Реферат: Дисципліна «Аналітичні органічні реагенти та тест-методи в аналізі»

Дисципліна «Аналітичні органічні реагенти та тест-методи в аналізі»

(2009/2010 н.р., 4 курс, 7 семестр)


Модуль 1

Змістовий модуль І. Аналітичні органічні реагенти в хімічному аналізі


Тема 6. Способи іммобілізації органічних реагентів та роль ферментів для створення тест-систем


Фізична іммобілізація (за рахунок фізичної сорбції): особливості даного способу; реагенти та носії, що при цьому використовуються; селективність визначення компонентів та шляхи її забезпечення, ємність за реагентом-модифікатором; іммобілізація в ксерогелі.

Хімічна іммобілізація за рахунок ковалентного зв’язування. Способи отримання кислотно-лужних паперів. Переваги та недоліки даних систем. Хелатоутворювальні сорбенти, що використовуються в тест-методах: на основі полістиролу, хімічно модифіковані кремнеземи на основі силікагелю. Каталітичні реакції: використання ферментів для створення тест-систем з використанням різних носіїв.


^ Реагенти на твердій матриці. Ймовірно, декілька більше поширення мають тест-засоби, приготовані на твердому носієві, — на папері, тканині, на синтетичних органічних полімерах, силікагеле і ін. Природа носія, спосіб його приготування і спосіб іммобілізації реагентів на нім мають вельми істотне значення. Реагент іммобілізують адсорбцією, випаром розчинника після імпрегнування розчином реагенту в цьому розчиннику, іншими фізичними методами або хімічною — ковалентною — іммобілізацією. Відносно слабка фіксація «фізично» закріплених реагентів на поверхні носія і, як наслідок цього, часткове змивання його при контакті з розчином є основним недоліком таких тест-систем. Збільшення міцності скріплення реагенту з носієм добиваються утворенням хімічних зв'язків між ним (хімічна іммобілізація). Проте «фізичне» закріплення, як правило, набагато простіше, тому воно вельми широко поширене.

Іммобілізація хімічних реагентів

Існують практично необмежені можливості для направленої зміни химіко-аналітічніх властивостей сорбентів за допомогою модифікування їх різними органічними і неорганічними реагентами. З носіїв найчастіше застосовують іонообмінні смоли, целюлозу, пенополіуретани, полівінілхлоридні мембрани, високодисперсні силікагелі — кремнеземи і ксерогелі. Для закріплення (іммобілізації) аналітичного реагенту на носієві використовують ряд прийомів: іммобілізація за рахунок фізичної сорбції або імпрегнування; синтетичний — за рахунок ковалентного щеплення модифікатора. Модифіковані різними реагентами тест-засоби, призначені для аналітичних цілей, можна класифікувати: 1) за способом іммобілізації, 2) за типом модифікатора, 3) за типом носія.

Іммобілізація за рахунок фізичної сорбції (фізична іммобілізація)

Спосіб фізичної іммобілізації найчастіше залежить від носія, хоча хімічна природа реагенту-модифікатора або сорбуємої речовини (комплексу) також важливі. Основний недолік такого способу іммобілізації: слабка фіксація адсорбційний закріплених водорозчинних реагентів на поверхні носія і як наслідок цього часткове змивання їх при контакті з розчином.

Малорозчинні у воді реагенти переважні, оскільки з ними виходять стабільніші при зберіганні тест-форми і вони слабо вимиваються з тесту-матриці при контакті з досліджуваною рідиною. При іммо-білізациі малорозчинних у воді реагентів на носіях використовують їх розчини в органічних розчинниках або наносять реагенти у вигляді тонкодисперсного порошку.

Застосовують також багатостадійне послідовне просочення паперу-носія розчинами вихідних реагентів з метою синтезу на нім аналітичного хромогенного реагенту. Наприклад, визначення хлоридів тестом-методом засноване на знебварвленні носія, який містить червоно-коричневий Ag2СrО4 і отриманий просоченням носія спочатку злитиму срібло, потім після висушування — хроматом натрію. При цьому малорозчинний Ag2СrО4 адсорбційний закріплюється в порах носія. Аналогічно отримують тест-форму, що містить малорозчинний комплекс цирконію з алізариновим червоним S. Носій спочатку просочують водним розчином солі цирконію, а після висушування — етанольним розчином фарбника. У присутності фториду-іонів червоний комплекс цирконію руйнується, і в кислому середовищі з'являється жовте забарвлення вільного алізарину.

