Реферат: Симпозиума: "Онкогены: 20 лет спустя". Во введении к обзору лекций, представленных там, говорится: Почти 20 лет прошло с тех пор, как было получено доказательство того, что нормальные клетки несут раковые гены. В течении почти двух столетий исследова

http://humbio.ru/humbio/default.htm Канцерогенез и современная молекулярная генетика
Я очень рекомендую для предварительного ознакомления с проблемой рака посмотреть замечательную книгу "Молекулярная биология гена". Там вы найдете очень простое и систематическое изложение проблемы генетики и генов рака, как она выглядела к моменту выхода этой книги в свет - к 1987 году. С тех пор прошло 10 лет - эпоха с точки зрения темпов развития молекулярной генетики вообще, и молекулярной генетики рака в особенности. Но основные концепции, которые являются движущей силой развития исследований в этой области, были заложены уже тогда. После прочтения раздела книги о генетических основах рака то, что я попытаюсь вам здесь рассказать будет восприниматься легче.

В январе 1995 г, в Колорадо состоялся Кейстоунский симпозиум [ Oncogenes: ea 1995 , Bishop J.M., 1995 ], посвященный памяти Нобелевского лауреата Говарда Темина, одного из главных открывателей обратной транскрипции. Тема симпозиума: "Онкогены: 20 лет спустя". Во введении к обзору лекций, представленных там, говорится: Почти 20 лет прошло с тех пор, как было получено доказательство того, что нормальные клетки несут раковые гены. В течении почти двух столетий исследователди искали причину рака во внешних неблагоприятных воздействиях. То обстоятельство, что нормальные клетки несут в себе потенциал для того, чтобы стать раковыми, привело к концепции протоонкогена, "внутреннего врага". Защита против раковых клеток требует понимания функционирования нормальных клеток.

В последнюю декаду имел место взрыв информации о механизмах, с помощью которых клетки получают сигналы, и о системах, с помощью которых информация переносится в ядро, чтобы активировать гены, вовлеченные в клеточный рост, дифференцировку и развитие. Сейчас совершенно не удивительно и нормально, когда такие разные области науки, как генетика дрожжей, дрозофилы, эмбриогенетика животных, а также клеточная эволюция в процессе развития нематоды объединяются в исследовании механизмов канцерогенеза. Эта интеграция разных областей знания в исследовании процессов, важных для жизнедеятельности, характерно для современной генетики. Исследования рака превратились в генетическую науку.
^ Этапы понимания молекулярных механизмов канцерогенеза (Табл 1 cs)
СОБЫТИЕ

ГОД

Открытие вируса саркомы Рауса (RSV)

1911

RSV содержит трансформирующий ген, src

1970

Гомолог src содержится в геноме клетки

1976

src кодирует протеинкиназу

1978

Химически трансформированные клетки содержат активированный онкоген ras

1979

RAS белок связывает гуаниновые нуклеотиды

1979

src -киназа фосфорилирует тирозин

1980

Внедрение вируса активирует myc онкоген

1981

Точечная мутация активирует ras в человеческих опухолях мочевого пузыря

1982

Хромосомная транслокация активирует myc

1982

sis Онкоген кодирует фактор роста

1983

Онкогены коопереруют при опухолевой трансформации клеток

1983

Онкоген erbB кодирует укороченный рецептор фактора роста

1984

Клонирование RB, первого супрессора опухолей

1986

Онкогены связаны с контролем развития

1987

ДНК опухолеродные вирусы функционируют, действуя на RB белок

1988

Онкоген bcl-2 кодирует ингибир апоптоза

1988

р53 является супрессором опухолей

1989

RB является участником контроля клеточного цикла

1991

Наследственный рак толстой кишки вызывается мутацией в гене репарации ДНК

1993

Клонирован ген предрасположенности к раку молочной железы

1994

Клонирование множества других "раковых" генов продолжается




По [ Marx ea 1994]





Когда мы говорим рак, то имеем ввиду более чем 100 различных разновидностей этой болезни. Она поражает почти все ткани организма, но при этом у всех видов рака есть общие черты. Наиболее частыми формами злокачественных опухолей были рак легкого (1,3 млн.), желудка (1,0 млн.), верхнего пищеварительного тракта (0,9 млн., в основном за счет рака пищевода), рак печени (0,7 млн.).
Основными причинами возникновения рака легкого, полости рта, гортани и в отдельных случаях пищевода и желудка является курение, в то время как гепатит B является основной причиной рака печени. Методы ранней диагностики и лечения этих заболеваний крайне неудовлетворительны. Поэтому необходимо сосредоточить усилия на их профилактике.

