Реферат: Эколого-биохимическая характеристика микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья

На правах рукописи


Шагжина Айви Петровна


Эколого-биохимическая характеристика

микроорганизмов, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья


03.00.16 – экология

03.00.07 – микробиология


А В Т О Р Е Ф Е Р А Т


диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Улан-Удэ 2007


Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН


^ Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Баир Бадмабазарович Намсараев







^ Научный консультант:

доктор биологических наук

Яков Ефимович Дунаевский







Официальные

оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Александр Иванович Саралов




кандидат биологических наук, доцент

Любовь Батомункуевна Буянтуева







^ Ведущее учреждение:

Лимнологический институт СО РАН



Защита диссертации состоится «16» мая 2007 г. В 900 часов на

заседании диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском

государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ

ул. Смолина, 24а, конференц-зал.

Факс: (3012) 211593, e-mail: d21202203@mail.ru


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государственного университета


Автореферат разослан « 13 » апреля 2007 года.


Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Шорноева Н.А.


Актуальность темы. Азот является одним из важнейших биофильных элементов, во многом определяющий характер и направление микробиологических процессов в различных экосистемах. Избыток или недостаток азотсодержащих соединений отражается на общей продуктивности водоемов. В настоящее время накоплен большой материал, освещающий круговорот азота в таких водных экосистемах как моря, океаны и озера (Кузнецов и др., 1989; Goering, Parker, 1972; Birch, Spiridakis, 1981; Knowles, 1982; Kuenen et. al., 1988; Zehr et al., 1998; Саралов, 1991; Zumpf, 1992; Koops, 2001; Lis, 2006).

В гораздо меньшей степени изучены особенности цикла азота в экосистемах, характеризуемых как экстремальные. В пределах Байкальской рифтовой зоны широко распространены слабоминерализованные источники, газирующие азотом с высокими значениями температуры (до 75оС) и рН (до 10). В щелочных термальных источниках проведено много исследований, посвященных азотфиксирующим цианобактериям. В то же время роль алкалотермофильных азотфиксирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий в биогеохимическом цикле азота изучена недостаточно.

Цель исследования - изучение бактериальных про­цессов цикла азота в гидротермах Прибайкалья, выделение и описание алкалотермофильных бактерий, участвующих в этих процессах.

Задачи исследования:

Изучение физико-химических параметров исследуемых щелочных термальных источников Прибайкалья.

Исследование сезонной динамики азотсодержащих соединений в илах.

Определение интенсивности бактериальных процессов цикла азота.

Изучение внеклеточной протеолитической активности в нативных образцах.

Определение численности азотфиксирующих, аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих бактерий по сезонам.

Выделение чистых культур бактерий цикла азота и изучение их физиолого-биохимических свойств и определение функциональной активности.

Научная новизна работ. Впервые проведена комплексная оценка интенсивности микробного цикла азота в щелочных гидротермах. Впервые изучено пространственно-временное распространение бактерий, участвующих в процессах трансформации азота в щелочных термальных источниках Прибайкалья. Определено вертикальное распределение бактерий круговорота азота, содержание органических веществ и внеклеточная протеолитическая активность микроорганизмов в илах гидротерм. Выделены накопительные и чистые культуры азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов, способные

расти в щелочных условиях среды (рН до 10,2) при высоких температурах (до 700С ). Описана алкалотермофильная нитритокисляющая Nitrospira sp. с оптимумом роста при температуре 48оС и рН 8,7.

Практическая значимость. Количественная оценка функциональной активности микроорганизмов круговорота азота может быть использована для определения экологического состояния водных экосистем. Выделенные культуры представляют интерес для биотехнологии как активные продуценты протеаз, устойчивых к высоким значениям температуры и рН. Материалы, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении курса лекций по предмету “Микробиология”, "Биохимия", “Экология”.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2004); Южносибирской научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири» (Хакасия, 2004, 2005); Международной конференции “Экосистемы Монголии и приграничных регионов сопредельных стран: природные ресурсы, биоразнообразие и экологические перспективы”, Улан-Батор (Монголия) 2005; V межрегиональной научной конференции молодых ученых «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона», (Улан-Удэ, 2006); Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ (Москва, 2005, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).

Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 14 работ.

Объем работы. Диссертация включает 9 глав и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы (80 отечественных и 111 зарубежных источников) и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и иллюстрирована 29 рисунками и фотографиями.