Як носії використовують волокнисті матеріали, наповнені аніонообмінниками АВ-17, АВ-31, силікагелі, пластинки силасорб і сорбфіл, пінополіуретани, целюлоза, у тому числі папір, катіоно- і аніонообмінники, ксерогелі.

^ Особливості фізичної іммобілізації хімічних реагентів на деяких носіях.

1. При іммобілізації (наприклад, на іонообмінниках) поважно запобігти сорбції по функціонально-аналітичній групі, відповідальній за комплексоутворення. Інакше іммобілізація станеться, але тест-форма не вийде через відсутність колірного ефекту при взаємодії (на аніонообміннику АВ-17 були іммобілізовані арсеназо, еріохромцианін R, люмогалліон ІРЕА, магнезон ІРЕА, на катіонообміннику КУ-2 — ПАР, ПАН без втрати реакційної здатності модифікаторів).

2. При використанні однотипних носіїв, що розрізняються розміром пір, їх ємкість за модифікатором залежатиме від розміру молекул модифікатора. Показано, що адсорбція ПАН і ПАР на кремнеземах визначається не лише силами адсорбційної взаємодії реагенту з поверхнею, але і структурою кремнезему — його пористістю і питомою поверхнею. Ізотерми адсорбції катіонних форм ПАН і ПАР відносяться до ізотерм Ленгмюра, за рівняннями ізотерм оцінені зміни енергії Гіббса (таблиця. 1).

Таблиця 1




3. Не завжди оптимальні умови комплексоутворення в розчинах збігаються з умовами сорбції забарвлених комплексів. Так, на аніонообміннику АВ-17 сорбували сульфосаліцилати заліза (III) стехиометрії 1:1, 1:2 і 1:3, проте максимуми светопоглинання не збігаються з отриманими для комплексів в розчинах. Якщо в розчинах вони знаходяться при 490 (1:1), 460 (1:2) і 420 (1:3) нм, то для сорбатів спостерігається гипсохромний зсув: 460 (1:1) і 420 (1:2) нм. На кремнеземі з амінопропільнимі групами ЛИК-21 сорбується лише комплекс 1:2, але не 1:3.

У ряді випадків немає даних, які дозволили б віднести систему реагент — твердий носій до фізичної або хімічної іммобілізації реагенту. Наприклад, хімізм закріплення реагентів на поліуретанах не зовсім ясний. В той же час із застосуванням кремнезему як носій деякі автори говорять про хімічну іммобілізацію реагентів.

^ 4. Ємкість носіїв за реагентом-модифікатором грає велику роль залежно від призначення іммобілізованного реагенту, особливо якщо сам реагент забарвлений. В той же час в цьому випадку погіршується оцінка кольорів із-за їх високої насиченості. При малій ємкості носія за модифікатором велика роль випадкової складової при створенні візуально розрізняної шкали для визначення мікрокомпонента.

Пропонований для оптимізації модифікування метод кольорометрії дозволяє побудувати тест-шкалу з кроком колірної відмінності ∆Е = 10. Це дозволяє фіксувати візуально дуже тонку відмінність в кольорі.

Ємкості таких носіїв, як кремнеземи у формі силікагеля, силікагелі з прищепленими гідрофобними органічними радикалами, просто поверхні скла, кварцу і інших матеріалів на силікатній основі, а також інтервали рН, в яких ємкості носіїв постійні і спостерігається відтворюване утримування металів (інтервали гідролітичної стійкості), визначаються природою поверхневих функціональних груп і складом модифікуючого реагенту.

Для поверхонь з алкільними групами ємкість зменшується із зменшенням числа атомів вуглецю (вивчені силікагелі від СГ-С16 до СГ-С1). Ємності силікагелей з фенільними функціональними групами в більшості випадків більше ємностей силікагелей з алкільними функціональними групами. У ряді випадків ця взаємодія є визначальною: (таблиця. 2).

