Реферат: Львівський національний медичний університет імені данила галицького кафедра біологічної хімії методичні вказівки для практичних занять з біологічної хімії (для студентів стоматологічного факультету)

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО


КАФЕДРА БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ


МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

ДЛЯ ПРАКТИЧНИХ ЗАНЯТЬ З БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ


(для студентів стоматологічного факультету)


(частина 2)


МОДУЛЬ № 3. Молекулярна біологія.

Біохімія гормонів І фізіологічних функцій.


Тематичний план практичних занять з модуля 3


№ з/п

Тема

К-кість год



Дослідження біосинтезу та катаболізму пуринових і піримідинових нуклеотидів. Визначення кінцевих продуктів їх обміну.

3



Дослідження реплікації ДНК і транскрипції РНК. Біосинтез білка. Аналіз механізмів мутацій.

3



Дослідження молекулярно-клітинних механізмів дії гормонів білкової природи на клітини-мішені.

3



Молекулярно-клітинні механізми дії стероїдних і тиреоїдних гормонів. Гормональна регуляція гомеостазу кальцію. Стероїдні гормони надниркових і статевих залоз. Біологічно активні ейкозаноїди.

3



Дослідження біохімічного складу та функцій слини.

3



Дослідження процесу перетравлення поживних речовин (білків, вуглеводів, ліпідів) у травному тракті.

3



Дослідження функціональної ролі водорозчинних вітамінів у метаболізмі та реалізації клітинних функцій.

3



Дослідження функціональної ролі жиророзчинних вітамінів у метаболізмі та реалізації клітинних функцій.

3



Дослідження фізіологічних та біохімічних функцій крові. Білки та небілкові азотовмісні компоненти крові.

3



Дослідження згортальної, антизгортальної та фібринолітичної систем крові. Патології гомеостазу. Біохімічні закономірності реалізації імунних процесів. Імунодефіцитні стани.

3



Біохімія печінки. Метаболізм порфіринів. Дослідження процесів біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів.

3



Водно-сольовий обмін в організмі. Дослідження нормальних і патологічних компонентів сечі.

3



Біохімія сполучної тканини. Дослідження метаболізму кісткової тканини.

3



Дослідження біохімічного складу тканин зуба: органічні та мінеральні компоненти. Амелогенез.

3



Біохімія м’язової та нервової тканин. Порушення обміну медіаторів та модуляторів головного мозку при психічних розладах.

3



Підсумковий модульний контроль № 3.

3




^ Разом, годин

48


Завдання для самостійної роботи студентів (СРС)


№

з/п

Тема

К-кість год

1.

Підготовка до практичних занять:




1.1.

Набути практичні навички з молекулярної біології та генетики:







Малювати схеми послідовних етапів процесів реплікації, транскрипції та трансляції.

2




Пояснювати молекулярні механізми регуляції в реалізації генетичної інформації.

2




Оцінювати вроджені вади метаболізму (молекулярні хвороби) як наслідок генетичних пошкоджень та точкових мутацій.

2

1.2.

Набути практичні навички з біохімії харчування:







Пояснити біохімічні механізми травлення білків, вуглеводів, ліпідів за участі ферментів у травному тракті.

2




Пояснювати роль коферментних вітамінів у функціонуванні ферментів.

2




Пояснювати роль жиророзчинних вітамінів у метаболічних процесах і реалізації клітинних функцій.

2




Оцінювати за біохімічними показниками вітамінну забезпеченість організму та прояви гіповітамінозів.

2

1.3.

Набути практичні навички з біохімії та молекулярної біології гормональної регуляції:







Писати структурні формули гормонів – похідних амінокислот і стероїдних гормонів.

2




Пояснювати молекулярно-клітинні механізми дії пептидних, стероїдних, тиреоїдних, амінних гормонів.

2




Оцінювати порушення метаболізму при недостатньому та надлишковому утворенні гормонів.

2




Оцінювати зміни гомеостазу кальцію при гормональному дисбалансі.

2

1.4.

Набути практичні навички з функціональної та клітинної біохімії органів і тканин:







Оцінювати стан системи крові, її біохімічні функції.

2




Пояснювати роль білків та індикаторних ферментів плазми крові в нормі та при патології.

2




Оцінювати показники азотного обміну та зміни вмісту азотовмісних небілкових компонентів крові.

2




Аналізувати та трактувати показники згортання крові та фібринолізу.

2




Оцінювати стан імунної системи організму.

1




Пояснювати біохімічні основи процесів детоксикації ксенобіотиків та ендогенних токсинів.