Отказ от курения и вакцинация от гепатита В способны значительно снизить заболеваемость и, следовательно, смертность рака легкого, верхних дыхательных путей и печени. Еще 4 млн. смертей обусловлены раком кишечника (0,6 млн.), молочной железы (0,4 млн.), простаты (0,3 млн.), шейки матки (0,3 млн.), поджелудочной железы (0,2 млн.) и мочевого пузыря (0,2 млн.). Основными причинами этих заболевания являются гормональные нарушения (рак молочной железы и простаты), вирусы папилломы (рак шейки матки), курение (рак поджелудочной железы и мочевого пузыря). Таким образом курение ответственно за 20% всех смертей от злокачественных опухолей. Другими причинами являются вирусная инфекция (вирус гепатита В, вирус папилломы, вирус Эпштейн-Барра и т.д.), диетические факторы, загрязнение окружающей среды, пребывание на солнце. 

Главный фактор риска злокачественных новообразований - возраст; две трети больных старше 65 лет. Вероятность онкологических заболеваний резко увеличивается с возрастом: до достижения 39 лет заболевает 1 из 58 мужчин и 1 из 52 женщин; в возрасте 40-59 лет - 1 из 13 мужчин и 1 из 11 женщин, в возрасте 60-79 лет - 1 из 3 мужчин и 1 из 4 женщин.

Среди причин смерти злокачественные новообразования занимают второе место после сердечно-сосудистых заболеваний . Однако в США с 1950 г. смертность от сердечно-сосудистых заболеваний снизилась на 45% и продолжает снижаться, в то время как смертность от онкологических заболеваний растет ( рис. 81.2 ). Уже в начале XXI века злокачественные новообразования должны занять первое место в этом списке.

^ ПРИРОДА РАКА.

Когда мы говорим рак, то имеем ввиду более чем 100 различных разновидностей этой болезни. Она поражает почти все ткани организма, но при этом у всех видов рака есть общие черты. Сейчас мы постараемся представить себе именно эти общие черты.

Во- первых отметим два принципиальных различия между раком и другими генетическими болезнями:

Рак вызывается по большей части соматическими мутациями . Каждый индивидуальный случай рака происходит в результате накопления нескольких мутаций. Клетки нашего организма распределены по категориям, типам, которые определенно отличаются друг от друга. Таких категорий около 200. Это дифференцированные клетки .

Рак представляет собой болезнь делящихся клеток. Считается, что большинство видов рака происходит из трансформированных стволовых недодифференцированных клеток, обладающих способностью к пролиферации.

Все наши 1013 - 1014 клеток находятся под строгим контролем и зависят друг от друга. Это хорошо организованное сообщество, где каждая клетка знает, что ей позволено, а что - нет. Каждый вид клеток образует популяцию, состоящую из вполне определенного количества клеток. Клетки обмениваются информацией, регулируя скорость деления соседних клеток.

Раковая клетка выходит из под этого контроля ( трансформация опухлевая ) и начинает жить по своей собственной программе, безудержно размножаясь и игнорируя сигналы из окружения. Она образует множество себе подобных клеток, которые приобретают способность отрываться от своего первоначального места, мигрировать в другие части тела и размножаться там, образуя метастазы . Чем дальше, тем агрессивнее становятся эти клетки, и в конце концов, когда они поражают жизненно важные системы организма, организм погибает.

Канцерогенез - многоступенчатый процесс накопления мутаций и других генетических изменений, приводящих к нарушениям регуляции клеточного цикла , апоптоза , дифференцировки ,морфогенетических реакций клетки , противоопухолевого иммунитета .

Ключевую роль в возникновении указанных свойств неопластической клетки играют нарушения функции опухолевых супрессоров и протоонкогенов . Исследования последних лет позволили идентифицировать сигнальные пути, контролируемые большинством этих генов. Выяснилось, что многие из них регулируют активность одних и тех же путей на разных этажах передачи сигналов. Оказалось, что некоторые из таких сигнальных путей одновременно вовлечены в регуляцию нескольких важнейших физиологических процессов. Продукты некоторых из опухолевых супрессоров и протоонкогенов являются местами пересечения различных сигнальных путей. Отсюда становится понятной частая встречаемость изменений генов р53 и RAS в самых разных новообразованиях - их мутации позволяют за один шаг преодолеть несколько важных этапов опухолевой прогрессии и придать неопластической клетке сразу несколько необходимых свойств.

