитамином витамина D.


^ 1.6.2 Лабораторное получение эргостерина


1.6.2.1 Сырье и материалы

Дрожжи  20 г;

Едкий калий  3 г;

Спирт этиловый  33 мл;


1.6.2.2 Ход работы


В колбу, вместимостью 250 мл, загрузить 10 г дрожжей, 1,5 г едкого калия, 15 мл спирта.

Смесь постоянно перемешивать в течение 6 часов при температуре 7884 С на термостатированной качалке с водяной баней. После этого смесь отфильтровать. Далее этот концентрат упарить до содержания сухих веществ 3639 %.

Во время упаривания из-за содержания большого количества белка концентрат вспенивается. Пену убирать путем прекращения на несколько секунд подачи воздуха в аппарат. Эту операцию повторять многократно в течение примерно 78 часов. После того как белок гидролизовался, пена в растворе исчезает. Дальше упаривание продолжать в течение пяти часов до густого, тягучего состояния, содержание сухих веществ в котором примерно 3639 %. Цвет концентрата после упаривания темно-коричневый.

После упаривания практически твердый концентрат растворить в 10 мл этилового спирта и выдержать в термостатированной качалке при 78 С до получения однородного коричневого раствора. Затем колбу охладить и поставить в холодильник при 0 С до выпадения кристаллов эргостерина. Выпавшие кристаллы отфильтровать на фильтре Шота. Провести очистку кристаллов путем перекристаллизации последовательным промыванием 70%-ным этиловым спиртом, смесью спирта с бензолом (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина высушить и измерить температуру плавления.


^ 1.6.3 Качественные реакции на витамины группы D


1.6.3.1 Оборудование и реактивы


Пипетки с одной меткой на 1 мл (4 шт.); штатив лабораторный с пробирками; баня водяная; рыбий жир; анилин; раствор брома в хлороформе (1:60); соляная кислота (конц.).


1.6.3.2 Реакция с анилином


В сухую пробирку наливают 1 мл рыбьего жира и 1 мл смеси анилина с концентрированной соляной кислотой (15:1), перемешивают, осторожно нагревают при постоянном помешивании до кипения и кипятят 0,5 минут. При наличии витамина D желтая окраска эмульсии переходит сначала в зеленую, а затем в красную. Через 12 минуты эмульсия делится на два слоя, из которых нижний окрашен в интенсивный красный цвет.


1.6.3.3 Бромхлороформная проба


В сухую пробирку наливают 1 мл рыбьего жира и 1 мл раствора брома в хлороформе (1:60). В присутствии витамина D возникает зеленовато-голубое окрашивание при нагревании на водяной бане в течение 12 минут.


^ 1.6.4 Количественное определение витамина D


1.6.4.1 Оборудование и реактивы


Фотоэлектроколориметр; баня водяная; воронка делительная на 300 мл (2 шт.); коническая колба с притертой пробкой на 200 мл; набор пипеток градуированных на 1, 5 и 10 мл; молочный жир; этиловый спирт (96%-ный); гидроксид калия (50%-ный); диэтиловый эфир; сульфат натрия свежепрокаленный; хлороформ (промытый водой, высушенный над безводным сульфатом натрия и перегнанный); хлорид сурьмы (III) (2123%-ный) в хлороформе (безводный; рекомендуется хранить в темной склянке в эксикаторе над серной кислотой); ацетилхлорид; основной раствор кальциферола (в 100 мл этилового спирта растворяют 10 мг кальциферола, что соответствует 400 000 ИЕ витамина D2; раствор устойчив в течение года при хранении в холодильнике).