1




За біохімічними показниками оцінювати детоксикаційну функцію печінки.

1




Оцінювати показники нормальних і патологічних компонентів сечі.

1

2

Індивідуальна СРС за вибором (реферат за темою, вказаною в змістовому модулі) - підготовка огляду наукової літератури.

4

3

Підготовка до підсумкового модульного контролю 3.

4




Разом

42

Оцінку «відмінно» одержує студент, який дав не менше 90 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, без помилок відповів на письмові завдання, виконав практичну роботу і обґрунтував одержані результати, тобто: всебічно і глибоко засвоїв навчально-програмний матеріал; у повному об'ємі володіє теоретичними знаннями та практичними навичками, без помилок вирішує ситуаційні задачі.

Оцінку «добре» одержує студент, який дав не менше 75 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, припустився окремих незначних помилок у відповідях на письмові завдання, виконав практичну роботу, але не повно обґрунтував одержані дані, може вирішувати ситуаційні задачі.

Оцінку «задовільно» одержує студент, який дав не менше 55 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, припустився значних помилок у відповідях на письмові завдання, виконав практичну роботу, з помилками вирішує ситуаційні задачі.

Оцінку «незадовільно» одержує студент, який дав менше 55 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, припустився грубих помилок у відповідях на письмові завдання або взагалі не дав відповідей на них, не виконав практичну роботу та не може правильно інтерпретувати її результати, не вирішує ситуаційні задачі.

При засвоєнні теми за традиційною системою студенту присвоюються бали: «5» - 8 балів; «4» - 6 балів; «3» - 4 бали; «2» - 0 балів.

Максимальна кількість балів за поточну навчальну успішність – 120.

^ Студент допускається до підсумкового модульного контролю за умов виконання навчальної програми та в разі, якщо за поточну навчальну діяльність він набрав не менше 60 балів (4 бали × 15 занять = 60 балів).

^ Підсумковий модульний контроль зараховується студенту, якщо він демонструє володіння практичними навичками та набрав при виконанні теоретичного завдання не менше 50 балів.

Максимальна кількість балів за підсумковий модульний контроль – 80.


^ МОДУЛЬ № 3. Молекулярна біологія.

Біохімія гормонів І фізіологічних функцій.


Змістовий модуль 12. Основи молекулярної біології.


Тема № 1. Катаболізм і біосинтез пуринових і піримідинових нуклеотидів. Визначення кінцевих продуктів їх обміну.

^ Мета заняття. Засвоїти особливості реакцій синтезу та розпаду пуринових і піримідинових нуклеотидів у нормі та за умов природжених ензимопатій цих процесів. Оволодіти методами визначення кількості сечової кислоти у біологічних рідинах та вміти інтерпретувати отримані дані.

^ Актуальність теми. Порушення процесів біосинтезу та катаболізму пуринових і піримідинових азотистих основ і нуклеотидів можуть призводити до розвитку синдрому Леша-Ніхана, подагри, оротацидурії. Знання основних метаболітів та ензимів цих процесів є необхідним для діагностики та контролю за лікуванням.

^ Конкретні завдання.

Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму пуринових нуклеотидів, порушення синтезу сечової кислоти і біохімічні основи розвитку подагри.

Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму піримідинових нуклеотидів.

Кількісно визначити сечову кислоту в біологічних рідинах, вміти інтерпретувати отримані результати.


^ Теоретичні питання

Біосинтез пуринових нуклеотидів: схема реакцій синтезу ІМФ; утворення АМФ і ГМФ. Регуляція біосинтезу пуринових нуклеотидів за принципом негативного зворотного зв’язку (ретроінгібування).

Біосинтез піримідинових нуклеотидів: схема реакцій, регуляція синтезу. оротацидурія.

Біосинтез дезоксирибонуклеотидів. Утворення тимідилових нуклеотидів; інгібітори біосинтезу дТМФ як протипухлинні засоби.

Катаболізм пуринових нуклеотидів.

Спадкові порушення обміну сечової кислоти. Клініко-біохімічна характеристика гіперурикемії, подагри, синдрому Леша-Ніхана.

Схема катаболізму піримідинових нуклеотидів.
^ Практична робота
Дослід 1. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові.

Принцип методу. Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти у сироватці крові.

^ Матеріальне забезпечення: сироватка або плазма крові, 10 % розчин натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату, 10 % розчин натрію карбонату, 0,35 М розчин сульфатної кислоти, фосфатвольфраматний реактив (реактив Фоліна), 30 мкМ розчин сечової кислоти, піпетки, пробірки, центрифуга.