Благодарности Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву и сотрудникам Лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, научному консультанту д.б.н. Я.Е.Дунаевскому, д.б.н., проф. А.Л. Степанову, родным и близким.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ 05-04-97215р_байкал_а; Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы»; МО РФ № РНП. 2.1.1. НОЦ «Байкал»; Президиума СО РАН №24.


^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Объекты исследования

Объектами явились 10 термальных щелочных гидротерм Байкальского региона: Горячинск, Алла, Гарга, Кучигер, Уро, Сея, Умхей, Котельниковский, Змеиный, Хакусы. В газовом составе воды источников содержится до 98-99% молекулярного азота (Борисенко, Замана, 1978).

Объектами более детального рассмотрения процессов круговорота азота явились гидротермы Алла, Кучигер и Горячинск. Источник Алла и Кучигер находятся в Баргузинской долине (Северное Прибайкалье). Источник Горячинск расположен на юго-восточном побережье озера Байкал, где станция Г1 - излив источника, единственное место, которое характеризуется обильными обрастаниями циано-бактериальных матов. Далее по ручью, до станции Г3 сохраняются физико-химические параметры источника, после начинается постепенное снижение температуры, рН и изменение других химических показателей. Станция Г4 - проточный пруд. Станция Г5 расположена в месте смешения естественной воды источника со сточными водами прошедшими очистную обработку. Далее ручей протекает через залесенную местность и втекает в озеро Байкал - станция Г-6.

^ 1.2. Методы исследования

Гидрохимический анализ воды был выполнен по общепринятым методикам. Температуру измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия), рН определяли потенциометрически при помощи портативного рН-метра (рНер2, Португалия). Для определения окислительно-восстановительного потенциала использовали портативный измеритель redox-потенциала ORP (Португалия). Минерализацию воды определяли при помощи портативного тестер-кондуктометра TDS-4 (Cингапур).

Кислород в воде источника определяли методом Винклера (Резников и др., 1970). Концентрацию сульфида определяли колориметрически с пара-фенилендиамином на полевом спектрофотометре ПФЭК-П-2 (Trüper, Schlegel, 1964). Содержания карбонатов и гидрокарбонатов определяли титрованием (Резников и др., 1970). Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд (Досон и др., 1991), содержание органического вещества – по методу Тюрина в модификации Никитина (Аринушкина, 1979). Концентрацию общего азота определяли по Къельдалю, минеральных форм азота - колориметрически (Аринушкина, 1979) и фотометрически (Лурье, 1984).

Пробы грунтов, микробных матов и растительных остатков для микробиологического исследования отбирали в стерильную посуду. Общую численность микроорганизмов в илах определяли путем подсчета бактерий на мембранных ультрафильтрах (Романенко, Кузнецов, 1974) с диаметром пор 0,23 мкм (фирма Сынпор).

Численность азотфиксирующих, аммонифицирующих, денитрифицирующих и нитрифицирующих бактерий в образцах ила определяли путем посева на элективные питательные среды с учетом температуры и рН in situ методом десятикратных разведений. Значения рН среды доводили карбонатно-гидрокарбонатным буфером. Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста, численность бактерий определяли общепринятыми методами (Методы.., 1984). Молекулярно-генетические анализы выделенных штаммов проводили на коммерческих условиях. Транслированные аминокислотные последовательности сравнивали с последовательностями из Gen Bank, используя программы NCBI BLAST (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Определение внеклеточной протеазной активности в экстрактах природных образцов на основе фосфатного буфера (рН 7) и в культуральной жидкости проводили по методу Эрлангера с соавт. (Erlanger et.al., 1961), используя 5 мМ синтетические субстраты N-бензоил-L-аргинил-п-нитроанилид (БАПА), карбобензокси-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (КААЛП), пироглутамил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид (ГААЛП) а также с помощью тринитрофенилирования, используя 1%-ный белковый субстрат желатин (рН 8). Инкубировали в течение 1, 12 и 24 часов при температуре 370С, с последующим спектрофотометрическим определением активности при 410 нм. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента в исследуемом образце, которое расщепляет 1 нмоль продукта в указанных условиях инкубации за 1 минуту. Для выяснения природы функциональных групп активного центра штаммов к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 40 минут при температуре 370С, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы металлопротеаз– этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), цистеиновых протеаз - иодацетамид (ИAA) и сериновых протеаз – фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Для определения оптимума рН активности исследуемых протеиназ по отношению к синтетическим субстратам были использованы цитрат-фосфатные, фосфатные, гидрокарбонатные буферы (Досон и др., 1991) в диапазоне рН 2-11. Температурный оптимум ферментов определяли, измеряя их активность после 5-минутной инкубации при температурах от 20-800С.

