Реферат: На правах рукописи



На правах рукописи


ДМИТРИЕВА-ЗДОРОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА


ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ


03.01.03 – молекулярная биология


АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук


Москва – 2010


Работа выполнена в лаборатории химической геномики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН).

^ Научный руководитель:
кандидат биологических наук,

ст.н.с. ИБМХ РАМН
^ Воронько Ольга Евгеньевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. СЫСИНА

РАМН




^ Журков Вячеслав Серафимович

кандидат биологических наук,

вед.н.с. ФГУП «ГосНИИ генетика»

Серегин Юрий Александрович

^ Ведущая организация:



ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва










Защита диссертации состоится «___» марта 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».


Реферат разослан «___» февраля 2010 г.


Учёный секретарь

Диссертационного совета,

кандидат химических наук


Т.Л. Воюшина

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы. Одной из наиболее сложных задач современной генетики является изучение молекулярно-генетических основ многофакторных заболеваний. Важное место среди многофакторных заболеваний бронхолегочной системы человека занимает бронхиальная астма (БА). В некоторых странах БА является главной причиной инвалидности и смертности населения, опережая даже сердечно-сосудистые и онкологические патологии, что характеризует БА как глобальную медико-социальную проблему (Jarvis et al, 1997).

Эпидемиологические исследования последних лет говорят о том, что 4-8% населения страдают БА, в том числе 5-10% детской популяции и 5% взрослой (Чучалин, Баранов, 2006). В России данным заболеванием страдает примерно 10% взрослого и 15% детского населения. В последние десятилетия прогрессивно увеличивается заболеваемость и смертность от БА.

В основе развития БА лежит взаимодействие различных генетических факторов с факторами внешней среды (Cookson WO, 2002; Vercelli D, 2003). Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов развития БА связан с выделением группы генов, продукты которых прямо или косвенно могут быть вовлечены в развитие данной патологии, так называемых генов-кандидатов (Федосеев, 1998). В настоящее время известно более 100 генов-кандидатов БА (Scirica, 2007; Фрейдин, 2002). Гены предрасположенности к БА условно можно разделить на 5 групп: 1) гены врожденного иммунитета и гены иммунорегуляции; 2) гены, связанные с дифференцировкой клеток Th2 и эффекторными функциями иммунной системы; 3) гены, экспрессирующиеся в клетках эпителия бронхов; 4) гены, ассоциированные с перестройкой (ремоделингом) дыхательных путей и тяжестью заболевания; 5) гены предрасположенности к БА, открытые позиционным клонированием (Vercelli D, 2008).

Изучение ассоциации генов-кандидатов с заболеванием проводят с помощью полиморфных маркеров, которые могут располагаться внутри гена или рядом с ним. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов основано на выявлении и сравнении частот встречаемости генотипов и аллелей в группах с наличием и отсутствием заболевания. Если различия в частотах аллелей и генотипов являются статистически достоверными, считают, что данный маркер ассоциирован с развитием заболевания. Установленные предрасполагающие или предохраняющие генетические маркеры в дальнейшем могут быть использованы для прогнозирования заболевания у человека на основе исследования индивидуальных особенностей его генома. Поэтому анализ ассоциации полиморфных маркеров с атопической БА является актуальной задачей современной молекулярной генетики.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – оценить уровень ассоциации двенадцати полиморфных маркеров восьми генов-кандидатов БА: интерлейкина-13 (IL13), интерлейкина-5 (IL5), альфа-цепи рецептора интерлейкина-8 (IL8RA), toll-подобного рецептора 4 (TLR4), антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4), G-белка, ассоциированного с астмой (GPRA), эотаксина-3 (CCL26) и регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (CCL5) с атопической БА.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Сформировать группы больных БА различной степени тяжести, а также группу здорового контроля русского происхождения.

Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13, С(–703)Т гена IL5, M31R и R335C гена IL8RA, Asp299Gly гена TLR4, C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) гена GPRA, T(+2497)G гена CCL26, A(–403)G гена CCL5 в группе больных атопической бронхиальной астмой и в группе здоровых индивидов.

Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов выбранных полиморфных маркеров в группах больных и здоровых индивидов для выявления их ассоциации с развитием БА и тяжестью течения БА.

