Реферат: Обеспечение безопасности при работе с рекомбинантными молекулами ДНК
РЕФЕРАТ ПО ДИСЦИПЛИНЕ
" ОХРАНА ТРУДА "
ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С РЕКОМБИНАНТНЫМИМОЛЕКУЛАМИ ДНК
Студент IV курса
биолого-почвенного факультета
кафедры биохимии
Попов Н. Б.
1998
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Студенты кафедры биохимии для исследовательскойработы направляются в различные научно-исследовательские институты, а такжемогут заниматься в лабораториях кафедры. Моя работа проходит в лаборатории«Регуляция экспрессии генов» Института Цитологии РАН. Непосредственномоя научная деятельность не связана с животными и в основном мне приходитсяиметь дело с культурами клеток млекопитающих или бактериальных клеток. Большуюже часть времени отводится на работу с еще более мелкими объектами — молекуламинуклеиновых кислот и белков. Исследования нашей группы связаны с изучением ролипродукта гена ретинобластомы (pRb) в регуляции клеточного цикла. Большинствоклеток на том или ином этапе своего развития претерпевают деление, т.е.проходят через фазы клеточного цикла. Впервые белок pRb был описан в связи смутацией кодирующего его гена в трансформированных (т.е. ставшихзлокачественными) клетках сетчатки глаза. Именно с отсутствием данного белкасвязаны опухоли этой ткани (ретинобластомы), а также, как выяснилосьвпоследствии, и других тканей. Белок pRb экспрессируется у всех эукариотическихорганизмов — от дрожжей до человека и у всех выполняет роль супрессора(негативного регулятора) клеточного цикла. Именно поэтому мы считаем, чтоизучение закономерностей в клеточном цикле, рассмотрение механизмов егорегуляции и представляет собой очень важную и интересную область клеточнойбиологии.
В своей научной работе мы используем самые разныеинструменты и методы исследования — от световой микроскопии до радиоактивныхизотопов. Находят применение также различные электрические приборы ивычислительные машины — от калькулятора до компьютеров. Непосредственно мояработа связана, как правило, с получением рекомбинантных молекул ДНК ипоследующим использования их в разнообразных целях.
Необходимо отметить, что администрацией ИнститутаЦитологии предусмотрены правила безопасной работы с рекомбинантными молекуламДНК. Эти правила включают меры безопасности и физические меры защиты.
Меры безопасности слагаются из приемов стандартноймикробиологической практики, физической и биологической защиты. В соответствиис правилами к работе с рекомбинантными ДНК допускаются лица, прошедшиемедицинский осмотр и получившие подготовку, которая предусматривает знаниеоснов биологии организмов, с которыми предстоит работать, и приемов работы сними. Подготовка должна быть подтверждена документально.
Физические меры защиты разделяются на несколькоуровней.
Минимальный уровень (Ф1)
Эксперименты, требующие физической защиты первогоуровня, могут проводится в лаборатории, предназначенной для работы смикроорганизмами ряда Escherichia (штамм E. Coli K-12) с помощью известных иобщепринятых микробиологических методов. Работа проводится на открытыхповерхностях без специального защитного оборудования. В лаборатории должнаподдерживаться строгая чистота. Прием и хранение пищи, курение в этом помещениизапрещены. Следует использовать для работы только механические пипетки. Влаборатории Ф1 проводят все эксперименты по клонированию фрагментов ДНКпрокариотического и эукариотического направления.
Низкий уровень (Ф2)
Эксперименты, в которых необходима физическаязащита вторго уровня, могут проводится в помещениях, подобных лаборатории Ф1,однако доступ посторонних лиц в лабораторию ограничивается. Автоклав (паровойстерилизатор) устанавливается в том же здании, где расположена лаборатория.Рекомендуется использование боксов с ламинарным потоком воздуха и другиеустройства физической защиты, сводящие к минимуму опасность утечки материалов.Использованные в опыте материалы, содержащие микроорганизмы, обеззараживаются.Во время работы на двери лаборатории вывешивается знак биологической опасности.Применяются все приемы, обязательные для Ф1. В лаборатории Ф2 проводятсяэксперименты по манипуляции с генами животных и человека, могущих нестипотенциальную биологическую опасность (в том числе с онкогенами на основеклеток E. Coli K-12 и векторов типа pBR322, pUC и др.).