^ Хід роботи: У центрифужну пробірку вміщують 0,5 мл сироватки крові та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірки перемішують і додають 0,25 мл 0,35 М розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл 10 % розчину натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату. Вміст пробірки перемішують і через 5 хв центрифугують впродовж 10 хв зі швидкістю 3 000 об/хв. Відбирають надосадову рідину. Беруть три пробірки і вносять у них реактиви згідно таблиці:

Реактиви

Контрольна проба, мл

Стандартна проба, мл

Дослідна проба, мл

Надосадова рідина

-

-

2

Стандартний розчин сечової кислоти

-

2

-

Вода дистильована

2

-

-

Розчин натрію карбонату

1

1

1

Фосфатвольфраматний реактив

0,5

0,5

0,5



Вміст пробірок перемішують. Через 30 хв визначають оптичну густину стандартної та дослідних проб за довжини хвилі 640 нм (590 – 700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі завтовшки 10 мм. Блакитне забарвлення залишається стабільним впродовж 30 хв.

Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:



де: С – вміст сечової кислоти в дослідній пробі, мкмоль/л;

Адосл – оптична густина дослідної проби;

Аконт – оптична густина контрольної проби;

30 – вміст сечової кислоти у стандартному розчині, мкмоль/л;

10 – величина розведення сироватки.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.
^ Дослід 2. Кількісне визначення сечової кислоти в сечі.
Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфатвольфраматний реактив до фосфатвольфраматного синього, інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту сечової кислоти. Кількість фосфатвольфраматного синього визначають шляхом титрування червоною кров’яною сіллю. Остання окиснює фосфатвольфраматний синій і синє забарвлення зникає.

^ Матеріальне забезпечення: сеча, фосфатвольфраматний реактив Фоліна, 20 % розчин натрію карбонату Na2CO3, 0,01н розчин калію фериціаніду K3[Fe(CN)6] (червона кров’яна сіль), стандартний розчин сечової кислоти (0,5 мг в 1 мл), мікробюретки, колбочки для титрування, піпетки, пробірки.

^ Хід роботи. Паралельно до 1,5 мл сечі та 1,5 мл стандартного розчину сечової кислоти додають по 1 мл 20 % розчину натрію карбонату і по 1 мл фосфатвольфраматного реактиву Фолінa, змішують і титрують 0,01 н розчином калію фериціаніду до зникнення синього забарвлення.

Вміст сечової кислоти в добовій сечі (у міліграмах) вираховують за формулою:



де: 0,75 – кількість сечової кислоти у стандартній пробі, мг;

B – кількість калію фериціаніду, що пішла на титрування дослідної проби сечі, мл;

C – кількість калію фериціаніду, що пішла на титрування стандартної проби сечової кислоти, мл;

D – добовий діурез (1 500 мл).

Коефіцієнт перерахунку в одиниці СІ (ммоль/добу) дорівнює 0,0059.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

^ Клініко-діагностичне значення. Утворена в результаті розпаду пуринових основ сечова кислота виділяється нирками. У нормі в людини з сечею виділяється 1,60 – 3,54 ммоль/добу (270 – 600 мг/добу) сечової кислоти. Нормальний вміст сечової кислоти в сироватці крові становить для чоловіків – 240 – 530 мкмоль/л (0,05 – 0,06 г/л), для жінок приблизно на 25 % менше – 185 – 440 мкмоль/л (0,04 – 0,05 г/л).

Гіперурікемія – зростання концентрації сечової кислоти в крові, гіперурикурія (гіперуратурія) – збільшення вмісту сечової кислоти в сечі. Гіперурикемія супроводжує подагру – захворювання, що виникає за умов преципітації уратів у тканинах, першою чергою, у суглобах. Сечова кислота та її солі надзвичайно погано розчиняються у воді, їх концентрація в рідинах організму за умов норми наближена до межі розчинності. Для лікування подагри використовують препарати, що гальмують утворення сечової кислоти (алопуринол) або стимулюють виведення її нирками (антуран, цинхофен). У хворих на подагру концентрація сечової кислоти у крові майже завжди перевищує 0,075 – 0,080 г/л, а під час утворення подагричних ущільнень вміст її рідко буває нижчим за 0,08 – 0,09 г/л.