В то же время для ряда новообразований, и в первую очередь для лейкозов, характерны генетические изменения, встречающиеся только при данном заболевании. К ним относятся прежде всего хромосомные транслокации, перемещающие протоонкогены и/или опухолевые супрессоры в другое место генома. Специфичность таких изменений объясняется, по-видимому, тремя основными причинами.

Во-первых, в определенных типах клеток может быть значительно повышена вероятность некоторых генетических перестроек. Так, в ходе дифференцировки В-лимфоцитов происходит запрограммированная перестройка генов иммуноглобулинов. Закономерной ошибкой таких перестроек являются хромосомные транслокации, соединяющие гены иммуноглобулинов с протоонкогеном MYC, содержащим в своем составе специфические сигнальные последовательности, которые распознаются рекомбиназами, осуществляющими перестройку генов иммуноглобулинов. Естественно предположить, что в предшественниках В-лимфоцитов такие транслокации, нарушающие нормальную регуляцию белка Myc, происходят чаще, чем другие мутации, приводящие к сходным биологическим последствиям.

Во-вторых, тканеспецифичными могут быть экспрессия или действие определенных онкогенов/опухолевых супрессоров.

В-третьих, для приобретения злокачественного фенотипа разные типы клеток могут нуждаться в неодинаковых наборах биологических свойств. Так, для гемопоэтических клеток по сравнению с клетками других тканей менее существенным представляется приобретение таких признаков, как потеря контактного торможения размножения и локомоторный фенотип. Определяющими для их злокачественной трансформации являются, по- видимому, стимуляция пролиферации, подавление апоптоза и блокирование специфической дифференцировки. Поэтому при развитии гемобластозов особой селективной ценностью обладают, очевидно, перестройки типа PML/RARa, способные сразу придавать клеткам некоторых типов эти три важнейших свойства. Несмотря на достигнутый в последние годы значительный прогресс в понимании базовых механизмов канцерогенеза, много вопросов остаются неясными. Среди них важное место занимают механизмы тканеспецифического действия онкогенов и опухолевых супрессоров. Можно думать, что исследование этой проблемы станет в ближайшее время одной из наиболее бурно развивающихся областей онкологии.
^ Злокачественные опухоли: краткие сведения
Для злокачественных новообразований, в частности опухолей, характерны два основных признака:

- бесконтрольная (то есть не регулируемая внешними сигналами) пролиферация клеток и

- их способность проникать в окружающие ткани и отдаленные органы (то есть инвазивный рост и метастазирование).

Если первый признак свойственен не только злокачественным, но и доброкачественным опухолям , то второй - отличает злокачественные опухоли.

Злокачественные опухоли эпителиальных тканей носят название рак, или карцинома , а неэпителиальных (мезенхимных) тканей - саркома .

Злокачественное новообразование развивается в результате генетических нарушений в единственной клетке. Хотя некоторые злокачественные новообразования наследуются, в основном вызывающие их мутации возникают в соматических клетках либо из-за ошибок при репликации ДНК, либо под действием канцерогенов .

Единичного генетического повреждения, как правило, недостаточно для превращения клетки в опухолевую (опухолевой трансформации). Лишь накопление 5-10 мутаций в течение продолжительного времени (часто многих лет), изменяющее несколько генных продуктов, приводит к появлению злокачественного новообразования.

По мере накопления генетических нарушений в эпителиальных тканях наблюдаются следующие процессы:

- гиперплазия

- аденома

- дисплазия

- рак in situ

- инвазивный рак.

Устойчивость клетки к опухолевой трансформации обеспечивают защитные механизмы, действующие во всех периодах клеточного цикла. Если нарушена функция одного белка, то его могут заменить другие белки или метаболические пути.

В организме человека имеется более двухсот различных типов клеток.

Не все они одинаково подвержены опухолевой трансформации. Некоторые клетки (в частности, кардиомиоциты , клетки волокон хрусталика , рецепторные клетки сетчатки и рецепторные клетки спирального органа ) не пролиферируют и не замещаются на протяжении всей жизни. Такие клетки исключительно редко подвергаются опухолевой трансформации.

В большинстве дифференцированных тканей клетки постоянно обновляются и погибшие клетки замещаются новыми. В норме этот процесс может протекать медленно, но некоторые сигналы способствуют пролиферации полностью дифференцированных клеток с образованием таких же дочерних клеток. Например, делящиеся гепатоциты замещают стареющие, поврежденные или хирургически удаленные клетки.