1.6.4.2 Ход анализа


В коническую колбу с воздушным обратным холодильником длиной 80 см вносят 10 г молочного жира, 40 мл 96%-ного этилового спирта и 8 мл 50%-ного раствора гидроксида калия. Колбу помещают в водяную баню, нагретую до температуры 8590 С, на 4050 минут. По окончании омыления содержимое колбы количественно переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют диэтиловым эфиром (порциями 50, 25 и 25 мл). Эфирный слой переносят в другую делительную воронку, где промывают его многократно водой до полного удаления щелочи (проба на фенолфталеин). К полученному эфирному экстракту добавляют 7 г свежепрокаленного сульфата натрия и высушивают его до полной прозрачности (1520 мин), после чего фильтруют через бумажный фильтр. Эфир отгоняют на предварительно нагретой водяной бане до получения сухого остатка, который растворяют в 5 мл хлороформа. Из полученного раствора отбирают 1 мл, добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 мл раствора хлорида сурьмы (III). Через
4 минуты интенсивность окраски измеряют в фотоэлектроколориметре при 500 нм. Фотометрирование ведут против смеси из 1 мл хлороформа, 6 мл раствора хлорида сурьмы (III) и трех капель ацетилхлорида. Содержание витамина D рассчитывают по калибровочному графику. Для получения калибровочного графика готовят серию растворов кальциферола в хлороформе, содержащих в 1 мл от 200 до 1000 ИЕ витамина D, используя для этого основной раствор кальциферола и проводя цветную реакцию, как указано выше. Расчет ведут по формуле:

С = х·V·/a, (8)

где С  содержание витамина D в 1 г жира, ИЕ;

х  найденное по калибровочному графику количество витамина D в 1 мл раствора, ИЕ;

V  масса жира, г;

  плотность жира, г/см3.

^ 2 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ


2.1 Общая характеристика дрожжей


Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы. В группу дрожжей объединяются грибы, которые существуют преимущественно в виде отдельных клеток. Клетки разных видов дрожжей морфологически довольно разнообразны: круглые, яйцевидные, лимоновидные, овальные. Длина их составляет 220 мкм, а ширина 1,510 мкм. Размножаются дрожжи вегетативно и половым путем. Клетки дрожжей грамположительны. На плотных питательных средах дрожжи растут в виде врастающих в субстрат колоний, имеющих мягкую консистенцию и разнообразных по форме: выпуклых, круглых, лопастных. Колонии могут быть бесцветными или окрашенными в желтый, оранжевый, розовый цвета (рисунок 2).




Рисунок 2  Гигантские колонии дрожжей разных видов на сусло-агаре


В зависимости от наличия и типа полового процесса дрожжи относят к трем классам грибов: ^ Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. Термин «дрожжи» в строгом смысле не имеет таксономического значения.

К классу Ascomycetes относят дрожжи, образующие при половом размножении сумки (аски) с эндогенными спорами. К нему принадлежат представители родов дрожжей, используемых в бродильных производствах, Saccharomyces и Shizosaccharomyces.

Класс Basidiomycetes включает дрожжи, формирующие телиоспоры (телейтоспоры) и базидиоподобные спорофоры с экзогенными половыми спорами (споридиями).

К Deuteromycetes, или несовершенным грибам, относят дрожжи, у которых не обнаружен половой цикл. Считают, что организмы, принадлежащие к этой группе, произошли от высших грибов в результате утраты ими половых функций.

В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах, содержащих чаще всего углеводы.

Они растут на поверхности сладких плодов, в нектаре цветков, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Встречаются дрожжи и в водоемах. Содержатся они в пищеварительном тракте человека и животных. Большинство дрожжей сапрофиты, но среди видов, находящихся и во внутренних органах и на кожных покровах человека, имеются патогенные, или условно патогенные, формы, например, возбудитель кандидомикозов  Candida albicans. Некоторые дрожжи вызывают болезни растений.

Многие дрожжи осуществляют спиртовое брожение и используются для производства пива, вина, хлеба, спирта. Биомасса кормовых дрожжей рода Саndida используется в качестве питательных добавок к рационам сельскохозяйственных животных.


^ 2.2 Систематика дрожжей


Одноклеточная организация дрожжей накладывает столь существенный отпечаток на их внешний облик и на методы работы с ними, что систематика дрожжей долгое время развивалась вполне независимо от систематики мицелиальных грибов. Одно из важных отличий  широкое использование для классификации и идентификации дрожжей физиологических и биохимических признаков. До середины XX века все одноклеточные грибы рассматривались в качестве достаточно обособленной таксономической группы аскомицетов. Последней точки зрения придерживался, например, В.И. Кудрявцев, автор отечественного определителя дрожжей, который предлагал объединять все дрожжи в самостоятельный порядок Unicellomycetales. В середине XX века произошло принципиальное событие в систематике дрожжей, когда японскому микологу Исао Банно удалось индуцировать половой цикл размножения у гетероталличных красных дрожжей Rhodotorula glutinis. Полученные им характеристики жизненного цикла однозначно свидетельствовали о принадлежности этих дрожжей к гетеробазидиомицетам. Стало очевидным, что среди дрожжей имеются представители совершенно различных таксономических групп грибов  как аскомицетовых, так и базидиомицетовых. После этого большое внимание в систематике дрожжей стало уделяться поиску признаков, позволяющих разделить аскомицетовые и базидиомицетовые виды, даже без наблюдения полного жизненного цикла (так называемых признаков аффинитета). В систематике дрожжей стали активно использоваться биохимические и цитологические признаки.