^ Контроль виконання лабораторної роботи

1. Для визначення сечової кислоти у крові та сечі використовують реактив…

A. Несслера

B. Фелінга

C. Міллона

D. Фоля

E. Фоліна

2. У нормі з сечею людини виділяється певна кількість сечової кислоти, а саме:

A. 170 – 500 мг/добу

B. 270 – 600 мг/добу

C. 370 – 700 мг/добу

D. 470 – 800 мг/добу

E. 570 – 900 мг/добу


3. Яким методом можна визначити рівень сечової кислоти в сечі?


4. Який вміст сечової кислоти у крові і сечі здорової дорослої людини ?


5. Похідне уридину, фторурацил, перетворюється в клітині на фтордезоксіуридилат – сильний незворотний інгібітор тимідилатcинтази. Як пояснити факт пригнічення фторурацилом швидкого поділу ракових клітин у експериментальних тварин?
^ Приклади тестів “Крок-1” 1. У сечі місячної дитини виявлено підвищений вміст оротової кислоти. Дитина погано набирає вагу. Які речовини потрібно використати для нормалізації метаболізму?
А. Уридин

B. Аденозин

C. Гуанозин

D.Тимідин

E. Гістидин

2. Утворення тимідилових нуклеотидів, які використовуються для біосинтезу ДНК, відбувається з дУДФ, що спершу гідролізується до дУМФ, а далі метилується. Яка сполука слугує донором метильних груп?

A. Лецитин

B. Холін

C. Метилентетрагідрофолат

D. Метіонін

E. Карнітин

3. У реакції перетворення рибози на дезоксирибозу при утворенні дезоксирибо-нуклеотидів, які використовуються для синтезу ДНК, бере участь низькомолекулярний білок тіоредоксин. Він містить дві SH-групи, що можуть переходити в окиснену форму. Який коензим використовується для відновлення тіоредоксину?

А. Коензим Q

B. ПАЛФ

C. НАДФН

D. НАДН

E. АМФ

4. Чоловіка віком 60 років прооперували з приводу раку простати. Через 2 місяці йому призначили курс хіміотерапії. До комплексу лікарських препаратів входив 5-фтордезоксіуридин – інгібітор тимідилатсинтази. Синтез насамперед якої речовини блокується під дією цього препарату?

А. іРНК

B. рРНК

C. тРНК

D. ДНК

E. Білка
^ Індивідуальна самостійна робота студентів
Роль аденілових нуклеотидів у регуляції активності ензимів.
Література
Основна:

Губський Ю.І.. Біологічна хімія. Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 270 – 283.

Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – С. 448 – 462.

Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Біохімічні показники у нормі і при патології. Навчальний довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 320 c.

Практикум з біологічної хімії. / За ред. О.Я.Склярова . – К.: Здоров’я, 2002. – 180 – 189 с.

Додаткова:

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина, 1998. – С. 469 – 508.

Клінічна біохімія / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2006. – 432 с.

Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. - М.: Мир, 2000. – С. 188-193.

Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. - М.: Мир, 1993. – Т.2.- С.15 – 34.

Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Особливості обміну речовин у дітей. – Чернівці: БДМА, 2003. - С.18-25.

Робак Т. Застосування нових аналогів пуринів в лікуванні хронічної лейкемії. (Огляд). // Укр. мед. часопис. – 1998. – №3 (5). – С. 33 – 38.


Змістовий модуль 13. Основи молекулярної генетики.


Тема № 2. Дослідження реплікації ДНК і транскрипції РНК. Біосинтез білка. Аналіз механізмів мутацій.

Мета заняття. Знати закономірності матричного синтезу нуклеїнових кислот, етапи цих процесів, механізми мутацій, репарацій, виникнення і розвитку спадкових захворювань. Вміти кількісно визначати вміст ДНК у біологічному матеріалі.

Знати загальні закономірності синтезу білків, етапи цього процесу, можливі механізми виникнення та розвитку спадкових захворювань. Засвоїти механізм дії антибіотиків та інших інгібіторів синтезу білків.

^ Актуальність теми. У процесі біосинтезу нуклеїнових кислот можливі різноманітні порушення нуклеотидної послідовності під впливом фізичних (нагрівання, іонізуючі, корпускулярні опромінення), хімічних (мутагени) та біологічних (віруси) факторів.

У медичній практиці широко використовують фармацевтичні препарати, що інгібують біосинтез нуклеїнових кислот і білків у прокаріотичних організмах і гальмують поділ клітин пухлин у онкологічних хворих; активують процеси синтезу нуклеїнових кислот і білків.

При вивченні даної теми важливо акцентувати увагу на сучасних досягненнях генної інженерії, у тому числі клонуванні генів, що важливо для синтезу біологічно активних речовин, діагностики багатьох захворювань, ідентифікації біологічного матеріалу.