Ємкість залежить від складу модифікуючого розчину, в першу чергу від вмісту в нім етанолу, який був використаний для приготування більшості вихідних розчинів модифікуючих реагентів. Максимальна ємкість носіїв досягається при концентрації етанолу 5-7%, її збільшення до 20-30% істотно погіршує утримування реагентів. Для повного видалення будь-якого з вивчених реагентів досить пропустити через колонку 0,2-1,5 мл етанолу. На прикладі таких малорозчинних у воді реагентів, як ПАН, НН пока­зана перспективність мицелярної солюбилізації за допомогоюпомощью неіоннихых поверхнево-активних речовин (ПАР) для підвищення емкості носіїв.

Таблиця 2




Для добре розчинних у воді реагентів, схильних до участі в протолітічеських реакціях, на утримування істотно впливає рН розчину. Найбільше утримування спостерігається в областях рН домінування молекулярних форм реагентів, що підтверджує істотний вклад розподільного механізму в утримування.

5. Селективність. У сорбційному варіанті селективність визначення компонентів, як правило, зростає. Поліпшення вибірковості обумовлене тим, що при іммобілізації органічні реагенти завдяки геометричним особливостям закріплення реагенту на поверхні носія у ряді випадків змінюють свої комплексоутворюючі властивості, наприклад дентатність. Можна вважати, що модифіковані сорбенти найефективніше витягують іони металів, які утворюють з іммобілізованним реагентом іонні асоціати або комплекси зі співвідношенням компонентів 1 : 1. В цьому випадку зводиться до мінімуму стеричні утруднення, обумовлені фіксацією реагенту на поверхні сорбенту.

Переваги сорбційного методу:

1) Поєднання концентрації і здобуття придатної для тестування аналітичної форми концентрату;

2) Збільшенням кінетичної стійкості з'єднання у фазі сорбенту в порівнянні з їх стійкістю в розчині.

Прямим слідством з цього є підвищення селективності дії хромогенного реагенту, обумовлене збільшенням жорсткості його молекули унаслідок закріплення на полімерній матриці сорбенту. Це дозволяє використовувати у водних розчинах як нерозчинні у воді органічні реагенти, заздалегідь закріплені на сорбенті, так і реакції, що приводять до утворення малорозчинних сполук або навіть колоїдних систем. У класичній фотометрії такі реагенти і реакції використовувати практично неможливо.

У тест-методах прагнуть використовувати селективні реагенти або створюють умови селективного визначення. Так, для визначення нікелю практично у всіх пропонованих системах використаний диметилгліоксим, а для заліза (III) — гексаїіаноферрат. Як правило, при фізичній іммобілізації на твердих носіях селективність реагентів не змінюється, а при хімічній іммобілізації частіше поліпшується. Відмічено, що при хімічній іммобілізації гидразонів і формазанів на папері показники вибірковості значно збільшуються: приблизно на два порядки в порівнянні з неіммобілізованими реагентами. Це пояснюють тим, що внутрішні порожнини хромогена стають доступними лише для обмеженого круга іонів, і тим, що можливе утворення комплексів лише складу 1:1. Це дозволило застосувати такі реактивні індикаторні папери для визначення Fe(Il, Zn, Cu(II), Cd, Pd(II) в стічних і природних водах без попередньої їх пробопідготовки і вживання маскуючих речовин.

Підбір імпрегнуємих на папері малорозчинних сполук для селективного визначення конкретного елементу заснований на побудові рядів розчинності для неорганічних солей "срібла, диетилдитіокарбамінатів і дитизонатів.

В разі вживання малоселективних реакцій використовують прийоми маскування і відділення що заважають визначенню елементів безпосередньо на носієві. До складу просочувальних розчинів, окрім реагенту, вводять і маскуючі речовини. Рідше за них вводять безпосередньо в досліджувану рідину. Ефективне використання багатошарових паперів або плівок, де один з шарів містить маскуючі речовини, наприклад ЕДТА, цитратну кислоту і ін. [Досліджуваний розчин, поміщений на таку багатошарову матрицю, звільняється від заважаючих компонентів ще при досягненні шару, що містить реагент. Важливо підтримувати певне середовище для оптимальних умов реакцій з конкретними компонентами. Цього досягають як введенням буферних речовин безпосередньо на стадії підготовки тест-систем, так і додаванням різних розчинів в досліджувану рідину. Часто використовують KHSO4, цитратну кислоту, Na2B4O7, Na2CO3, KH2PO4, НС1, HNО3,NaOH.
^ Способи модифікування матриці . А — модифікування в динамічних умовах; У — модифікування в статичних умовах; З — золь-гель методика (цей спосіб модифікування використовується при іммобілізації в ксерогелі).