Средний уровень (Ф3)
Эксперименты, требующие физической защиты третьегоуровня, проводятся в лаборатории, имеющей специальные инженерные конструкции изащитное оборудование, а также автономное оборудование: автоклав, СО2инкубатор, центрифуги, термостаты. Лаборатория отделяется от других помещенийдверями с блокировкой, обеспечивающими герметичность. Поверхности стен, полов,столов и потолков должны тщательно очищаться и деконтаминироваться. Внутрилаборатории создается отрицательное давление. Воздух из лаборатории поступаетза ее пределы по самостоятельным воздуховодам после предварительной очистки нафильтрах. Работы, проводимые в лаборатории Ф3 включают эксперименты на клеткахживотных и человека, трансформированных онкогенами и ретровирусами, содержащимиразличные гены, в том числе онкогены. На дверях лаборатории, оборудовании иматериалах устанавливается знак биологической опасности.
Вход в лабораторию Ф3 разрешается только тем лицам,чье присутствие предусмотрено программой исследований и утверждено комиссиейинститута по рекомбинантным ДНК.
Работающие должны пользоваться средствамииндивидуальной защиты в соответствии с нормами их бесплатной выдачи.
Непосредственно после работы рабочие поверхностибоксов и другого оборудования обеззараживаются, стеклянная посуда стерилизуетсянепосредственно в лаборатории.
Высокий уровень Ф4 — в Институте Цитологии РАН непредусматривается.
УСЛОВИЯ ТРУДА ВО ВРЕМЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ОБОРУДОВАНИЕ
Для выполнения научной работы я пользуюсь следующимоборудованием:
— термостат (температура до 85С)
— настольная микроцентрифуга (максимальная скорость- 12000 об/мин)
— центрифуги К-23 и К-24 (максимальная скорость — 15000 об/мин)
— камеры для проведения гель-электрофореза
— трансиллюминатор
— аппарат для блоттинга
— электрическая плитка
Регистрация результатов проводится с помощьютраниллюминатора, обычных ламп накаливания и фотоаппарата. В связи с этим,определенная часть рабочего времени проходит в фотокомнатах.
Трансиллюминатор представляет собой прибор,состоящей из ламп, испускающих ультрафиолетовый свет и кварцевого стекла (такоестекло используется, поскольку оно пропускает ультрафиолетовые лучи). Так какизлучение в ультрафиолетовом диапазоне является небезопасным для глаза, тонаблюдение ведется только в специальных очках, приспособленных для этих целей.Ультрафиолетовый свет применяется с целью детекции фрагментов ДНК, разделенныхв агарозном геле и связанных со специальным красителем — бромистым этидием,который поглощает свет в указанном диапазоне. Благодаря этому становитсявозможным наблюдение фрагментов ДНК и определение их размеров, а такжеполучение их в препаративных количествах для последующего использования.
Камеры для электрофореза представляют собой емкостиопределенной конфигурации, в которые помещается гель, а затем заливается буфер,содержащий заряженные подвижные частицы — ионы. Благодаря такой конструкцииобеспечивается подвижность фрагментов нуклеиновых кислот или белков в гелях иих разделение из смеси. Разделение проводится при силе тока до 50 мА инапряжении до 100 V.
Устройство для переноса (блоттинга) состоит из двухплатиновых пластин, помещенных в изолирующую камеру. Параметры электрическоготока при переносе не превосходят указанных для гель-электрофореза.