В тканях с быстрым обновлением клеток (например, в эпидермисе , костном мозге , слизистой кишечника ) имеется два типа клеток:

- Способные к делению ( стволовые ) клетки не дифференцированы.

- Наоборот, полностью дифференцированные клетки не способны к делению.

В результате деления стволовых клеток образуются дочерние клетки, которые либо остаются стволовыми (возмещая фракцию стволовых клеток), либо дифференцируются, в зависимости от условий и внешних сигналов. В стволовых и дифференцированных клетках экспрессируются разные гены.

Экспрессия гена в данной ткани зависит не только от типа клетки, но и от внешних факторов: межклеточных контактов, взаимодействий с внеклеточным матриксом, действия гормонов, факторов роста и дифференцировки, а также от ряда других воздействий (повышения температуры, действия окислителей и облучения, сдавления или растяжения ткани).

Опухолевую трансформацию претерпевают, как правило, клетки из быстро обновляющихся тканей, в особенности если они подвергаются действию канцерогенов или пролиферируют под действием гормонов.

Генетические нарушения обычно приводят к активации протоонкогенов (их превращению в онкогены ) или инактивации генов-супрессоров опухолевого роста .

Опухолевая трансформация практически всегда вызвана генетическими нарушениями, однако в эксперименте опухолевые клетки можно получить и без повреждения генов. Так, клетки первичной эктодермы мышиного эмбриона бесконтрольно пролиферируют в культуре. После введения таких клеток животным у них развивается опухоль - тератокарцинома . В данном случае бесконтрольная пролиферация нормальных эмбриональных клеток вызвана их удалением из привычного окружения. Однако если клетки тератокарциномы вновь ввести в ранний эмбрион, то под влиянием соседних клеток они дифференцируются в клетки нормальных органов и тканей, в соответствии с местом введения.

Таким образом, внешние факторы оказывают влияние на экспрессию генов в клетках-мишенях.

Получая множество разных сигналов, клетка отвечает на них активацией определенного набора факторов транскрипции. От того, каков этот набор, и зависит, будет ли клетка пролиферировать, дифференцироваться или погибнет.
^ Рак: наследственная предрасположенность
Известно примерно 50 наследственных форм рака ( Knudson A.G., 1993 ). Эти же формы могут быть и ненаследственными, а спорадическими. Предрасположенность к раку наследуется как обычный Менделевский доминантный признак с той или иной степенью пенетрантности и возникновеннием в более раннем возрасте, чем спорадические формы.

Среди наследственных раков известны самые разные формы - карциномы различной локализации, нейробластомы , нейрофиброматоз , множественные эндокринные неоплазии , детские раки ( ретинобластома , опухоль Вилмса ). В Табл.1 приведены данные о картировании и клонировании некоторых генов супрессоров (по Knudson A.G., 1993 ). В поисках генов супрессирующих злокачественное перерождение клеток изучаются генетические механизмы, определяющие различные формы наследственных и спорадических форм злокачественных опухолей. Однако наибольшее число исследований посвящено гену rb , контролирующему развитие ретинобластомы и гену, кодирующему белок р53 .
^ Опухолевая трансформация клетки: краткие сведения
Беглый обзор событий, приводящих к раковому превращению клетки см. [ Weinberg ea 1997 ]. Множество мутаций должно произойти для превращения клетки в раковую ( Рис. 1 ). Опухолевая трансформация приводит к блокированию способности клеток к дифференцировке [ Greaves M. 1997 , Shay ea 1997 ]. Поэтому у взрослых людей рак чаще всего поражает клетки, способные к активному делению. Например, нервные клетки не трансформируются у взрослых, но могут превращаться в опухолевые в раннем возрасте, когда они еще продолжают делиться.

Переход нормальной клетки в раковую сопровождается глубокими изменениями. Меняется спектр продуктов, синтезируемых раковой клеткой, происходят изменения в свойствах плазматических мембран, в результате чего клетка перестает реагировать на контакты с соседними клетками. Теряется избирательность клеток при адгезии, которая у нормальных клеток заключается в том, что подобные клетки стремятся слипнуться с подобными. Клетки печени стараются собраться вместе с клетками печени, почечные - с почечными. Происходят глубокие преобразования цитоскелета. Уменьшается потребность в факторах роста, получаемых нормальной клеткой из среды, в которой она растет. Наконец, сильно меняется спектр генов, которые работают в раковой клетке, по сравнению с нормальной.