Скорости деструкции белка и целлюлозы были измерены аппликационным методом (Мишустин, Петрова, 1987).

Интенсивности процессов дыхания, азотфиксации и денитрификации измерены газохроматографически (Методы.., 2002). Анализ газов (С2Н4, N2O и СО2) проводили на газовых хроматографах Chrom-41 и М-3700/4 (Россия). Общее время инкубации составляло 1–2 часа при определении эмиссии CO2, и 12–48 часов при определении эмиссии N2O. Определение активности денитрификации и азотфиксации проводили в присутствии ацетилена, который вводили во внутренний объем изолятора (10% от объема камеры). Потенциальную (субстрат-индуцированную) активность дыхания и фиксации молекулярного азота, интенсивность эмиссии закиси азота определяли после обогащения образцов донных осадков соответствующими субстратами (Методы.., 1991). Интенсивность процессов нитрификации изучали согласно Кузнецову (1970).

Определение интенсивности бактериальных процессов и химических показателей в образцах илов проводили в нескольких повторностях. Статистическая обработка данных выполнена стандартными методами по Плохинскому Н.А. (1961); Ашмарину И.П., Воробьеву А.А. (1962).


^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья

Для исследования были отобраны пробы воды, илов, микробных матов и растительных остатков из гидротерм: Горячинск, Алла, Гарга, Кучигер, Уро, Сея, Умхей, Котельниковский, Змеиный, Хакусы. Температура воды на выходах термальных источников варьировала в широких пределах (45,5 - 76,2оС). Наиболее высокотемпературными были источники Уро (69,9оС), Котельниковский (71,0 оС), Гарга (72,5 оС), Алла (76,2 оС). Воды имели щелочную реакцию, значение рН варьировало от 7,6 до 9,9. Температура и рН в термальных водах снижалась по мере удаления от излива.

Максимальные концентрации сероводорода были зафиксированы в источниках Кучигер (23 мг/л) и Умхей (33 мг/л). В гидротермах отмечены низкие значения окислительно-восстановительного потенциала (до +103 Мв). Концентрация сероводорода по ручью уменьшалась, концентрация кислорода и значения Eh увеличивались.

Содержание гидрокарбонатов в воде исследуемых проб достигало 167,7 мг/л. Для источников характерна низкая минерализация, которая была в пределах от 0,15 до 0,8 мг/л.

Источник Кучигер, расположенный в болотистой местности, содержал до 19,2% органического углерода. Наименьшее количество органического углерода 0,3 - 0,4% определено в источнике Алла, выходы которого приурочены к каменистой местности. Количество белка в исследуемых пробах составляло от 0,36 (ист. Алла) до 0,83 мг/мл (ист. Гарга). В целом концентрация органического вещества в матах и растительных остатках была выше, чем в илах.

Общее количество азота в илах источников варьировало от 0,09 до 2,77 %. Максимальное количество аммонийного азота равное 2,34 мг/100г определено в источнике Кучигер, минимальное – 0,78 мг/100г в источнике Горячинск. Содержание нитритного и нитратного азота в некоторых пробах илов было ниже предела чувствительности прибора. Максимальные концентрации нитритного и нитратного азота были определены в источнике Кучигер и достигали 0,13 мг/100г.

^ 2.2. Сезонные изменения условий среды в источнике Горячинск

Максимальная температура воды (51,5 оС) источника на изливе (ст. Г1) зафиксирована зимой. В летнее время температура снижается до 47 – 48,5 оС. Вниз по ручью наблюдается постепенное уменьшение температуры воды. Летом температура воды на станциях Г5 и Г6 составляет 25 и 18,7 оС, соответственно. Значения температуры воды на станциях Г4, Г5 и Г6 следовали изменениям температуры воздуха. Максимальное значение рН равное 9,0 отмечено на станции Г1 и в течение года ее величина держится приблизительно на одном уровне. Далее по течению отмечено постепенное понижение величины рН до 7,2 и 6,7 (ст. Г6).