Провести анализ ассоциации гаплотипов генов IL13, IL8RA, CTLA4, GPRA с БА и тяжестью течения БА.

Научная новизна работы. В данной работе впервые изучена ассоциация полиморфных маркеров генов IL13, IL5, IL8RA, TLR4, CTLA4, GPRA, CCL26, CCL5 с атопической БА и тяжестью ее течения среди русского населения г. Москвы.

Вышеизложенные результаты были получены впервые.

Практическая ценность работы. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов атопической БА могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления пациентов с повышенным риском развития заболевания, проведения донозологической профилактики и прогнозирования течения болезни.

Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.), на II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009 г.), на конференции «The 6th Annual Cytokines & Inflammation Conference» (Орландо, 2008 г.), на 4-й интернациональной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine» (Москва, 2008 г.), на конгрессе «The World Asthma Meeting (WAM’2007)» (Стамбул, 2007 г.) и на ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Стокгольм, 2007 г.; Берлин, 2008 г.; Вена, 2009 г.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании межлабораторного семинара ИБМХ РАМН от 17 ноября 2009 г. и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» от 9 декабря 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 2 статьи и материалы международных конференций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на ___ страницах машинописного текста и содержат __ таблиц и __ рисунков.


^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Материалы и методы.

В исследовании были использованы образцы ДНК 283 больных атопической БА и 227 здоровых индивидов русского происхождения. Общая характеристика групп представлена в таблице 1. Образцы ДНК и клинические данные больных атопической БА были предоставлены лабораторией аллергодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. В контрольную группу были включены здоровые индивиды без клинически диагностированной БА, аллергических и бронхолегочных заболеваний. Образцы ДНК здоровых людей были предоставлены лабораторией молекулярно-генетической диагностики НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН. Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве. Для выявления ассоциации генетических маркеров с тяжестью течения заболевания больные атопической БА были разделены на две подгруппы согласно критериям GINA: больные с астмой легкой степени тяжести (n=139) и больные со средним и тяжелым течением заболевания (n=152) (Табл. 1).

Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас хромосомных областей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov), с использованием следующих разделов: MapView (расположение полиморфных маркеров на хромосоме), dbSNP (информация об однонуклеотидных полиморфных маркерах). Для подбора праймеров и специфических зондов использовали программу Primer Premier 5.0.

Идентификация генотипов полиморфных маркеров проводилась c использованием времяпролетной масс-спектрометрии с лазерно-десорбционной ионизацией образца в матрице (MALDI-TOF). Метод состоит из следующих стадий:

1) пробоподготовка, включающая в себя амплификацию участка ДНК, содержащего исследуемую нуклеотидную замену, и последующую реакцию удлинения праймера (минисиквенс); 2) разделение фрагментов ДНК (праймеров с присоединенным на 3’-конце нуклеотидом, соответствующим аллелю искомого полиморфного маркера) по массе с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

^ Таблица 1.

Общая характеристика обследованных групп с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.




«БА+» (n=283)

«БА–» (n=227)

БА легкой степени тяжести (n=131)

БА средней и тяжелой степени тяжести (n=152)

Пол, м/ж

71/60

65/87

103/124

Возраст, лет

34,4 ± 13,4

41,8 ± 16,2

38,5 ± 10,4

Длительность заболевания, лет

11,9 ± 8,6

13,1 ± 8,4

-

Возраст начала заболевания, лет

15,4  7,6

-

Общий IgE, кЕ/л

230 (65; 620)

45 (23; 89)

Данные по возрасту и длительности БА представлены в формате M ± SD, где M – среднее, SD – стандартное отклонение. Данные по концентрации IgE – в формате Me (25%; 75%), где Me – медиана, 25-75% – интерквартильный интервал.


Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием БА, а также в группах больных различной степени тяжести БА, нами использовался точный двусторонний критерий Фишера. Достоверными считали различия при p<0,05. Распределения аллелей и генотипов всех маркеров проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга. Относительный риск развития заболевания оценивали с помощью показателя соотношения шансов (odds ratio, OR). Значение ОR и 95% доверительный интервал (confidence interval, CI) вычисляли с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (http://www.hutchon.net/ConfidOR.htm). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR>1 – как положительную ассоциацию ("предрасположенность"), OR<1 – как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием.