Таблиця 3



^ Іммобілізація в ксерогелі. Е. І. Моросановою і співавт. розроблені способи іммобілізації аналітичних реагентів в ксерогелі кремнієвої кислоти.
Такі модифіковані ксерогелі використані для багаточисельних тесту-визначень — або як порошки, або як наповнювачі індикаторних трубок для аналізу води і інших рідин. Модифіковані ксерогелі кремнієвої кислоти готували з використанням зол-гель технології, що включає гідроліз тетраетоксисилана (ТЕОС) у водно-етанольной середовищі у присутності закріплюваного реагенту з утворенням гелю і його (висушуванням — здобуттям «сухого гелю» (ксерогеля). Вивчена іммобілізація азосполук, похідніх тріфенілметану, ксантону та багато інших органічних реа¬гентов, солей Cu(Il), Co(II, III), Fe(III), молібдофосфорной кислоти (МФК), її амонійної солі, реагентів, вступаючих в реакції азо або окислювального поєднання, — 1-нафтолу, 2-нафтолу, 2,7-діоксинафталіна (2,7-ДОН), 4-аміноантіпіріна (ААП) (таблиця. 3). Залежно від розчинності закріплювані реагенти вводили в суміш для гідролізу у вигляді водного або етанольного розчину або у вигляді седиментаційний стійкій етанольной суспензії (отриманою під впливом ультразвуку).

Золь-гель технологія —універсальний спосіб здобуття модифікованих кремнеземів. Специфіка утримування іммобілізованних реагентів матрицею ксерогелів, коли вклад механічного захвату в утримування вельми суттєвий, виражається в розширенні числа іммобілізуємих реагентів, можливості здобуття матеріалів з більшою концентрацією закріплюваного реагенту і ширшим діапазоном гідролітичної стійкості в порівнянні з модифікуванням силікагелей в статичних і динамічних умовах


^ 1.2. Хімічна іммобілізація


При іммобілізації за рахунок ковалентного зв'язування (хімічна іммобілізація) як носії використовують: 1) папір; 2) органополімерні сорбенти і силікагель. Число використовуваних носіїв менше в порівнянні з числом носіїв при фізичній іммобілізації.

^ 1.2.1 Спосіб отримання кислотно-основних паперів з ковалентним закріпленням індикатора

Цей спосіб описаний ще в 1964 р. аміносполуки з активною вінілсульфоновою групою діазотували і поєднували з різними азобарвниками (1-нафтол, фенолом, диметиланіліном).

Індикаторні папери з ковалентно закріпленим реагентом отримували обробкою целюлози в лужному середовищі. Описано аналогічний синтез і ковалентне закріплення азобарвників на папері для визначення рН. В якості носія м.б. використано хроматографічний папір, модифікований гліциділ-метакрилатом і епіхлоргідріном. Ковалентне закріплення реагентів, на відміну від адсорбційного, призводить до того, що такі папери можна використовувати багато разів після руйнування визначуваного комплексу, наприклад, промиванням водою або кислотою.

Запропонований спосіб хімічної іммобилизації бензидину на епоксидирований папір або силикагель (SG)



Отримані тест-форми використано для визначення окисників (С12, Н2О2, K3[Fe(CN)6]) або — після отримання солей діазонію — аніліна та фенолів.

Для визначення малих кількостей нітратів та нітритів (ск = = 0,01 мг/л) запропонована хімічна іммобілізація 1-нафтиламіна на диальдегідцелюлозу







NO2+

При взаємодії з солями діазонія безбарвний папір забарвлюється в червоний колір в результаті синтезу азосполуки:



Отриманий папір відрізняється також стабільністю при зберіганні на повітрі і, на відміну від 1-нафтиламіну, малотоксичний.