Используется термостаты двух типов — воздушный иводяной. Температура в воздушном термостате не превышает 37С, а в водяном — 85С.
Работы проводятся на лабораторном столе.Применяется искусственное освещение рабочей зоны бытовыми лампами накаливаниямощностью 100 W. При обработке полученных в ходе исследований данных используется персональный компьютер.
Следует отметить, что поскольку различноеоборудование, использующееся в работе, в силу своих естественных габаритов ифункционального назначения располагается на различных этажах здания института.Поэтому весьма часто рабочая зона принимает довольно внушительные размеры (с1-го по 3-ий этаж). Особенно большие неудобства это причиняет, когда в целяхэкономии электроэнергии, лифты обесточивают, начиная с 16 часов, что позволяетотнести работу в это время к категории IIб. В остальное время работа относится,по всей видимости, к категории легких.
СХЕМА ПОМЕЩЕНИЙ
ВРЕДНЫЕ ФАКТОРЫ
ЭЛЕКТРИЧЕСКИЙ ТОК
В своей работе мы используем разнообразные приборы,которые питаются от электросети. Гель-электрофорез проводится при силе тока до50 мА и напряжении до 100 V. Все контакты при этом надежно изолированы.Проводящие ток поверхности присутствуют только в аппарате для переноса(блоттинга), однако они заключены в изолирующую камеру, исключающую контакт сней во время блоттинга.
ИОНИЗИРУЮЩИЕ И ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ ИЗЛУЧЕНИЯ
Источником таких излучений является мониторперсонального компьютера. В принципе он излучает электромагнитные волнысверхнизкой частоты, мягкое рентгеновское излучение. Однако монитор, внастоящее время использующийся в нашей лаборатории обладает низкойинтенсивностью излучения и соответствует международному стандарту (LR — «Low Radiation»). Кроме того, время непрерывной работы с компьютеромне превышает, как правило, одного часа.
ОСВЕЩЕНИЕ
При работе с компьютером для повышения контрастаизображения и устранения бликов экрана используется экранный фильтр. Крометого, монитор поддерживает режим построчной развертки «NI» истабилизации изображения для снижения утомляемости глаз во время работы.
По нормативам СНиП II-4-79 минимальная освещенностьрабочей поверхности в данном случае должна быть 300-400 лк при комбинированномосвещении. В помещении для общих работ освещение создается пятью верхнимилюстрами по 2 лампы дневного света каждая и настольными лампами на гибкихдержателях, позволяющих направлять свет в нужную точку стола. Данная системаявляется вполне адекватной и рациональной.
ШУМЫ, ЗВУКИ И ВИБРАЦИЯ
Основными источниками шумов и вибраций являютсяцентрифуги и шейкеры. Центрифуги К-23 и К-24 находятся в специальном помещении,изолированном и допускающем лишь кратковременное нахождение людей. Что касаетсямикроцентрифуги, то она используется, в основном, в изолированном помещении спостоянной температурой от 4 до 8С («холодная комната»). То жекасается и шейкеров, с той оговоркой, что их приходится применять столь жечасто и в изолированном помещении с температурой 37С.
ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Химические вещества представляют собой источникнаибольшей опасности при работе в нашей лаборатории. Для своей деятельности яиспользую следующие ядовитые вещества: щелочи (NaOH и KOH) и кислоты (HCl иH3РO4), хлороформ, метанол, фенол, уже упоминавшийся бромистый этидий и другие.
Метанол — сильный, преимущественно нервный исосудистый яд. В организм человека может поступать через дыхательные органы,желудочно-кишечный тракт и неповрежденную кожу.