Анализ гаплотипов проводился с использованием программы Hapstat 3.0 (University of North Carolina, USA).


Результаты и обсуждение.

Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13 с атопической БА.

Интерлейкин-13 (ИЛ-13) является одним из основных по значимости цитокинов в патогенезе атопической БА. ИЛ-13 – мощный индуктор эозинофильного, макрофагального и лимфоцитарного ответа, связанного с развитием фиброза дыхательных путей, активацией слизепродуцирующих клеток и повышенной бронхореактивностью (Zhu et al, 1999). Воспалительный ответ реализуется через способность ИЛ-13 стимулировать выработку хемокинов и протеолитических ферментов, таких как металлопротеиназы матрикса. Установлено также, что развитие фиброзных изменений в ткани бронхов – результат активации интерлейкином-13 фиброгенного цитокина TGF-β1 через MMP-9 и плазмин-зависимый путь (Lee et al, 2001). Таким образом, ИЛ-13 является конечной точкой приложения Тh2-опосредованных воспалительных эффектов.

Ген IL13 локализован на хромосоме 5q31.1. Последовательность гена содержит ряд однонуклеотидных замен (Рис. 1), часть из которых ассоциирована с развитием БА и атопией. Наибольшее внимание исследователей в настоящее время привлекают два маркера в данном гене: C(–1055)T в промоторной области гена и R130Q в кодирующей области.

Полиморфный маркер C(–1055)T гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –1055 промоторной области гена (Рис. 1). Функциональное действие данного маркера может быть объяснено тем, что замена расположена непосредственно перед сайтом связывания Т-клеточного транскрипционного фактора NFAT, который регулирует экспрессию генов IL13 и IL4. Ранее было показано, что наличие тимина в положении –1055 приводит к более активному связыванию NFAT с промотором и, таким образом, данный маркер может влиять на экспрессию гена IL13 (van der Pouw Kraan et al, 1999).

Полиморфный маркер R130Q гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену G → A в положении +2043 в экзоне 4, приводящую к аминокислотной замене положительно заряженного аргинина на нейтральный глутамин в положении 130 α-спирали D-домена интерлейкина-13. Это участок, посредством которого происходит взаимодействие ИЛ-13 с рецептором. В последних исследованиях было показано, что замена аргинина на глутамин в положении +2043 не изменяет константу связывания ИЛ-13 с рецептором и не влияет на стабильность этого комплекса. В то же время, данная замена сопровождается повышенным уровнем экспрессии ИЛ-13 (Arima et al, 2002).




^ Рис. 1. Полиморфные маркеры гена IL13.

При исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C(–1055)T в группе больных атопической БА и группе здорового контроля отмечено преобладание аллеля С и генотипа СС (Табл. 2). Минорный аллель Т встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой – 27-28%, что согласуется с частотами данного аллеля в европейских популяциях – 20-33% (Дания, Нидерланды, Германия) (Graves et al, 2000). В группе больных БА наблюдалось увеличение частоты аллеля С и генотипа СС с одновременным снижением доли аллеля Т и генотипов СT и TT по сравнению с контрольной группой. Такие различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

^ Таблица 2.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.


Аллели и генотипы

Частота аллелей

и генотипов

p

«БА+»

«БА–»

C(–1055)T

Аллель С

0,731

0,722

> 0,05

Аллель Т

0,269

0,278

Генотип СС

0,526

0,515

> 0,05

Генотип СT

0,410

0,414

> 0,05

Генотип TT

0,064

0,071

> 0,05

R130Q

Аллель Arg

0,714

0,738

> 0,05

Аллель Gln

0,286

0,262

Генотип Arg/Arg

0,509

0,551

> 0,05

Генотип Arg/Gln

0,410

0,374

> 0,05

Генотип Gln/Gln

0,081

0,075

> 0,05
В распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера ^ R130Q в обеих группах наблюдалось преобладание содержания аллеля Arg и генотипа Arg/Arg (Табл. 2). Гомозиготный генотип Gln/Gln встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой (7-8%). Также было отмечено увеличение доли аллеля Gln и генотипа Arg/Gln и снижение частоты аллеля Arg и генотипа Arg/Arg в группе больных БА. Однако статистически достоверных различий не обнаружено, что говорит об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.