Концентрация кислорода в термальном источнике Горячинск увеличивается по ручью и в среднем составляет 1,1 - 4,2 мг/л. В летний период времени на изливе источника отмечено увеличение содержания растворенного кислорода в воде. Максимальное содержание сероводорода в источнике отмечено осенью на станции Г3 в количестве

1,22-1,33 мг/л (рис.1). По концентрации гидрокарбонатов и карбонатов в источнике было отмечено, что в точках максимума гидрокарбонатов наблюдается минимум карбонатов и наоборот. В течение года максимальное количество карбонатов было обнаружено в конце зимы, максимальное количество гидрокарбонатов – летом.

Определение динамики подвижных форм азота в илах выявило разное их содержание по сезонам (рис. 2). Максимальное содержание аммонийного азота в илах источника Горячинск было определено летом, минимальное - весной. В то же время весной отмечено увеличение нитратного азота почти вдвое по сравнению с осенними показателями. Наименьшее количество нитритного азота было определено летом.




Рис. 2. Сезонная динамика подвижных форм азота: а) аммонийный, б) нитритный,

в) нитратный в илах источника Горячинск.

Время отбора проб: III – 6 марта, V – 25 мая, VIII - 27 августа, XI - 2 ноября.




Соотношение Сорг./Nобщ. в илах варьировало в пределах от 8 до14

в течение года. На станциях Г1, Г4, Г6 соотношение Сорг./Nобщ. с октября по май держалось на одном уровне в пределах 10-12, и только в летнее время отмечено небольшое снижение на фоне повышенного содержания в источнике аммонийного азота.

Концентрации кислорода, карбонатов, гидрокарбонатов, подвижных форм азота в источнике подвержены внутригодовой динамике. При этом основные факторы среды, такие как температура, рН и минерализация, остаются относительно постоянными.

^ 3.1. Численность функциональных групп бактерий, участвующих в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья

Во всех исследуемых пробах была определена численность азотфиксаторов, аммонификаторов (протеолитиков), нитрификаторов и денитрификаторов. Ключевую роль в биологическом круговороте азота

играют микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот. Численность азотфиксирующих бактерий колебалась от 2,0 ×102 до5,5×107кл/мл. Максимальная численность азотфиксаторов наблюдалась в пробах источников Горячинск, Алла, Котельниковский. Многократный анализ показал, что при количестве аммония до 1,0 мг/100г ила корреляции содержания аммония с численностью азотфиксаторов не обнаружено, а при повышенном содержании аммония (>1,0 мг/100г) наблюдается обратная зависимость (rср = -0,71). Поэтому невысокая численность азотфиксаторов в источниках Кучигер и Сея, вероятнее всего, связана с повышенным содержанием аммония. В то же время именно в этих источниках была определена наиболее высокая численность бактерий, участвующих в минерализации белков - аммонификаторов. Численность аммонифицирующих бактерий в изученных гидротермах составляет от 1,3×103 до 7,0×108 кл/мл и коррелирует с содержанием аммония (rср = 0,65). Наибольшее количество аммонификаторов было выявлено в матах и растительных остатках. Количество нитрификаторов I и II фазы в илах источников Горячинск, Алла и Гарга достигало: аммонийокисляющих бактерий – 1,3×106 кл/мл, нитритокисляющих бактерий – 4,7×105 кл/мл. Обнаружены корреляции численностей нитрификаторов I и II фазы с содержанием аммония (rср = 0,43) и нитратов (rср = 0,64), соответственно. Наибольшее количество бактерий – денитрификаторов (6,3×105 кл/мл) наблюдалось в илах источников Кучигер, Сея и Змеиный. Минимальное количество (1,7×101 кл/мл) было зафиксировано в пробах источников Алла и Горячинск. Следует отметить, что была установлена линейная зависимость между численностью денитрификаторов с нитратами (rср = 0,63), с нитритами (rср= 0,51) и аммонием (rср= 0,49). Корреляционной связи численности бактерий цикла азота с температурой, рН и минерализацией в исследуемых источниках не установлено.