^ Конкретні завдання.

Оволодіти методом кількісного визначення ДНК в біологічному матеріалі.

Трактувати молекулярно-біологічні закономірності збереження та передачі генетичної інформації, роль ферментних систем, що забезпечують напівконсервативний механізм реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

Аналізувати наслідки геномних, хромосомних і генних мутацій, механізми дії найпоширеніших мутагенів, біологічне значення та механізми репарації ДНК (репарація УФ-індукованих генних мутацій).

Пояснювати механізми функціонування ферментної системи транскрипції РНК.

Пояснювати механізми функціонування білоксинтезуючої системи за участю ферментів активації амінокислот, ініціації, елонгації та термінації біосинтезу поліпептидних ланцюгів.

Пояснювати біохімічні процеси посттрансляційної модифікації пептидних ланцюгів.

Пояснювати вплив фізіологічно активних сполук й антибіотиків на процеси реплікації, транскрипції та трансляції.

Трактувати механізми регуляції експресії генів на рівні транскрипції оперонів, які включають структурні та регуляторні гени, промотор та оператор.

Трактувати біохімічні механізми генетичних рекомбінацій, ампліфікації генів, особливості регуляції експресії генів у еукаріотів.

Пояснювати біохімічні та молекулярно-біологічні принципи методів генної інженерії, технології рекомбінантних ДНК, трансплантації генів та отримання гібридних молекул ДНК.

Пояснювати принципи клонування генів з метою отримання біотехнологічних лікарських засобів.


Теоретичні питання

Реплікація ДНК: біологічне значення, напівконсервативний механізм реплікації.

Послідовність етапів та ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

Транскрипція РНК: РНК-полімерази прокаріотів та еукаріотів, сигнали транскрипції (промоторні, ініціаторні та термінаторні ділянки генома).

Процесинг – посттранскрипційна модифікація новосинтезованих мРНК.

Транспортні тРНК та активація амінокислот. Аміноацил-тРНК-синтетази.

Етапи та механізми трансляція (біосинтезу білка) в рибосомах: ініціація, елонгація та термінація.

Посттрансляційна модифікація пептидних ланцюгів. Регуляція трансляції.

Інгібітори транскрипції та трансляції у прокаріотів та еукаріотів: антибіотики та інтерферони – їх застосування в медицині; дифтерійний токсин.

Регуляція експресії генів прокаріотів: регуляторні та структурні ділянки лактозного (Lac-) оперону (регуляторний ген, промотор, оператор).

Генні (точкові) мутації: роль у виникненні ензимопатій і спадкових хвороб людини. Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів.


^ Практична робота

Дослід 1. Визначення ДНК за фосфором.

Принцип методу. Метод ґрунтується на отриманні вільних нуклеїнових кислот із наступним визначенням кількості ДНК за фосфором, що утворюється у формі фосфату після мінералізації (спалювання) ДНК. Визначення фосфору проводять фотоколориметрично за реакцією з амонію молібдатом за присутності відновника (аскорбінова кислота). Інтенсивність забарвлення продукту реакції – молібденової сині – є пропорційною кількості фосфору у пробі.

^ Матеріальне забезпечення: тканина печінки щурів, 1 н розчин натрію гідроксиду (NaOH), 30 % розчин натрію гідроксиду (NaOH), насичений розчин натрію хлориду (NaCl), 20 % розчин ацетатної кислоти (CH3COOH), етиловий спирт, 5 % розчин ТХАК, концентрована сульфатна кислота (H2SO4), 30 % розчин гідрогену пероксиду (Н2О2), стандартний розчин калію дигідрогенфосфату (КН2РО4) 0,01 мг/мл, 2,5 % розчин амонію молібдату ((NH4)2MoO4), 1 % розчин аскорбінової кислоти, центрифуга, ФЕК, пробірки центрифужні, скляні палички, колба К’єльдаля, конічна колба, льодяна баня, пісочна баня.

^ Хід роботи.

1. Обробка тканин основою: наважку тканини печінки масою 100 мг нагрівають з 1 мл 1 н розчину натрію гідроксиду у центрифужній пробірці впродовж 15 хв на киплячій водяній бані. Періодично вміст пробірки перемішують скляною паличкою.