Багато реактивних індикаторних паперів (РІП) з хімічною іммобілізацією реагентів отримано В. М. Островською з співавт. Запропоновані автором пристрої дозволяють концентрувати в потоці і потім оцінювати напівкількісний вміст досліджуваних компонентів. Запропоновано РІП на аніони SO42-, Сl-, СrO42-, окислювачі, ароматичні аміни, гідразин, кетони (ацетон, метилбутилкетон, аце-тооцтова кислота), феноли. Межі виявлення співставлені з ГДК на ці сполуки. Деякі РІП дуже вибагливі. Наприклад, визначення 1 мг / л заліза (III) при рН 3-4 за допомогою РІП -Залізо (II, 111)-Тесту не заважають (в мг / л): Cd, К, Са, Mg, Na, Ni , Cr (Ill), Zn 1000.


^ 1.2.2 Хелатоутворювальні сорбенти — зшиті полімери тримірної структури

Ці сорбенти володіють комплексоутворювальними або одночасно іонообмінними та комплексоутворювальними властивостями, які обумовлені наявністю функціонально-аналітичних груп, що входять до складу полімеру. Найбільш розповсюджені сорбенти на основі сополімера стиролу з дивінілбензолом та хімічно модифіковані кремнеземи на основі силікагеля.

Особливості даних сорбентів. Такі сорбенти дозволяють сконцентрувати визначуваний іон, відокремити його від матриці і супутніх іонів і визначити або у фазі сорбенту методами спектроскопії дифузного віддзеркалення або твердофазної спектроскопії, або після десорбції — будь-яким методом. Оскільки сорбати забарвлені, можна вважати, що інтенсивність їх забарвлення можна оцінювати або візуально, або за допомогою кишенькових тест-аналізаторів.

^ 1.2.3. Хімічно модифіковані кремнеземи (ХМК)

Вони містять також функціональні групи на різні іони, їх широко використовують для концентрування і розділення. У тест-методах ХМК не застосовували, хоча принципова можливість для цього є. Сорбат, як і матриця, безбарвний і сорбований компонент навіть при високій концентрації на ньому не видно. Якщо сорбат обробити реагентом, який утворює дуже стійкий і забарвлений комплекс, то можна тестувати компоненти в такий спосіб.

Другий варіант використання — концентрування в малому об'ємі сорбату для підвищення чутливості, десорбція малим об'ємом елюента (зазвичай кислотою — при визначенні металів) і тестування у водному розчині. Відомі ХМК, що містять в якості хімічно іммобілізованих реагентів моно- і поліамінні групи, комплексони (імінодиоцтову, етилендіамінтетраоцтову кислоти), гідроксамову кислоту, неокупроїн, 1,10-фенантролін, диетилдитіокарбамінат, формазани.

^ 2. Каталітичні реакції

2.1. Використання ферментів

Ферменти (біологічні каталізатори) багато в чому відрізняються від звичайних хімічних реагентів. Як правило, вони виявляють каталітичну активність по відношенню лише до невеликого числа процесів і речовин, тому відрізняються великою, інколи унікальною, селективністю. Каталітична активність ферментів зазвичай дуже висока, тому для аналітичних цілей використовують лише вельми невеликі їх кількості і концентрації.

Проте активність ферментів сама по собі залежить від багатьох чинників — джерела, з якого виділений препарат, часу і умов його зберігання, очищення, умов використання.

Для створення тест-систем зручні не нативні (у вільному стані), а іммобілізовані ферменти, притому найбільш стійкі і відносно недорогі (звичайно, ферменти практично завжди дорожче за звичайні хімічні реагенти). Описано вживання пероксидази, глюкозооксидази, уреази, холіноестерази, моноамінооксидази та ін.

При виборі ферментів для створення тесту-засобів враховується можливість здобуття аналітичного сигналу, що легко фіксується.

Іммобілізацію ферментів для створення тест-систем проводять із застосуванням різних носіїв — паперів, полімерів, наприклад поліуретанов. Зручний спосіб іммобілізації — утворення твердого розчину в плівкотвірних речовинах, наприклад в хітозані, який є полісахаридом, отриманим з хітину за допомогою лужного гідролізу. Хітозан розчинний у воді і буферних розчинах. Використовують і інші плівко утворюючі речовини, які, сприяють збереженню активності ферменту, — полівініловий спирт, желатин та інш.