Для опухолевой трансформации клетки в ней должны накопиться мутации, затрагивающие разные регуляторные механизмы. Часто нарушается прохождение клеткой точек рестрикции клеточного цикла. Обычное явление в опухолевых клетках - экспрессия теломеразы .Часто наблюдается также избыточная экспрессия факторов роста и их рецепторов.

Нередко активируются протоонкогены RAS или происходят другие изменения, ведущие к постоянной активации каскада митоген-активируемых протеинкиназ.

В опухолевых клетках часто наблюдаются изменения в цитоскелете и потеря чувствительности к контактному торможению пролиферации.

Белки, участвующие в апоптозе , в них часто не экспрессируются. Как правило, мутации нарушают разные пути передачи сигнала, а не один путь в разных местах.

Высокая частота мутаций в опухолевых клетках облегчает их адаптацию к среде, и одно из проявлений такой адаптации - развитие устойчивости к лекарственным средствам.

По мере роста опухоли клетки начинают секретировать протеазы, способствующие инвазивному росту и метастазированию.

На определенном этапе клетки начинают секретировать факторы, способствующие разрастанию сосудов и улучшению кровоснабжения опухоли.

Некоторые мутации дают опухолевым клеткам возможность оставаться неуязвимыми для иммунной системы; например, в некоторых опухолях снижается экспрессия антигенов HLA класса I , и клетки не распознаются Т-лимфоцитами.

Итак, чтобы клетка стала опухолевой, в ней должно произойти очень много изменений, это многостадийный процесс, поэтому в опухолях человека подчас находят более 10 мутаций. Однако, известен и одностадийный механизм опухлевой трансформации.

Врачи часто полагают, что основной признак опухолевых клеток - это их бесконтрольная пролиферация. Вместе с тем в большинстве злокачественных опухолей человека ростовая фракция не выше, чем в эпителии слизистой кишечника или костном мозге. Кусочки ткани большинства опухолей не способны в течение длительного времени расти в культуре. Клетки, способные к неограниченной пролиферации в культуре, как правило, несут дополнительные мутации. В большинстве опухолей ростовая фракция уменьшается по мере увеличения массы опухоли, и ее рост постепенно замедляется.

Не все клетки опухоли одинаково способны к пролиферации. Накопление генетических повреждений, недостаточное поступление кислорода и питательных веществ и другие факторы (часто неизвестные) вызывают старение некоторых опухолевых клеток, так что к моменту клинического выявления опухоли (количество опухолевых клеток 100 миллионов до 1000 миллионов) большинство из них уже не пролиферируют.

Часто к этому моменту наиболее злокачественные и прошедшие отбор клоны метастазируют в другие участки, где образуют новые и более агрессивные опухоли.

Можно сказать, что опухолевые клетки теряют альтруизм, столь свойственный поведению клеток в многоклеточном организме.

Опухолевые клетки функционируют в условиях естественного отбора со стороны враждебного им окружения. Но чем большей независимости от внешних условий они добиваются, тем увереннее они готовят гибель всему организму и себе в том числе.
^ Гены, участвующие в трансформации клеток: введение
[ Weinberg ea 1997 , Kinzler ea 1996 , Hunter ea 1997 ] Генетика рака заставляет пересматривать простые догмы о причинно- следственной связи в заболеваниях. Рак это пример сложной мультифакторной генетической болезни .

В развитие опухолей вовлекается громадное разнообразие генов. Происходит разрегулирование множества клеточных функций, включая механизмы контроля клеточной пролиферации , репарации ДНК , стабильности хромосом , межклеточных взаимодействий , взаимодействий клеток с матриксом , ангиогенеза , клеточного старения , апоптоза и т.д.

Гены, вовлеченые в опухолеобразование могут действовать на опухолевую прогрессию , либо меняя структуру кодируемого продукта вследствие мутациий, либо вследствие изменений в их экспрессии в ответ на какие-либо события в клетке. В результате может облегчаться инициация прогрессии опухоли, как происходит при активации протоонкогенов, или может сниматься ингибирование этой прогрессии, как происходит при инактивации супрессоров опухолей. То, что не только мутации, меняющие структуру продуктов протоонкогенов, но и изменение уровня их экспрессии может приводить к стимуляции опухоли, легко видеть на примере стимуляции опухолевой трансформации при внедрении рядом с протоонкогенами ретровирусов, не содержащих онкогенов. При этом ретровирус меняет экспрессию протоонкогенов, но не их структуру. При опухолеобразовании часто наблюдается амплификация области хромосом, содержащих протоонкогены. Это также приводит к увеличению количества синтезированных продуктов, а не к изменению их струтур.