Щелочи и кислоты при воздействии на организмчеловека вызывают:
— раздражение слизистых оболочек глаз и верхнихдыхательных путей
— дерматиты, экземы
— коагуляционный некроз тканевых белков
— поражение глаз (возможна полная потеря зрения)
— поражение печени, почек, желудочно-кишечноготракта, сердечно-сосудистой системы, легких
Степень поражения зависит от концентрации, температурыи времени воздействия. Фенол является высокотоксичным веществом и припопадании на кожу вызывает ожоги. Вдыхание паров фенола даже в очень небольшихконцентрациях сопровождается раздражением и при больших дозах — поражениемслизистых оболочек глаз, носа, зева и т.д., а также дыхательных путей илегких.
Бромистый этидий обладает сильным мутагеннымдействием.
Следует отметить, что далеко не всегда полностьюсоблюдаются правила работы с каждым из этих веществ. Связано это не спренебрежением правилами, а с фактической невозможностью их выполнения.Например, метанол должен отпускаться со склада в лабораторию в количестве, непревышающем суточной потребности. Это требование, к сожалению, не может бытьудовлетворено в связи с затруднениями при получении веществ со склада(постоянной их нехваткой и т.д.), а также с самим режимом работы склада(получение веществ со склада требует предварительного оформления идолговременного ожидания).
Тем не менее, работа с указанными веществамипроводится в вытяжном шкафу и в перчатках и с соблюдением всех мерпредосторожности. Вещества, которые не требуют хранения при низкой температуре(щелочи, кислоты и др.), хранятся также в вытяжном шкафу.
МИКРОКЛИМАТ
Исследования я провожу в холодный и переходныйпериоды года, поэтому нормой в данном случае являются условия: температуравоздуха на постоянном рабочем месте — 16-21С, скорость движения воздуха неболее 0,2 м/с, температура воздуха вне рабочего места — 14-20 °С. В зданиидействует централизованное паровое отопление, однако из-за малой мощностифактически не выполняется ни одна температурная норма даже после тщательногооклеивания окон. Здание Института Цитологии в зимнее время отапливается, однаков связи со своеобразной конструкцией или по другим неизвестным причинам,температура в комнате зимой бывает равной 12-15С.
Предпринимаемые меры по нормализации обстановки сядовитыми
химическими веществами и микроклимата:
Для увеличения безопасности работы с ядовитымивеществами, они хранятся в специально отведенном для этой цели шкафу вподсобном помещении, которое надежно закрывается и пребывание людей в которомограничено.
Для более безопасной работы с бромистым этидием, онне добавляется в буфер для электрофоретического разделения, а включается всостав геля, что значительно уменьшает объем загрязненного вещества и облегчаетего элиминацию.
Аналогично, для переноса (блоттинга) белков намембрану из нитроцеллюлозы, в настоящее время используется метод«полусухого» переноса, для которого требуется очень небольшоеколичество буфера (по сравнению с традиционными методами), в состав котороговходит метанол; кроме того перенос этим методом занимает значительно меньшевремени. Это также способствует уменьшению контакта сотрудников с ядовитымивеществами и снижению вредных отходов при удалении использованного вещества.
Для повышения температуры на рабочем месте холодныйпериод нами применятся электронагреватели рефлекторного типа. Это, конечно,повышает пожароопасность, но другого выхода в наших условиях не остается, и наэто идут, обращая при этом повышенное внимание на пожарную безопасность. Подостижении в комнате температуры, соответствующей комфортному климату, приборывыключаются. Последний уходящий в конце рабочего дня отключает групповые щиткирозеток и оставляет запись в журнале дежурного по комнате.
ЛИТЕРАТУРА
Милохов В.В., Егоров Е.М., Аксенов А.А. Охрана труда:Учебное
пособие.- Л: Изд-во Ленинградского университета,1983. 112 с.
Правила безопасной работы с рекомбинантнымимолекулами ДНК
Инструкция #1 по охране труда при получении,хранении и выдаче метанола
в подразделениях Института Цитологии РАН
Инструкция #3 по технике безопасности при работе сорганическими веществами
Инструкция #12 по технике безопасности припроведении работ с
использованием кислот и щелочей в подразделенияхИнститута Цитологии РАН
9