^ 2. Послідовне осадження білків і ДНК: пробу поступово охолоджують за кімнатної температури, а потім за температури 0°С (лід). До охолодженого гідролізату додають 0,5 мл насиченого розчину натрію хлориду у 20 % розчині ацетатної кислоти для осадження білків. Осаджений білок видаляють через 5 хв шляхом центрифугування впродовж 5 хв і швидкістю 5 000 об/хв. Центрифугат зливають у центрифужну пробірку (під час охолодження на льоду), додають до нього 6 мл етилового спирту і витримують впродовж 1 год на холоді для повного осадження ДНК. Ще раз центрифугують впродовж 5 хв і швидкістю 5000 об./хв. Осад ДНК відмивають 5 мл 5 % розчину ТХАК.

^ 3. Визначення ДНК за фосфором: осад ДНК кількісно переносять у колбу К’єльдаля, додають 1,5 мл сульфатної концентрованої кислотиі нагрівають (мінералізують) на пісочній бані до повного освітлення розчину. Для прискорення мінералізації до розчину обережно додають декілька крапель 30 % розчину гідрогену пероксиду (по одній краплі). Після закінчення мінералізації рідину з колби К’єльдаля кількісно (вимірюючи об’єм) переносять у колбу Ерленмеєра. Розчин нейтралізують 30 % розчином натрію гідроксиду за допомогою універсального індикатора. Отриманий мінералізат переносять кількісно у мірну колбу на 50 мл і доводять до позначки дистильованою водою. З колби у пробірку відбирають 5 мл розчину, додають 0,5 мл 2,5 % розчину амонію молібдату, 0,5 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і 4 мл дистильованої води. Через 10 хв вимірюють оптичну густину розчину проти води за червоного світлофільтра (довжина хвилі 670 нм) у кюветах завтовшки 5 мм. Вміст фосфору визначають у мікрограмах за калібрувальною кривою.

Для побудови калібрувального графіка використовують стандартні розчини калію дигідрогенфосфату, які містять відповідно 1, 2, 3, 4 мкг фосфору в 1 мл проби. На осі абсцис відкладають значення концентрацій стандартних розчинів, а на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини. Вміст ДНК визначають у мг% за формулою:

С = а × 10,

де: С – вміст ДНК (мг %),

а – концентрація фосфору (мкг/мл),

10 – коефіцієнт перерахунку.

Вміст ДНК у печінці щурів за умов норми становить 25 – 35 мг на 100 г.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

^ Клініко–діагностичне та практичне значення. Визначення кількості ДНК у тканинах пухлини використовують для оцінки прогнозу онкологічних захворювань та можливої індивідуалізації наступного лікування. Крім того, виділяють ДНК з клінічних зразків (біоптати тканин, крапля крові, сперма, слиз жіночих статевих органів, осад сечі, волосся людини, зішкреби епітеліальних клітин тощо) для ланцюгової полімеразної реакції (ЛПР) в діагностиці вірусних та спадкових хвороб людини, ідентифікації особини (ДНК–діагностика) тощо.

При доклінічному експериментальному дослідженні новостворених фармпрепаратів вивчають їх безпосередній вплив як на клітинні органели (ядро, мітохондрії тощо), так і їх компоненти. Тому, в разі отримання субклітинних фракцій клітин, необхідний суворий контроль за їх чистотою і гомогенністю. Однією з головних причин забруднення цитоплазматичних фракцій ядерним матеріалом (а саме, ДНК) є неякісна гомогенізація, що призводить до руйнування ядер. Для оцінки чистоти отриманих цитоплазматичних фракцій у них кількісно визначають ДНК.


^ Контроль виконання лабораторної роботи

З мінералізатом ДНК провели реакцію з розчином амонію молібдату і отримали позитивну реакцію – молібденову синь. Який складник ДНК дає позитивну реакцію?

А. Пуринові основи

В. Піримідинові основи

С. Пуринові нуклеозиди

D. Піримідинові нуклеозиди

Е. Фосфатні залишки

Який принцип визначення ДНК за фосфором?




Яке клініко-діагностичне значення визначення ДНК у біоптатах?


4. У сучасних біохімічних дослідженнях для діагностики спадкових захворювань, виявлення присутності в організмі певних вірусів (в тому числі ВІЛ), ідентифікації особини (генна дактилоскопія у судовій медицині) використовують так звану “ДНК–діагностику”. На якому методі базується ця діагностика?

А. Електрофорез

В. Хроматографія

С. Електронна мікроскопія

D. Рентгеноструктурний аналіз

E. Ланцюгова полімеразна реакція

5. Після тривалої, виснажливої хвороби і оперативного втручання у пацієнта спостерігається різка втрата маси тіла і затримка процесу одужування. Лікар призначив йому анаболічний препарат. Який біохімічний процес стимулюють такі препарати?