^ Таблица 3.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера C(–1055)T гена IL13 у больных с атопической БА разной степени тяжести.


Аллели и генотипы

Частота аллелей и генотипов

p

OR и 95% CI

БА легкой степени тяжести

БА средней и

тяжелой степени тяжести

Аллель С

0,763

0,704

> 0,05

-

Аллель Т

0,237

0,296

Генотип СС

0,611

0,461

0,025

0,54 [0,34–0,87]

Генотип СT

0,305

0,487

0,001

2,16 [1,44–3,98]

Генотип TT

0,084

0,052

> 0,05

-
1>В результате сравнения частот аллелей и генотипов маркера C(–1055)T в группах, разделенных по степени тяжести БА, была выявлена выраженная ассоциация маркера C(–1055)T с тяжестью БА, что отразилось в снижении частоты встречаемости генотипа СС в группе больных со средней и тяжелой степенью астмы, с одновременным увеличением встречаемости генотипа СT в этой группе. Данные различия являются статистически достоверными, при этом носительство генотипа СТ связано с более тяжелым течением атопической БА (OR=2,16, 95% CI [1,44–3,98]), а генотип СС, напротив, связан с легким течением астмы (OR=0,54, 95% CI [0,34–0,87]) у русских пациентов г. Москвы (Табл. 3).

Для полиморфного маркера R130Q гена IL13 ассоциации с тяжестью течения заболевания установлено не было.

Для того чтобы оценить комбинированный вклад маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13 в патогенез БА, мы провели сравнительный анализ частот встречаемости гаплотипов в группе больных атопической БА и группе здорового контроля. Данный анализ не выявил достоверных различий в частотах встречаемости гаплотипов между группами. Также не было обнаружено ассоциации гаплотипов с тяжестью течения БА.

Наши результаты для маркера C(–1055)T гена IL13 отличаются от большинства исследований, проведенных на европейских популяциях, в которых была обнаружена достоверная ассоциация полиморфного маркера C(–1055)T с развитием БА (van der Pouw Kraan et al, 1999; Howard, 2001). Ассоциация генотипа ТТ с заболеванием также была подтверждена в США на выборке афроамериканцев (Moissidis et al, 2005). Однако нами была установлена ассоциация маркера C(–1055)T с тяжестью течения БА, что согласуется с важной ролью интерлейкина-13 в прогрессии аллергического воспаления и развитии фиброза бронхов.

Литературные данные по ассоциации маркера R130Q с развитием БА противоречивы. Так, в нескольких работах демонстрируется связь данного маркера с БА и уровнем общего IgE (Heinzmann et al, 2000 и 2003). Однако другие исследователи не выявили никакой ассоциации данного маркера с развитием БА (Leung et al, 2001, Hummelshoj et al, 2003). Полученные нами данные также не демонстрируют ассоциации между маркером R130Q и развитием атопической БА. Подобная противоречивость результатов может быть объяснена влиянием различных популяционных факторов на частоты аллелей и генотипов данного маркера, а также разными критериями включения/исключения индивидов в выборки.

Отсутствие ассоциации маркера R130Q с развитием заболевания и его прогрессией объясняется, по-видимому, тем, что ИЛ-13 реализует свои эффекторные функции через взаимодействие со специфическим рецептором, а данная замена никак не влияет на кинетику связывания белка с рецептором и стабильность комплекса лиганд-рецептор.


^ Исследование ассоциации полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 с атопической БА.

Интерлейкин-5 (ИЛ-5) является мощным активатором эозинофилов, которые в свою очередь, провоцируют развитие воспаления, приводящего к обструкции и гиперреактивности дыхательных путей. ИЛ-5 – один из основных факторов, контролирующих созревание и функциональную активность эозинофилов (Campbell et al, 1987; Lopez et al, 1988). Также ИЛ-5 играет важную роль в дифференцировке В-лимфоцитов, активированных специфическим антигеном или митогеном (Takatsu et al, 1988) и усиливает продукцию иммуноглобулинов этими клетками (Takatsu et al, 1988; Feghali, Wright, 1997).