В развитие раковой опухоли вовлекается значительно большее число генов, чем количество генов, реально получивших мутации. Сегодня часто высказывается мнение, что на самом деле "раковым" геном следует считать любой ген, изменение структуры или экспрессии которого вовлекается в качестве необходимого элемента опухолеобразования. Например, повышенная экспрессия немутантного рецептора эпидермального ростового фактора или эстрогенового рецептора может оказаться онкогенным. Другой пример: раковые гены, такие как myc, p53, WT1 кодируют транскрипционные факторы, которые в свою очередь регулируют экспрессию множества других генов. Ясно, что изменение в уровне их экспрессии может вызывать целый каскад событий, среди которых могут оказываться и такие, которые приведут к опухолевому изменению фенотипа клетки. Среди таких событий могут оказаться и изменения, которые вызывают дестабилизацию генома клетки. Мы увидим позже, что возможно это необходимый пререквизит опухолевой трансформации. Ведь для быстрого прогресса опухоли нужно несколько мутационных событий. В нормальной клетке мутации возникают с незначительной скоростью. Чтобы эту скорость повысить и нужны изменения, которые приводят к дестабилизации генома . Пути для этого могут быть разными, но стадия дестабилизации генома является, возможно, универсальным событием на пути к опухоли. См: проект: база данных по экспрессии генов в опухолях
^ Протоонкогены: механизмы активации, точечные мутации
В клетках солидных опухолей точечные мутации чаще всего активируют гены (протоонкогены) семейства RAS . Эти гены, впервые клонированные из опухолевых клеток человека при раке мочевого пузыря , играют важную роль в регуляции пролиферации клеток как в норме, так и при патологии ( рис. 84.3 ).

Мутации одного из генов RAS ( HRAS , KRAS2 или NRAS ) обнаруживают примерно в 15% случаев злокачественных новообразований у человека.

Исследование гена KRAS2 (главным образом при раке легкого и раке толстой кишки ) позволило выявить характерные мутации. В отличие от гена BRCA1 , который имеет множество мутантных аллелей ( рис. 84.5 ), большинство избыточно активных генов RAS содержат точечные мутации в 12-м или 61-м кодоне, обусловливающие резистентность к инактивирующему влиянию нейрофибромина .

Специфичность мутаций, возможно, позволит использовать их для диагностики и определения прогноза некоторых злокачественных новообразований . так, выявление мутаций гена KRAS2 помогает уточнить прогноз при раке легкого .

Однако для большинства других типов злокачественных новообразований (включая рак поджелудочной железы и рак толстой кишки ) мутации этого гена не имеют прогностического значения. Отчасти это объясняется тем, что мутации генов RAS, возникающие на ранних стадиях рака толстой кишки ( рис. 84.8 ), нередко находят и при предраковых изменениях кишечного эпителия.
^ Протоонкогены: механизмы активации, амплификация участков ДНК
Амплификация участков ДНК приводит к активации онкогенов за счет усиления их экспрессии. Увеличение числа копий фрагмента ДНК может сопровождаться появлением специфических хромосомных аберраций, которые выявляются цитогенетически как равномерно окрашиваемые участки обычных хромосом или как дополнительные пары маленьких хромосом, так называемые двойные микрохромосомы ( рис. 84.9 ). Предполагают, что амплификация ДНК определенного локуса в опухолевой клетке дает ей преимущество перед нормальными клетками, что проявляется в ускорении роста или повышении устойчивости к противоопухолевым средствам. 

Выявление амплифицированных участков ДНК значительно облегчается благодаря методу двухцветной флюоресцентной гибридизации in situ, названному сравнительной геномной гибридизацией. Из опухолевой и нормальной тканей выделяют ДНК, метят разными флюоресцентными красителями и гибридизуют с нормальными метафазными хромосомами. Участки ДНК опухолевых клеток, содержащие дупликации и делеции, распознают по изменению интенсивности флюоресценции. Этот метод позволяет исследовать весь геном и выявить те хромосомные фрагменты, которые предположительно содержат гены, участвующие в развитии злокачественных новообразований.