Современный период изучения биологического разнообразия характеризуется интенсивным развитием филогенетической систематики, которая направлена на реконструкцию конкретных путей исторического развития организмов. В микробиологии филогенетическая систематика получила мощный импульс развития лишь в самом конце XX века в связи со сравнительным изучением консервативных нуклеотидных последовательностей в рРНК. У дрожжей такая систематика строится главным образом на изучении двух участков рДНК длиной около 600 нуклеотидных пар: D1/D2 домена на 5'-конце гена, кодирующего 26S рРНК и внутреннего транскрибируемого спейсерного региона (ITS), включающего ген 5.8S рРНК. Считается, что вследствие консерватив­ности этих участков различия между ними прямо пропорциональны филогенетическому расстоянию, степени эволюционного родства. Сек-венирование неклеотидных последовательностей рДНК оказалось мощным инструментом для построения филогенетической классификации дрожжей, определения их места в общей системе грибов. К настоящему времени расшифрованы и помещены в компьютерные банки данных, доступные по сети Интернет, нуклеотидные последовательности рРНК у представителей всех известных видов дрожжей. Это позволило построить филогенетические деревья, отражающие эволюцию их рибосомальных генов. Оказалось, что группирование дрожжей на основе сходства нуклеотидных последовательностей рРНК во многих случаях не совпадает с группированием по фенотипическим признакам. Многие традиционные признаки, используемые в классификации дрожжей, такие как характеристики вегетативного размножения, форма аскоспор, способность к сбраживанию и ассимиляции сахаров, стали считаться ненадежными, не пригодными для определения филогенетического родства. Секвенирование рРНК (рДНК) сейчас считается необходимым при описании новых видов дрожжей.

Один из главных вопросов, который активно дискутировался до последнего времени,  положение дрожжей в общей системе грибов. Являются ли они предковыми примитивными формами аско- и базидиомицетов, давшими начало более продвинутым и сложно организованным мицелиальным грибам, или вторично упростившимися, возникшими независимо в разных филогенетических линиях грибов в результате конвергенции? Окончательный ответ на этот вопрос был получен лишь недавно в результате развития молекулярно-филогене-тической систематики. Сейчас считается окончательно доказанным полифилетическое происхождение дрожжей, их независимое возникновение среди аскомицетовых и базидиомицетовых грибов. После обнаружения базидиомицетовых дрожжей в зимологии возникло представление о дрожжах, как о чисто морфологической, или экоморфологической группе грибов (жизненной форме), лишенной таксономического содержания. В то же время дрожжи встречаются лишь в некоторых филогенетических линиях грибов, в которых имеются также близкородственные виды, существующие в основном в мицелиальной форме. Примерами могут служить аскомицеты Endomyces, Blastobotrys, базидиомицеты Tilletiopsis, Trichosporonoides, не образующие почкующиеся одиночные клетки. Несмотря на отсутствие одноклеточных ассимилятивных стадий, такие виды также включают в определители дрожжей, так как филогенетически они очень близки к «настоящим» одноклеточным дрожжам. Поэтому, с точки зрения филогенетической систематики, целиком сводить понятие «дрожжи» только к одноклеточной жизненной форме грибов не представляется целесообразным.

Систематика дрожжей, поиск их места в общей системе грибов продолжают активно развиваться, и в этой области еще не выработано устоявшихся, стабильных представлений. Тем не менее со времени первых описаний сахаромицетов зимологами пройден очень большой путь в исследовании разнообразия дрожжевых грибов. Основные этапы этого пути отражены в серии определителей голландской зимологической школы, которые выходили с интервалом в 1020 лет.