Ген IL5 локализован на хромосоме 5q31.1 (Sutherland et al, 1988) в кластере 5q31-33 с другими генами интерлейкинов (Boulay et al, 1992). Обнаружено сцепление локуса 5q31.1 с атопической БА (Marsh et al, 1994), уровнем циркулирующих эозинофилов (Martinez et al, 1998) и аутосомно-доминантной семейной эозинофилией (Rioux et al, 1998). Исследованный в данной работе полиморфный участок С(–703)Т представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –703 в промоторной области гена IL5.

Рис. 2. Пример спектра MALDI-TOF, по которому проводилась идентификация аллелей и генотипов маркера С(–703)Т гена IL5 (на спектре представлен гетерозиготный генотип СT). Первый пик соответствует интактному праймеру с массой 2482 Да, второй пик и третий пик – праймерам, удлиненным с 3’-конца на ddA и ddG, соответственно.

^ Таблица 5.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.


Аллели и генотипы

Частота аллелей и генотипов


p

«БА+»

«БА–»

Аллель С

0,731

0,694

> 0,05

Аллель Т

0,269

0,306

Генотип СС

0,528

0,485
> 0,05
Генотип СT

0,406

0,418

> 0,05

Генотип TT

0,066

0,097

> 0,05
В распределении генотипов в группе больных БА наблюдалось возрастание доли генотипа ^ CC (0,528 против 0,485 в контрольной группе) и уменьшение содержания генотипа CT (0,406 против 0,418 в контрольной группе) (Табл. 5). Генотип TT встречался очень редко как в группе больных, так и в группе здоровых индивидов. Частота аллеля Т в обеих группах составляет 27-30%, что согласуется с частотой данного аллеля в немецкой популяции – 29% (Kabesch et al, 2007). В распределении аллелей в группе больных БА наблюдалось возрастание доли аллеля C (0,731 против 0,694 в контрольной группе), при уменьшении содержания аллеля T (0,269 против 0,306 в контрольной группе). В обеих группах наиболее часто встречался аллель C (0,731 и 0,694 в группах «БА+» и «БА–», соответственно). Различия в частотах генотипов и аллелей между группами являются статистически недостоверными. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 с развитием атопической БА.

Также не было выявлено никакой ассоциации данного маркера с тяжестью течения БА.

Известно очень небольшое количество работ, связанных с поиском ассоциации полиморфного маркера С(–703)Т гена IL5 с БА. С помощью анализа сцепления на русских семьях из г. Томск была выявлена ассоциация аллеля C с БА, повышенной бронхореактивностью и атопией по данным кожных аллергопроб (Фрейдин и др., 2000 и 2002). В данной работе исследовалось наследование аллелей у больных БА, но не было проведено сравнительного анализа со здоровым контролем. Также известны две публикации, сфокусированные на роли маркера С(–703)Т гена IL5 в развитии и течении БА у детей. В одной работе показана ассоциация маркера С(–703)Т со снижением спирометрических показателей тяжести БА у корейских детей, однако ассоциации с БА получено не было (Hong et al, 2005). В другой работе был установлен пониженный риск развития атопической БА у носителей аллеля T, а также данный аллель проявляет защитный эффект по отношению к атопии (Kabesch et al, 2007). В нашей работе распределение аллелей тоже показало возрастание доли аллеля C и уменьшение доли минорного аллеля T у больных БА по сравнению со здоровым контролем, однако статистически достоверных различий получено не было.

Функциональная роль полиморфного маркера С(–703)Т на данный момент не известна, однако предполагают, что данная замена в промоторе гена может приводить к изменению экспрессии IL5 и опосредованно влиять на специфические процессы, имеющие место при БА, например, на рекрутинг эозинофилов. При этом сама по себе замена может не оказывать влияние на предрасположенность к развитию БА, что и нашло отражение в полученных нами результатах.


^ Исследование ассоциации полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA с атопической БА.