В источнике Горячинск было изучено вертикальное распределение бактерий по глубине грунта. На станции Г4 максимальная численность бактерий цикла азота определена в поверхностном слое ила (до 2 см) и в придонной воде. На стациях Г1 и Г6 максимальное количество азотфиксаторов и денитрификаторов находится в слое 2-5 см, аммонификаторов – в слое 2-10 см. Нитрифицирующие бактерии были обнаружены только на поверхности (до 2 см), в слое 2-5 см их численность не превышала 0,5×101 кл/мл. На глубине 20-30 см выявлено значительное уменьшение численности азотфиксаторов, аммонификаторов и денитрификаторов. Отмечена прямая зависимость (rср = 0,87) между количеством белоксодержащих соединений с численностью аммонификаторов, характерная для всех изученных слоев ила.


^ 3.2. Сезонная численность бактерий в источнике Горячинск

Наименьшая общая численность микроорганизмов (ОЧМ) отмечена в ноябре - 1,35×106 кл /мл, наибольшая - в мае (8,1× 108 кл /мл). Наибольшее количество азотфиксаторов 4,3×107 кл /мл обнаружено в феврале, наименьшее (1,3×102 кл /мл) – в августе, что определяется количеством аммонийного азота в илах. Максимальная численность аммонификаторов была отмечена весной, минимальная – летом и осенью. Численность денитрификаторов варьировала от 6,0×101 до 4,7×105 кл/мл, нитрификаторов от 3,0×101 до 1,3×106 кл/мл (рис. 3). Повышение количества бактерий в феврале происходит за счет накопления за зимний период легкоусвояемых источников углерода и энергии.

У


^ Рис.3. Сезонная динамика численности групп бактерий в илах источника Горячинск
меньшение количества азотфиксаторов летом и осенью определяется увеличением аммонийного азота в этот период. Летнее снижение концентрации нитратов и нитритов в илах при низком содержании нитритокисляющих и денитрифицирующих бактерий обусловлено использованием легкоусвояемых форм азота цианобактериальным сообществом, активно развивающимся в это время. Изменение структуры микробного сообщества в гидротерме связано с сезонными колебаниями физико-химических параметров среды и содержанием минеральных форм азота, которые накапливаются за счет поступления из прибрежной зоны и функционирования биоты.

Детальное изучение зависимости физико-химических условий и численности бактерий в источнике Горячинск позволило установить, что численности азотфиксаторов (rср= - 0,36), аэробных аммонификаторов (rср= - 0,44) и нитрификаторов (rср= - 0,61) отрицательно коррелируют с концентрацией сероводорода. Корреляция содержания сероводорода с численностями денитрификаторов и анаэробных аммонификаторов отсутствует. Содержание кислорода положительно коррелирует с численностью нитрификаторов (rср= 0,73), отрицательно - с численностью денитрификаторов (rср= - 0,34); с численностью азотфиксаторов и аммонификаторов корреляции не обнаружено.

Таким образом, в источниках основными факторами, влияющими на численность бактерий круговорота азота, являются: содержание минеральных форм азота, качественный и количественный состав органических веществ, содержание сероводорода и кислорода в придонной воде.

^ 4.1. Эмиссия СО2 в илах источников Прибайкалья

Значения динамики дыхания варьировали в пределах от 0,07 мкг С-СО2/ г в час до 0,96 мкг С-СО2/г в час. Максимальные значения наблюдались в местах с повышенным содержанием органических веществ. Высокие значения биологической активности илов выявлены в источнике Кучигер, величина скорости эмиссии СО2 составила 0,96 мкг С-СО2/г ч и 0,73 мкг С-СО2/ г ч соответственно. Высокая эмиссия диоксида углерода подтверждается высокими величинами скорости минерализации илов в источнике Кучигер, скорость деструкции белоксодержащих соединений достигала 2,43% в сутки, целлюлозы - 1,2 % в сутки. Самый низкий показатель дыхания обнаружен в пробах источника Алла (Ал 9/4) и Горячинск. Корреляция интенсивности дыхания илов с содержанием Сорг в илах источников составило rср= 0,82.

Исследование динамики дыхания за период осень – весна в илах источника Горячинск показало, что величина потока диоксида углерода изменялась от 0,073 до 0,281 мкг С-СО2/г ч в ноябре и от 0,276 до 0,629 мкг С-СО2/г ч в марте. Показатели потенциальной интенсивности дыхания в исследованных образцах ила на 1-2 порядка выше актуальных.