^ 2.3 Классификация дрожжей


Классификация дрожжей на уровне семейств и порядков разработана очень слабо. За основу приводимой ниже классификации взято последнее издание определителя дрожжей (Kurtzman C.P., Fell J.W. (eds.) The Yeasts, a taxonomic study. Fourth revised and enlarged edition. Amsterdam: Elsevier Science B.V., 1998).


^ 2.3.1 Аскомицетовые дрожжи


Традиционно все аскомицетовые грибы разделяли на два таксономических класса: Hemiascomycetes, или голосумчатые грибы, и Euascomycetes (настоящие аскомицеты). Первые не образуют плодовых тел, и аски у них располагаются непосредственно на мицелии или в виде одиночных клеток, тогда как эуаскомицеты, за немногими исключениями (например, род Eremascus), обычно формируют аски внутри или на поверхности специальных плодовых тел (аскокарпов), образованных грибной тканью  густым скоплением мицелия. Ранее все аскомицетовые дрожжи помещали в группу гемиаскомицетовых в качестве самостоятельного порядка Endomycetales. Кроме настоящих дрожжей к эндомицетовым относили и некоторые голосумчатые грибы, не образующие одноклеточных вегетативных форм, а также диморфные дрожжеподобные грибы, иногда с очень слабо выраженной дрожжевой фазой, например, Ascoidea, Cephaloascus, Dipodascus. Дальнейшее разделение эндомицетовых дрожжей на семейства и роды проводилось прежде всего на основании таких признаков, как способ вегетативного размножения, тип полового процесса и форма аскоспор. Например, дрожжи рода Schizosaccharomyces выделяются на основании вегетативного размножения делением, а не почкованием, роды Hanseniaspora, Nadsonia, Saccharomycodes  на основании размножения биполярным почкованием на широком основании, роды Saccharomyces, Pichia, Metschnikowia, Williopsis характеризуются шаровидной, шляповидной, игловидной и сатурновидной формой аскоспор соответственно.

Кроме эндомицетовых к гемиаскомицетам формально относили еще одну группу грибов, составляющую отдельный порядок Taphrinales. Все представители этого порядка  облигатные паразиты растений, образующие аски не в плодовых телах, а плотным слоем под кутикулой растения-хозяина. Аскоспоры некоторых видов тафриновых способны почковаться, формируя сапротрофную дрожжевую фазу. Однако тафриновые существенно отличаются от остальных гемиаскомицетов тем, что в цикле их развития преобладает дикариотическая фаза так же, как у базидиомицетовых грибов. К тафриновым очень близки представители рода Protomyces, все члены которого тоже являются фитопатогенными грибами, но способны образовывать сапротрофные дрожжевые стадии.

Среди эуаскомицетов способность к вегетативному размножению в одноклеточной форме встречается очень редко. Наиболее известны так называемые «черные дрожжи», характеризующиеся накоплением меланоидных пигментов, которые придают их колониям черный цвет.

Внедрение в таксономическую практику биохимических и молекулярно-биологических методов (особенно проведенный в последнее время анализ нуклеотидных последовательностей рРНК) существенно изменило представления о филогенетической классификации аскомицетовых дрожжей. Эти исследования подтвердили разделение аскомицетов на две главные филетические линии: гемиаскомицетовые и эуаскомицетовые.

Наряду с этим обнаружилось, что дрожжи рода Schizosac-charomyces по нуклеотидным последовательностям рРНК наиболее близки к тафриновым и вместе с ними образуют группу дрожжевых грибов, предковую по отношению к остальным аскомицетам. Эта группа грибов была названа архиаскомицетами (древними аскомицетами). Таким образом, все аскомицетовые дрожжи в настоящее время распределяются по трем классам Archiascomycetes, Hemiascomycetes, Euascomycetes (рисунок 3).


2.3.1.1 Saccharomyces


Клетки овальные или круглые, иногда удлиненные, размером (5…7)(8…11) мкм. Размножаются многосторонним почкованием. Почкование истинное (рисунок 4). Может формироваться примитивный псевдомицелий, но истинного мицелия не образуют.

Диплоидизация происходит в результате слияния двух гаплоидных клеток (хологамия). Вегетативно размножаются в основном диплоидные клетки. В неблагоприятных условиях образуются аски с одной или четырьмя спорами. При созр