Интерлейкин-8 (ИЛ-8) вовлечен в процесс стимуляции, развития и поддержания острого воспалительного процесса (Harada et al, 1994). Важная роль ИЛ-8 в патофизиологии бронхиальной астмы человека была подтверждена во многих исследованиях (Remick et al, 2005; Heinzmann et al, 2004; Nocker et al, 1996). Взаимодействуя со своим рецептором IL8RA (CXCR1), ИЛ-8 приводит к активации и направленной миграции в очаг воспаления лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, представляющих первую линию неспецифической защиты организма (Kunkel et al, 1991; Sarmiento et al, 2009). Рецептор IL8RA играет критическую роль в трансдукции сигнала ИЛ-8 в нейтрофилах (Рис. 3), поэтому интересной задачей является изучение вклада гена IL8RA в развитие БА.

Рис. 3. Взаимодействие ИЛ-8 со своими рецепторами на нейтрофилах.

Ген IL8RA локализован на хромосоме 2q35. Установлено, что данный хромосомный регион связан с повышенным уровнем общего IgE у больных БА (Xu et al, 2000). В этом гене обнаружен ряд полиморфных участков, в том числе маркер M31R гена IL8RA, представляющий собой однонуклеотидную замену G → T в положении +92 в экзоне 2, приводящую к аминокислотной замене аргинина на метионин в положении 31 полипептидной цепи внеклеточного N-домена рецептора. Другой полиморфный маркер гена IL8RA – R335C, представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении +1003 в экзоне 2, приводящую к аминокислотной замене аргинина на цистеин в положении 335 полипептидной цепи внутриклеточного C-домена рецептора.


^ Таблица 6.

Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.


Аллели и генотипы

Частота аллелей и генотипов

p

OR и 95% CI

«БА+»

«БА–»

M31R

Аллель Met

0,968

0,992

0,043

0,23 [0,08–0,67]

Аллель Arg

0,032

0,008

4,39 [1,48–13]

Генотип Met/Met

0,936

0,985

0,004

0,22 [0,07–0,66]

Генотип Met/Arg

0,064

0,015

0,004

4,51 [1,51–13,43]

R335C

Аллель Arg

0,970

0,978

> 0,05

-

Аллель Cys

0,030

0,022

Генотип

Arg/Arg

0,940

0,955

> 0,05

-

Генотип

Arg/Cys

0,060

0,045

> 0,05

-
Для полиморфного маркера ^ M31R в обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Met и генотипа Met/Met (Табл.6). Гомозиготный генотип Arg/Arg не был обнаружен ни в контрольной группе, ни в группе больных. При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного маркера в группах отмечено увеличение частоты встречаемости минорного аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg в группе больных. Полученные различия носят статистически достоверный характер и свидетельствуют об ассоциации маркера M31R с развитием атопической БА у русских жителей г. Москвы. При этом носительство аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg связано с увеличением риска развития патологии более чем в 4 раза (OR=4,39, 95% CI [1,48–13] и OR=4,51, 95% CI [1,51–13,43], соответственно). Наличие аллеля Met и генотипа Met/Met в геноме, напротив, связано с пониженным риском развития заболевания (OR=0,23, 95% CI [0,08–0,67] и OR=0,22, 95% CI [0,07–0,66], соответственно).

В распределении частот аллелей и генотипов маркера ^ R335C в обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Arg и генотипа Arg/Arg (Табл. 6). Гомозиготный генотип Cys/Cys не был обнаружен ни в группе больных, ни в контрольной группе. Минорный аллель Cys встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой 2-3%. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов маркера R335C не выявил статистически достоверных различий между группами, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием БА.

В результате сравнения частот генотипов и аллелей полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA в группах больных БА различной степени тяжести обнаружено, что данные маркеры не ассоциированы с тяжестью течения БА.

Анализ встречаемости гаплотипов по маркерам M31R и R335C не показал достоверных различий в их частотах между группами с наличием и отсутствием БА. Также не было получено ассоциации гаплотипов с тяжестью течения атопической БА.

На данный момент известно всего две работы, в которых проводилось изучение ассоциации полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA с развитием БА. В одной публикации немецкими учеными было показано, что носительство аллеля Arg маркера M31R и аллеля Cys маркера R335C является фактором риска развития БА (Stemmler et al, 2005). В другом же исследовании не было установлено ассоциации данных маркеров с БА (Puthothu et al, 2006).