^ 4.2. Денитрифицирующая и азотфиксирующая активность в илах источников Прибайкалья

З
ТоС: 60 49 24 47 34 41 45 23 25 18

рН : 9,9 9,9 9,6 9,9 9,4 9,4 8,5 7,6 8,1 6,7 Рис. 4.Скорость азотфиксации в гидротермах Алла,

Кучигер и Горячинск.




Рис. 5. Скорость денитрификации в гидротермах Алла, Кучигер и Горячинск.

Примечание: значения температуры и рН на станциях источников см. на рис. 4.


начения азотфиксирующей активности в минеральных источниках варьировали от 0,002 нг N2/г ч до 0,499 нг N2/г ч (рис.4). Относительно высокие значения выявлены в гидротерме Горячинск (Г-4, Г-6). Здесь азотфиксация была равна 0,499 нг N2/г ч и 0,447 нг N2/г ч. Наиболее низкие значения были установлены в илах источников Алла (Ал 9/3) и Кучигер (Кu 8-20).

Оценка процесса денитрификации в илах минеральных источников показала, что активность была в пределах 0,024 - 0,661 нг N2O/г ч. Максимальное выделение закиси азота выявлено в термальном источнике Алла на станции Ал 9/4 (0,661 мкг N2O/ г ч). Наиболее низкие показатели денитрифицирующей активности установлены в илах термального источника Горячинск. Активность денитрификации в этом источнике не превышала 0,035 нг N2O/ г ч (рис.5).

С
осень: Т оС 47 44,1 14 11,5 6,5

рН 8,9 8,5 7,4 7,5 6,7

весна: Т оС 51,5 43,3 12,2 - -

рН 9,0 8,5 7,4 - -


^ Рис.6. Сезонная динамика азотфиксирующей активности в илах ист. Горячинск.

езонная динамика процессов азотфиксации, нитрификации и денитрификации в илах источника Горячинск. Результаты межсезонных исследований процесса азотфиксации в илах показали увеличение нитрогеназной активности весной до 0,584 нг N2/г ч (рис. 6). Значения скорости азотфиксации коррелируют с сезонной динамикой численности азотфиксирующих бактерий. Весной численность диазотрофов достигала максимума - 10 млн кл/мл. На станциях, где были определены максимальные величины азотфиксирующей активности, величина соотношения С/N варьировала в пределах 10-12, что является благоприятным условием для процесса азотфиксации. Эти результаты согласуются с данными исследований в других биотопах (Саралов и др., 1982, Новиков и др., 2004). Таким образом, наиболее важными регулирующими факторами активности азотфиксации в различных экосистемах является обеспеченность усвояемым азотом и качественный состав органического вещества.


^ Рис. 7 . Сезонная динамика нитрифицирущей активности в илах ист. Горячинск по ручью. Примечание: значения температуры и рН осенью и весной на станциях см. на рис. 6.
Изучение нитрифицирующей активности бактерий в илах выявило ее низкую скорость, которая варьировала в пределах от 0,3 до 1,5 нг NO3-/ г в сутки – осенью и 1,1-2,4 нг NO3-/ г в сутки – весной (рис. 7). Численность нитрифицирующих бактерий по ручью источника составила: осенью от 1,7×103 до5,0×104кл./мл, весной – увеличилась на порядок.

О
Рис. 8. Сезонная динамика денитрифицирующей активности в илах ист. Горячинск. Примечание: значения температуры и рН осенью и весной на станциях см. на рис. 6.
пределение активности денитрификации в разные сезоны, также как и активности процесса нитрификации, не выявило существенных межсезонных различий (рис. 8). В осенних образцах илов активность денитрификации была ниже предела чувствительности прибора. Отсутствие денитрифицирующей активности микроорганизмов в илах источника Горячинск, объясняется низкой нитрифицирующей активностью и, как следствие, низким содержанием нитратов. Незначительное увеличение скорости денитрификации в весенних образцах илов коррелирует с численностью денитрификаторов. Денитрифицирующей активности бактерий в весенний период способствуют более благоприятные физико-химические условия источника, в частности, увеличение нитратов почти в 2 раза и снижение содержания растворенного кислорода в воде.