6. На чому ґрунтується полімеразна ланцюгова реакція?


7. Яке клініко-діагностичне та практичне значення ПЛР як методу експрес-діагностики?


Приклади тестів „ Крок–1”

1. Із нітратів, нітритів і нітрозамінів в організмі утворюється азотиста кислота, яка зумовлює окисне дезамінування азотистих основ нуклеотидів. Це може призвести до точкової мутації – заміни цитозину на:

А. Тимін

В. Урацил

С. Аденін

D. Гуанін

E. Інозин

2. У пацієнта діагностовано СНІД. У його лейкоцити потрапила РНК вірусу СНІДу, де за участі ферменту ревертази розпочався синтез вірусної ДНК. Що лежить в основі цього процесу?

A. Зворотна транскрипція

B. Зворотна трансляція

C. Репресія оперону

D. Конваріантна реплікація

E. Дерепресія оперону

3. Для лікування урогенітальних інфекцій використовують хінолони – інгібітори ензиму ДНК-гірази. Який процес порушується під дією хінолонів насамперед?

А. Ампліфікація генів

В. Реплікація

С. Зворотна транскрипція

D. Репарація

E. Рекомбінація генів

4. В організм людини потрапили іони ртуті. Це призвело до збільшення частоти транскрипції гена, необхідного для детоксикації важких металів. Ампліфікація гена якого білка лежить в основі цього процесу?

А. Металотіонеїну

B. Церулоплазміну

С. Інтерферону

D. Трансферину

E. Феритину

5. Пацієнтові, що проживає на специфічній геохімічній території, встановлено діагноз – ендемічний зоб. Який вид посттрансляційної модифікації тиреоглобуліну порушений в організмі хворого?

А. Фосфорилування

В. Метилування

С. Ацетилування

D. Йодування

Е. Глікозилування


Індивідуальна самостійна робота студентів

Молекулярна організація ДНК еукаріотів (екзони, інтрони; послідовності, що повторюються). Ядерний хроматин та хромосоми еукаріотів; каріотип людини.

Генетичні рекомбінації геному прокаріотів (трансформація, трансдукція, кон’югація). Процеси рекомбінації у еукаріотів на прикладі утворення генів H– та L–ланцюгів молекул імуноглобулінів.

Генна інженерія або технологія рекомбінантних ДНК: загальні поняття, біомедичне значення. Технологія трансплантації генів та отримання гібридних молекул ДНК. Клонування генів з метою отримання біотехнологічних лікарських засобів та діагностикумів (гормонів, ферментів, антибіотиків, інтерферонів та ін.).

Ланцюгова полімеразна реакція; її біомедичне застосування в діагностиці інфекційних і спадкових хвороб людини, ідентифікації особини (ДНК–діагностика).

Біологічне значення та механізми репарації ДНК. Репарація УФ-індукованих генних мутацій: пігментна ксеродерма.


Література

Основна:

Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 469 – 544.

Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2001. – С. 448 – 506.

Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Біохімічні показники у нормі і при патології. Навчальний довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 320 c.

Клінічна біохімія: Підручник / Д.П.Бойків, Т.І.Бондарчук, О.Л.Іванків та ін. За ред. О.Я Склярова. - К.:Медичина, 2006. – 432 с.

Додаткова:

Баранов В.С. Генная терапия – медицина ХХІ века // Соросовский образовательный журнал. – 1999. – № 3. – С. 63 – 68.

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 469 – 498, 511 – 544.

Жиравецький М.І. Методи детекції нуклеїнових кислот в діагностиці статевих трансмісивних хвороб // Лаб. діагностика. – 2001. – № 1. – С. 28 – 34.

Кінах М.В., Луцик Б.Д., Захарія К.А. Лабораторна діагностика захворювань, які передаються статевим шляхом. – Львів, 2004. – 176 с.

Кольман Я., Рем К. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – С. 234 – 259.

Поцелуева Л.А. Место нуклеазной активности в противовирусной защите (обзор) // Казанский медицинский журнал. – 1995. – т. 76. – № 3. – С. 231 – 233.

Романенко В.М., Свистунов І.В., Лавниненко О.О. Полімеразна ланцюгова реакція: принципи, досягнення,перспективи використання у діагностиці урогенітальних інфекцій // Лаб. діагностика. – 1998. – № 4 (6). – С. 45 – 52.


Змістовий модуль 14. Молекулярні механізми дії гормонів білкової природи на клітини-мішені. Регуляція метаболізму.


Тема 3. Дослідження молекулярно-клітинних механізмів дії гормонів білкової природи на клітини-мішені.