Показанная в нашей работе ассоциация маркера M31R гена IL8RA с атопической БА согласуется с результатом немецкой группы исследователей (Stemmler et al, 2005). Данный полиморфный маркер приводит к замене метионина на аргинин во внеклеточном домене рецептора, поэтому такая замена может влиять на связывание белка с IL8RA и стабильность комплекса лиганд-рецептор. Поскольку при взаимодействии ИЛ-8 с нейтрофилами посредством IL8RA происходит активация нейтрофилов и их направленная миграция в очаг воспаления, а также дополнительная выработка нейтрофилами ИЛ-8, возможно, данная замена в IL8RA увеличивает сродство рецептора к ИЛ-8 и приводит к последующей сверхэкспрессии ИЛ-8 нейтрофилами. В результате развивается воспалительный процесс, а в дальнейшем – хроническое воспаление дыхательных путей.

Отсутствие ассоциации маркера R335C гена IL8RA с развитием БА было также ранее показано немецкими учеными (Puthothu et al, 2006). Поэтому можно предположить, что замена аргинина на цистеин во внутриклеточном домене IL8RA не влияет на передачу сигнала внутри клетки.



^ Исследование ассоциации полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с атопической БА.

В последнее время большой интерес вызывает гипотеза, согласно которой, длительный контакт с микробным антигеном или перенесенные в раннем возрасте инфекции играют защитную роль в предрасположенности к Th2-опосредованным атопическим заболеваниям. Данные факты можно объяснить дисбалансом в образовании клеток Th1 и Th2 из наивных T-хелперов с последующим смещением равновесия в сторону Th2-опосредованного иммунного ответа и развитием аллергических заболеваний. Следовательно, мутации в генах, продукты которых вовлечены в распознавание микробных антигенов, могут вносить серьезный вклад в предрасположенность к развитию аллергических заболеваний и БА (Yamada et al, 2005).

Toll-подобный рецептор 4 (TLR-4) представляет собой рецептор, который связан с внеклеточным распознаванием липополисахарида (ЛПС) бактерий (Рис. 4).

Рис. 4. Клеточный рецепторный комплекс для ЛПС бактерий, основным компонентом которого является Toll-подобный рецептор 4.

Ген TLR4 расположен на хромосоме 9q32-33. Полиморфный маркер Asp299Gly гена TLR4 представляет собой однонуклеотидную замену А → G в положении +896 в экзоне 3, приводящую к аминокислотной замене аспарагиновой кислоты на глицин в положении 299 полипептидной цепи во внеклеточном домене рецептора (Liang et al, 2005). Посредством данного домена происходит прямое взаимодействие рецептора с лигандами микроорганизмов. Было обнаружено, что маркер Asp299Gly гена TLR4 ассоциирован со снижением иммунного ответа на ЛПС бактерий, в результате уменьшения клеточной экспрессии TLR4 с последующим прекращением взаимодействия TLR-4 с ЛПС (Arbour et al, 2000). В другом исследовании было показано, что данный полиморфный маркер является ответственным за подавление передачи сигнала рецептором и уменьшение воспалительной реакции на грамм-отрицательные бактерии (Kiechl S et al, 2002).

В нашей работе было отмечено преобладание в обеих группах содержания аллеля ^ Asp и генотипа Asp/Asp полиморфного маркера Asp299Gly (Табл. 8). Частоты минорного аллеля Gly и гомозиготного генотипа Gly/Gly в контрольной группе практически не отличались от таковых в группе больных. При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного маркера между группами не было выявлено статистически достоверных различий, что свидетельствует об отсутствии прямой ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.


^ Таблица 8.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.

Аллели и генотипы

Частота аллелей и генотипов


p

«БА+»

«БА–»

Аллель Asp

0,919

0,940

> 0,05

Аллель Gly

0,081

0,060

Генотип Asp/Asp

0,865

0,881
> 0,05
Генотип Asp/Gly

0,109

0,119

> 0,05

Генотип Gly/Gly

0,026

0

> 0,05


После сравнения частот аллелей и генотипов маркера Asp299Gly гена TLR4 в группах, разделенных по степени тяжести БА, была обнаружена выраженная ассоциация данного маркера с тяжестью течения БА у русских индивидов г. Москвы. Снижение частоты встречаемости аллеля Asp и генотипа Asp/Asp было отмечено в группе больных со средней и тяжелой степенью астмы, а аллеля Gly и генотипов Asp/Gly и Gly/Gly – в группе больных с легким течением БА. Различия в частотах аллелей являлись статистически достоверными, носительство минорного аллеля Gly связано с более тяжелым течением атопической БА (OR=2,12, 95% CI [1,08–4,18]), а аллеля Asp – с легким течением астмы (OR=0,47, 95% CI [0,24–0,93]) (Табл. 9).