Потенциальная активность процессов азотфиксации и денитрификации в образцах ила после обогащения глюкозой увеличилась в 3-20 раз. В этих условиях наибольшая активность азотфиксации (0,23 мкг N2 /г ч) и денитрификации (0,39 мкг N2O/г ч) была зафиксирована при температуре 51,5 оС и значении рН 9,0 (ст. Г1), хотя актуальная азотфиксирующая активность бактерий в илах на станции Г 1 была низкой. Вероятно, это связано с активной нитрогеназной деятельностью цианобактерий (Anabaena. variabilis, Calotrix termalis, Gloeocapsa punctata, Gl. minuta), обнаруженных на той же станции, и подавление ими бактериальной азотфиксирующей активности.

На станции Г 3 выявлена низкая активность процессов цикла азота. Это связано с токсичным воздействием сероводорода (1,33 мг/мл) и, как следствие, ингибированием процессов.

Таким образом, в щелочной гидротерме Горячинск нитрогеназная активность может проявляться в широком диапазоне температур от 22 до 510С и значениях рН от 7,6 до 9,0. Основными факторами, определяющими интенсивность биологических процессов круговорота азота в исследуемой гидротерме, являются: наличие органического вещества, минеральных форм азота, концентрация сероводорода и кислородный режим.

^ 5. Внеклеточная протеолитическая активность в нативных образцах термальных источников Прибайкалья

Образцы микробных матов, растительных остатков и илов были отобраны из точек отбора в гидротермах, которые характеризовались различными значениями температур 18,7 – 69,0оС (табл. 1).

Таблица 1

Типы проб, места отбора и температура

Источник

№

Точки отбора и температура отбора ( оС)

1

2

3

4

5

6

Гор-к

1

м.м. - 49,0

ил - 49,0

ил - 45,0

ил - 22,7

ил - 25,0

ил - 18,7

Котель-й

2

м.м. - 65,3

м.м. - 48,0

ил - 48,0

ил - 45,5

ил - 39,0

ил - 32,0

Змеиный

4

м.м.- 45,5

ил - 45,5

-

-

-

-

Хакусы

5

м.м. - 46,0

ил - 46,0

-

-

-

-

Гарга

6

м.м. - 66,4

р.о. - 57,4

ил - 49,8

ил - 42,0

м.м.- 42,0

ил - 33,5

Сея

7

ил - 49,8

м.м. - 46,5

ил - 46,5

м.м. - 34,0

ил - 31,4

ил - 31,0

Уро

8

м.м. - 69,0

ил - 64,0

м.м. - 52,1

м.м. - 44,2

ил - 44,2

ил - 33,8

Алла

9

м.м. - 65,2

ил - 60,0

ил - 49,0

ил - 49,0

ил - 24,0

ил - 23,5

Кучигер

10

ил - 47,2

м.м. - 45,9

р.о.- 43,0

м.м. - 41,0

ил - 41,0




Умхей

11

р.о.- 47,6

р.о.- 45,7

м.м. - 41,7

ил - 41,7

ил - 39,0




Гор-к .- Горячинск, Котель-й – Котельниковский.

м.м. – микробный мат; р.о. – растительные остатки; «-» - пробы не отобраны

Скорость бактериального разложения белоксодержащих соединений в исследуемых источниках составила от 1,25 до 2,43%, максимальные скорости деструкции отмечены в источниках Кучигер (2,43%) и Умхей (2,14%).


^ Рис.10. Протеолитическая активность

по КААЛП

Максимальная внеклеточная протеолитическая активность по субстрату БАПА (рис. 9) зафиксирована в илах источника Котельниковский (1,65 - 2,29 ед.) и циано-бактериальных матах источника Гарга (1,93 - 2,27 ед.). Для источника Алла характерно увеличение продукции трипсиноподобных протеаз при повышении температуры. Максимальная а
^ Рис.9. Протеолитическая активность по БАПА.
ктивность (1,43 ед.) отмечена при температуре 65,2оС. В образцах источников Змеиный, Хакусы, Кучигер и Умхей значения протеазной активности по БАПА составили от 0,48 до 1,07 ед. Образцы источников Сея, Горячинск, Уро характеризовались низкими значениями активности. Исключение составляли микробные маты, где активность была в 6-7 раз выше, чем в илах. Относительно постоянные физико-химические условия, качественный и количественный состав органических веществ в циано-бактериальных матах способствует активному развитию в них различных бактерий - деструкторов.

М
^ Рис.11. Протеолитическая активность по ГААЛП
аксимальные значения протеазной активности по су