Установлено, что в опухолевых клетках человека многие гены подвергаются амплификации. Некоторые протоонкогены (включая MYCN ) были идентифицированы благодаря их присутствию в амплифицированных участках ДНК опухолевых клеток, а также их гомологии с известными онкогенами. При некоторых типах злокачественных новообразований (особенно при саркомах ) амплифицированный участок длиной в сотни тысяч нуклеотидов может содержать более одного онкогена.

Амплификация участка ДНК на 12-й хромосоме выявлена при различных саркомах и нейробластоме у человека ( рис. 84.10 ).

Гены MDM2 , GLI , CDK4 , SAS , а также другие гены, контролирующие клеточную пролиферацию , нередко амплифицируются одновременно.

Для некоторых злокачественных новообразований прослежена связь клинических проявлений с амплификацией генов (особенно гена ERBB2 при раке молочной железы и MYCN npи нейробластоме ); амплификация клеточного протоонкогена, как правило, свидетельствует о неблагоприятном прогнозе. Амплификация гена может придавать опухолевым клеткам устойчивость к химиотерапии. Так, на фоне лечения метотрексатом , который угнетает активность дигидрофолатредуктазы , нередко появляются клетки с амплификацией гена, кодирующего этот фермент.

Существует много примеров амплификации различных протоонкогенов в клеточных линиях, выделенных из разнообразных типов опухолей: ген c-myc амплифицирован 20-30-кратно в линии лейкозных клеток ( Collins S., Groudine M., 1982 ) и в нейробластомах ( van Devanter D.R. et al., 1990 ); ген c-abl амплифицирован 10-кратно в клетках миелоидного лейкоза ( Collins S.J., Groudine M.T., 1983 ).

Солидные опухоли также имеют амплифицированные протоонгогены: c-erbB амплифицирован в 15-20 раз в клетках эпидермальной карциномы и c-myc амплифицирован в 30 раз в клетках карциномы прямой кишки ( Alitalo K. et al., 1983 ). Во многих из перечисленных выше случаев было показано, что амплифицированные гены кодируют вполне нормальный продукт.

Таким образом, онкогенная активация происходит в основном в результате гиперэкспрессии амплификацированного протоонкогена.

Изучение последовательностей в ДМХ и ГОО , часто встречающихся в опухолевых клеточных линиях, привело к обнаружению новых генов, контролирующих злокачественную трансформацию.

Так, открытый данным методом проонкоген HER-2/neu , или c-erbB-2 , амплифицирован в 58 случаях из 257 изученных аденокарцином ( Rabbitts T.H., Rabbitts P.H., 1989 , Boerresen A.-L. et al., 1990 ).

Другим важным открытием, сделанным при изучении амплифицированных областей генома клеток нейробластомы , было обнаружение нового гена myc-семейства - N-myc ( Schwab M. et al., 1983 ). Его амплификация была обнаружена в клетках 22 из 63 исследованных пациентов с нейробластомой: 100-300-кратная - у 12 больных и 3-10-кратная - у 10, при этом большая степень амплификации соответствовала более продвинутой стадии заболевания ( Brodeur G. M. et al., 1984 ).

В клетках мелкоклеточного рака легкого в амплифицированных районах был найден еще один ген из этого семейства - L-myc ( Jonhson B.E. et al., 1988 ). Все три гена, c-myc, N-myc и L-myc, часто находят в амплифицированной форме в опухолевых клетках легкого . Так, при изучении 31 клеточной линии опухоли легкого в 14 из них была показана амплификация одного из данных генов, причем большая степень амплификации также была характерна для продвинутых стадий малигнизации .

Напомним, что увеличение количества белкового продукта генов myc-семейства наблюдается во многих опухолях и трансформированных клеточных линиях и может быть вызвано различными причинами (вирусной интеграцией, транслокацией и амплификацией). Кроме того, повышение содержания мРНК и белка myc-генов находят в опухолях человека даже в отсутствие его амплификации и специфических хромосомных транслокаций ( Huber B.E. et al., 1985 , Rodriguez-Alfageme C. et al., 1992 ).

Из всего выше сказанного видно, что в отличие от семейства ras-генов , активация которых в подавляющем большинстве случаев происходит за счет качественных изменений (мутаций в структурном гене), онкогенный потенциал генов myc-семейства в основном определяется количественными изменениями белкового продукта.
^ Протоонкогены: активация путем транслокации: общие сведения
Хромосомные аберрации (в частности, транслокации ) составляют значительную часть генетических нарушений, ведущих к опухолевой трансформации. В настоящее время лучше всего изучена цитогенетика гемобластозов , хотя транслокации встречаются и в клетках солидных опухолей .