^ Таблица 9.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 у больных с атопической БА разной степени тяжести.

Аллели и генотипы

Частота аллелей и генотипов

p

OR и 95% CI

БА легкой степени тяжести

БА средней и

тяжелой степени тяжести

Аллель Asp

0,948

0,895

0,035

0,47 [0,24–0,93]

Аллель Gly

0,052

0,105

2,12 [1,08–4,18]

Генотип Asp/Asp

0,903

0,833

> 0,05

-

Генотип Asp/Gly

0,089

0,123

> 0,05

-

Генотип Gly/Gly

0,008

0,044

> 0,05

-


Несмотря на то, что в некоторых работах была установлена ассоциация маркера Asp299Gly с БА (Fageras et al, 2004), в большом количестве исследований было показано отсутствие ассоциации (Raby et al, 2002; Noguchi at Al, 2004; Eder et al, 2005). Таким образом, наши результаты согласуются с данными большинства других исследователей. Только в одной работе исследовалась ассоциация маркера с тяжестью БА, однако ассоциации обнаружено не было, но была показана ассоциация генотипов Asp/Gly и Gly/Gly с тяжестью атопии (Yang et al, 2004).

Выявленная ассоциация полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с тяжестью течения БА подтверждает теорию о том, что при нарушении взаимодействия человека с микробным антигеном усиливается развитие аллергии и БА. Известно, что данный маркер ассоциирован c уменьшением клеточной экспрессии TLR-4 с последующим прекращением взаимодействия TLR-4 с ЛПС. Вероятно, ухудшение взаимодействия TLR-4 с ЛПС в большей степени влияет на прогрессию атопической БА, а не на возникновение данного заболевания.


^ Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4 с атопической БА.

Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33 и кодирует антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами. Это Т-клеточный рецептор, трансмембранный гликопротеин, экспрессирующийся в течение 2-3 дней после активации Т-лимфоцитов. Через CTLA-4 подается сигнал к подавлению активации Тh2 клеток, что приводит к смещению баланса в сторону развития ответа по Th1-зависимому типу (Oosterwegel et al, 1999).



^ Рис. 5. Полиморфные маркеры гена CTLA4.

В данной работе мы исследовали ассоциацию с БА двух полиморфных маркеров гена CTLA4. Полиморфный маркер C(–318)T представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –318 промоторной области гена, другой маркер A(+49)G – однонуклеотидную замену A → G в положении +49 в экзоне 1, приводящую к аминокислотной замене треонина на аланин в положении 17 полипептидной цепи (Рис. 5). В нескольких исследованиях было установлено, что аллель T маркера C(–318)T ассоциирован с повышенной промоторной активностью гена (Wang et al 2002). Показано, что носительство аллеля Т приводит к повышению экспрессии CTLA-4 на поверхности активированных клеток и повышению уровня мРНК CTLA-4 в нестимулированных клетках, что подтверждает потенциальную роль данной замены в регуляции экспрессии гена (Ligers et al, 2001). В других исследованиях было установлено, что CTLA-4 ингибирует образование Th2-клеток из наивных хелперов (Th0), поэтому аллель Т можно рассматривать как защитный фактор против заболеваний с аллергической компонентой. У носителей аллеля Thr полиморфного маркера A(+49)G была обнаружена повышенная экспрессия CTLA-4 на поверхности активированной Т-клетки (Ligers et al, 2001). Также известно, что генотип Ala/Ala ассоциирован с уменьшением экспрессии CTLA-4 на поверхности Т-клеток с последующим ослаблением функции CTLA-4 (Kouki et al, 2000).

При изучении распределения аллелей и генотипов отмечено преобладание содержания аллеля С и генотипа СС полиморфного м
еще рефераты
Еще работы по разное