Ферменти закріплюють на носіях і хімічними методами. При цьому використовують частіше альдегідцелюлозу. Вільні аміногрупи ферменту зв'язуються з альдегідними групами целюлози. Аналогічним чином пов'язують з целюлозою імуноглобуліни для іммуноферментних реакцій на папері. Для меншої змиваємості ферментів з матриці використовують «прошивку» її глутаровим альдегідом або використовують глутаровий альдегід як зшиваючий агент між матрицею, що містить аміногрупи, і ферментом. Не дивлячись на деяку втрату активності ферменту, хімічна іммобілізація приводить до здобуття стабільніших тесту-форм з терміном зберігання не менше року при кімнатній температурі.

Викоритання: Велике число тест-систем, розроблених особливо для виявлення бойових отруйних речовин, засноване на використанні холіноестерази. До найпоширеніших відносяться також тест-системи для визначення глюкози в крові, що включають вживання глюкозооксидази. Більшість тест-методів з використанням ферментів виконують на паперах, оброблених ферментами і додатковими реагентами, а інтенсивність забарвлення оцінюють візуально.

Запропоновано тест-смуги для визначення теофіліну в крові методом ферментативної іммунохроматографії в діапазоні 2,5-40 мг/л.


^ 2.2. Каталітичні неферментативні реакції

Прикладом кінетичного методу може служити метод візуального автокаталітичного визначення слідів кобальту (II). Аналітичним сигналом служить час знебварвлення забарвленої сполуки— інертного біс[2-(5-бром-2-піриділазо)-5-(М-пропіл-М-сульфопропіл)амінофеноляту]кобальту (III), яку руйнують окисненям за допомогою пероксимоносульфату. Іони кобальту, звільнюються при окислювальному розкладанні цієї сполуки, виступають як каталізатор розкладання комплексу. Час розкладання обернено пропорційний до логарифма вихідної концентрації кобальту (II). Визначення проводять у присутності деякої кількості вільного азореагенту в декількох варіантах — макро (3 мл аналізованого розчину), мікро (на пластинці, використовують 30 мкл розчину проби) і з використанням плями (1,5 мкл розчину проби). Метод з використанням швидкості реакції розроблений з використанням реакції Ландольта, що каталізує деякими іонами і застосованій для визначення ванадію і молібдену. Реакції каталітичного заміщення застосовані для візуального визначення загального вмісту важких металів у воді.

3. Іммунометоди


Іммунотести вже протягом декількох останніх десятиліть широко використовують в медицині, частково при оцінці харчових продуктів. У 90-х рр. вони отримали поширення при аналізі об'єктів довкілля. На їх основі створені, продаються і використовуються всілякі набори для визначення поліароматичних вуглеводнів, поліхлорбіфенілів, пентахлорфенолу, багаточисельних пестицидів і інших речовин у воді, їжі, грунтах.

Американське агентство з довкілля (US EPA) охорони прийняло до використання ряд іммунотестів, в основному для on-site скринінгу. Так, на основі іммуноферментного аналізу створені і застосовуються методи визначення бензолу, толуолу, ксилолу, поліхлорбіфенілів, поліхлорфенолів, пестицидів у воді і в грунті, а також кокаїну і героїну. Методи вельми підходять для попередньої оцінки зразків в тих випадках, коли йдеться про виявлення і визначення лише невеликого числа компонентів. EIA тести прості, експресні (хвилини) і відносно недорогі (хоча і дорожче хімічних).

^ До недоліків таких методів, на думку фахівців ЕРА, відносяться наступні: методи вимагають багато часу, якщо потрібно проаналізувати велике число проб. Кожна визначувана речовина вимагає відповідних реагентів і своєї методики, що робить аналіз на велике число компонентів тривалим. Контроль якості аналізів '' (QA/QC) у позалабораторних умов забезпечити нелегко. Для ряду органічних токсикантів тест-набори важко доступні або взагалі відсутні.

Фірма «Мерк» розробила і випускає іммунотести на 2,4,6- тринітротолуол. Але частіше всіх іммунотести використовують для визначення пестіцидів. Так, американська фірма Ohmicron розробила і продає велике число наборів (test kits), заснованих на ELISA, для визначення різних пестицидів (таблиця 4).

Таблиця 4