^ Мета заняття. Вивчити біохімічні та фізіологічні функції гормонів і біорегуляторів у системі міжклітинної інтеграції життєдіяльності організму людини. Знати структуру гормонів білково-пептидної природи, похідних амінокислот та стероїдних гормонів, їх функції, механізми дії на клітини-мішені. Знати молекулярні механізми дії гормонів білково-пептидної природи та похідних амінокислот (катехоламінів) на клітини-мішені за участі сигнальних молекул-посередників. Засвоїти методи якісного визначення інсуліну, адреналіну та тироксину в біологічних рідинах.

^ Актуальність теми. Вивчення молекулярно-клітинних механізмів дії гормонів необхідне студентам для розуміння ролі ендокринної системи у регуляції метаболічних процесів всередині клітин. Розуміння біохімічних механізмів реалізації впливу гормонів на активність внутрішньоклітинних систем дозволяє пояснити причини, які лежать в основі патологічних станів, викликаних розладами у функціонуванні ендокринних залоз та клітин-мішеней, а також формує у студентів підходи до корекції гіпо- або гіперфункцій залоз внутрішньої секреції.

^ Конкретні завдання.

Трактувати роль гормонів та біорегуляторів місцевої дії у системі міжклітинної інтеграції.

Пояснювати механізм дії гормонів на клітини-мішені у залежності від їх структури.

Трактувати дію гормонів білково-пептидної природи та похідних амінокислот (катехоламіни) на клітини-мішені за участі сигнальних внутрішньоклітинних посередників.

Аналізувати зміни обміну речовин та біохімічних показників, які характеризують обмін вуглеводів, білків і ліпідів при порушеннях функціонування ендокринних залоз та узагальнювати прогностичну оцінку цих порушень.



^ Теоретичні питання
Гормони: загальна характеристика; роль гормонів та інших біорегуляторів у системі міжклітинної інтеграції функцій організму людини.

Класифікація гормонів та біорегуляторів; відповідність структури та механізмів дії гормонів.

Реакція клітин-мішеней на дію гормонів. Мембранні (іонотропні, метаботропні) та цитозольні рецептори.

Біохімічні системи внутрішньоклітинної передачі гормональних сигналів: G-білки, вторинні посередники (цАМФ, Ca2+/кальмодулін, ІФ3, ДАГ, протеїнкінази С, А), їх роль.

Гормони гіпоталамуса – ліберини та статини. Функціональний зв'язок між гіпоталамусом і гіпофізом.

Гормони передньої частки гіпофіза: соматотропін (СТГ), пролактин. Патологічні процеси, пов’язані з порушенням функції цих гормонів.

Гормони задньої частки гіпофіза. Вазопресин та окситоцин: будова, біологічні функції.

Гормони підшлункової залози. Інсулін – будова, біосинтез та секреція; вплив на обмін вуглеводів, ліпідів, амінокислот та білків. Рістстимулівні ефекти інсуліну.

Глюкагон. Хімічна природа та біологічна дія гормону.

Катехоламіни (адреналін, норадреналін, дофамін): будова, біосинтез, біологічні ефекти, біохімічні механізми дії.
^ Практична робота І. Якісні реакції на інсулін.
Дослід 1. Біуретова реакція.

Принцип методу. За хімічною природою інсулін – простий білок, який у лужному середовищі реагує з купруму сульфатом, при цьому утворюються сполуки, забарвлені у фіолетовий колір.

^ Матеріальне забезпечення: 10 % розчин NaOH, СuSO4, інсулін.

Хід роботи. До 10 крапель інсуліну додають 5 крапель 10 % розчину NaOH і краплю розчину CuSO4. Рідина забарвлюється у фіолетовий колір.

Зробити висновок.


Дослід 2. Реакція Фоля.

Принцип методу. Сірковмісні амінокислоти, особливо цистеїн і цистин, при кип’ятінні з лугом втрачають сірку, яка відщеплюється у вигляді сірководню. Сірководень, взаємодіючи з лугом, утворює сульфіди, які можна виявити при додаванні плюмбуму ацетату (реактиву Фоля). Сульфіди утворюють з ним коричневий або чорний осад плюмбуму сульфіду.

^ Матеріальне забезпечення: реактив Фоля, інсулін.

Хід роботи. До 5 крапель інсуліну додають 5 крапель реактиву Фоля і кип’ятять. Через 1 – 2 хвилини після відстоювання утворюється бурий або чорний осад сульфіду свинцю.

Зробити висновок.

^ ІІ. Якісні та кількісні реакц