При некоторых транслокациях разрывы хромосом нарушают структуру клеточных протоонкогенов .

Транслокации особенно характерны для опухолей лимфоидной ткани , поскольку в лимфоцитах перестройка ДНК - часть нормального процесса формирования иммуноглобулинов и антигенраспознающих рецепторов . Действительно, гены, кодирующие эти белки, нередко вовлекаются в транслокации, то есть нарушение нормальной регуляции перестроек этих генов может быть причиной развития опухоли.

Активация протоонкогена транслокацией его в район тканеспецифического Ig или TCR-энхансера - один из типичных и часто встречающихся путей, связывающих опухолевую трансформацию с клеточной дифференцировкой. Этот путь особенно характерен для лимфатических лейкозов и лимфом , где генетические рекомбинации являются ведущим фактором дифференцировки. Причем речь здесь идет об онкогенах "классического" типа, прямо ведущих к автономизации клеточного цикла ( MYC , PRAD , BCL-3 ) или к бессмертию клетки ( BCL-2 ).

Особым путем опухолевой трансформации для лимфатических лейкозов, возникающих на основе транслокации с участием Ig- или TCR-локусов, является активация транскрипционных факторов, контролирующих процессы дифференцировки.

Семейство таких факторов активируется в T-лейкозах при транслокациях t(11; 14) , t(14; 19) , t(1; 14) и t(10; 14) [ Korsmeyer S.J., 1992 , Showe L.C. and Croce C.M., 1987 , Look A.Th., 1997 ].

Важно подчеркнуть, что здесь в некоторых случаях активируются ТФ , нормально действующие в нервных клетках или клетках печени [ Korsmeyer S.J., 1992 ].

Вовлечение дифференцировочных ТФ не на своем месте или не в свое время блокирует нормальный ход созревания T-клетки , не отменяя предшествующих ступеней дифференцировки. Наиболее полно в этом отношении изучено семейство дифференцировочных генов LMO и контролируемых ими белков ( Lmo2 ) [ Rabbits T.R., 1998 ].

Таким образом, в группе T-клеточных лейкозов "используется" механизм активации генов, ведущих к опухолевой трансформации, путем их переноса в район активации тканеспецифического гена TCR .

Примером служит лимфома Беркитта - опухоль из В-лимфоцитов, в которых обнаруживают реципрокную транслокацию между 8-й и 14-й хромосомами, причем точки транслокационного разрыва располагаются внутри или около локуса MYC на 8-й хромосоме и внутри локуса тяжелой цепи иммуноглобулина на 14-й хромосоме . Такая перестройка усиливает транскрипцию MYC.

Активация энхансеров в результате транслокации - важный (хотя и не универсальный) механизм опухолевой трансформации.

Хромосомные аберрации вызывают избыточный синтез нормальных или появление химерных факторов транскрипции; в обоих случаях происходит активация генов, контролирующих клеточную пролиферацию. Например, транслокация t(15;17) при остром промиелоцитарном лейкозе приводит к синтезу рецепторов ретиноевой кислоты , которые аномально распределяются в клетке и подавляют клеточную дифференцировку.

Хромосомные аберрации чаще всего затрагивают гены, кодирующие факторы транскрипции, но могут вызывать повреждения и других компонентов, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала.

Первой типичной хромосомной аберрацией, обнаруженной в опухолевых клетках человека, была филадельфийская хромосома , характерная для хронического миелолейкоза . Появление филадельфийской хромосомы - результат реципрокной транслокации, при которой происходит объединение гена тирозинкиназы ABL1 9-й хромосомы с геном BCR 22-й хромосомы ( рис. 84.11 ). Химерный белок Bcr-Abl приводит к активации путей внутриклеточной передачи сигнала, что делает клетку нечувствительной к воздействию факторов роста и вызывает ее избыточную пролиферацию.

Помимо активации факторов транскрипции и других внутриклеточных сигнальных молекул транслокации могут приводить к избыточному синтезу белков, регулирующих клеточный цикл (например, циклинов ), а также белков, контролирующих апоптоз (например, Всl2 ).

В табл. 84.4 даны примеры злокачественных новообразований, для которых характерны хромосомные аберрации, ведущие к перестройкам генов или нарушению их регуляции.

В солидных опухолях человека (особенно при раке )